Ip－10抗体及其用途的制作方法

专利名称：Ip－10抗体及其用途的制作方法
相关申请本申请要求2003年12月10日提交的美国临时专利申请60/529,180号的优先权。上述申请的全部内容在此引用作为参考。
背景技术：
干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)(也称为CXCL10)是一种10kDa的趋化因子，最早是根据IP-10基因在干扰素γ(IFN-γ)处理的细胞中表达而鉴定的(Luster，A.D.等(1985)Nature 315672-676)。IP-10显示与具有趋化活性的蛋白质如血小板因子4和β-血小板球蛋白以及与具有有丝分裂原活性的蛋白质如结缔组织活化肽III具有同源性(Luster，A.D.等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842868-2871)。多种细胞，包括内皮细胞、单核细胞、成纤维细胞和角质形成细胞，响应IFN-γ分泌IP-10(Luster，A.D.和Ravetch，J.V.(1987)J.Exp.Med.1661084-1097)。也已经证明在人皮肤的迟发型超敏反应性(DTH)应答中，IP-10存在于真皮巨噬细胞和内皮细胞中(Kaplan，G.等(1987)J.Exp.Med.1661098-1108)。尽管最初是根据其被IFN-γ诱导而鉴定的，但是IP-10也可以被IFN-α诱导，例如在树突细胞中(Padovan，E.等(2002)J.Leukoc.Biol.71669-676)。IP-10表达也可以在中枢神经系统的细胞如星形胶质细胞和小胶质细胞中由刺激物如IFN-γ、病毒和脂多糖诱导(Vanguri，R.和Farber，J.M.(1994)J.Immunol.1521411-1418；Ren，L.Q.等(1998)Brain Res.Mol.Brain Res.59256-263)。IP-10的免疫生物学在Neville，L.F等(1997)Cytokine Growth FactorRev.8207-219中综述。
IP-10的受体已经确定为CXCR3，它是一种七跨膜的受体(Loetscher，M.等(1996)J Exp.Med.184963-969)。CXCR3已经证明在活化的T淋巴细胞上表达，但是在静息T淋巴细胞上不表达，在B淋巴细胞、单核细胞或粒细胞上也不表达(Loetscher，M.等，同上)。已经显示，通过用TGF-β1刺激，NK细胞上的CXCR3表达增量调节(Inngjerdingen，M.等(2001)Blood 97367-375)。也鉴定了CXCR3的另外两种配体MIG(Loetseher，M.等，同上)和ITAC(Cole，K.E.等(1998)J.Exp.Med.1872009-2021)。
已经证明，IP-10与CXCR3的结合介导活化T细胞中的钙动员和趋化性(Loetscher，M.等，同上)。IP-10与活化NK细胞上的CXCR3结合也诱导趋化性和细胞内钙动员(Maghazachi，A.A.等(1997)FASEB J.11765-774)。在胸腺内，IP-10是TCRαβ+CD8+T细胞、TCRγδ+T细胞和NK型细胞的化学引诱物(Romagnani，P.等(2001)Blood 97601-607)。
IP-10或其受体CXCR3已经在多种不同的炎性和自身免疫性疾病中得到鉴定，这些疾病包括多发性硬化症(参见，例如，Sorensen，T.L.等(1999)J.Clin.Invest.103807-815)，类风湿性关节炎(参见，例如，Patel，D.D.等(2001)Clin.Immunol.9839-45)，溃疡性结肠炎(参见，例如，Uguccioni，M.等(1999)Am.J.Pathol.155331-336)，肝炎(参见，例如，Narumi，S.等(1997)J.Immunol.1585536-5544)，脊髓损伤(参见，例如，McTigue，D.M.等(1998)J.Neurosci.Res.53368-376；Gonzalez等2003.Exp.Neurol.184456-463)，系统性红斑狼疮(参见，例如，Narumi，S.等(2000)Cytokine 121561-1565)，移植排斥(参见，例如，Zhang，Z.等(2002)J.Immunol.1683205-3212)，舍格伦综合征(参见，例如，Ogawa，N.等(2002)Arthritis Rheum.462730-2741)。因此，抑制该活性的治疗剂，特别是适合人用的治疗剂，是所需要的。
发明概述本发明提供与IP-10结合并且表现出许多所需性质的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。这些性质包括与人IP-10高亲和力结合，以及与恒河猴IP-10的交叉反应性，但是缺乏与人MIG、人ITAC或小鼠IP-10的实质交叉反应性。而且，该抗体抑制IP-10与其受体CXCR3的结合，抑制IP-10在受体表达细胞中诱导的钙流(calcium flux)，并且抑制IP-10诱导的细胞迁移(趋化性)。而且，本发明的抗体显示在诊断为多发性硬化症的病人的脑切片中与IP-10结合。
在本发明优选的实施方案中，人IP-10包含具有如SEQ IDNO121所示氨基酸序列[Genbank登录号NP_001556]的多肽；CXCR3包含具有如SEQ ID NO122所示氨基酸序列[Genbank登录号NP_001495]的多肽；恒河猴IP-10包含具有如SEQ ID NO123所示氨基酸序列[Genbank登录号AAK95955]的多肽；小鼠IP-10包含具有如SEQ ID NO124所示氨基酸序列[Genbank登录号NP_067249]的多肽；人MIG包含具有如SEQ ID NO125所示氨基酸序列[Genbank登录号NP_002407]的多肽；和/或人ITAC包含具有如SEQID NO126所示氨基酸序列[Genbank登录号NP_005400]的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与IP-10特异性结合，并且包含是选自下组的人VH种系基因的产物或源自该基因的重链可变区人VH3-33基因、人VH3-30.3基因、人VH5-51基因和人VH4-61基因。在另一实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与IP-10特异性结合，并且包含是选自下组的人Vk种系基因的产物或源自该基因的轻链可变区人VkA27基因、人VkL15基因、人VkL6基因和人VkL18基因。在另一实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与IP-10特异性结合，并且包含(a)选自下组的人VH种系基因的产物或源自该基因的重链可变区人VH3-33基因、人VH3-30.3基因、人VH5-51基因和人VH4-61基因；和(b)选自下组的人Vk种系基因的产物或源自该基因的轻链可变区人VkA27基因、人VkL15基因、人VkL6基因和人VkL18基因。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含(a)人VH3-33基因的产物或源自该基因的重链可变区；和(b)选自下组的人Vk基因的产物或源自该基因的轻链可变区人VkA27基因、人VkL15基因和人VkL6基因，其中该抗体与IP-10特异性结合。
在另一实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含(a)人VH3-30.3基因的产物或源自该基因的重链可变区；和(b)人VkL6基因的产物或源自该基因的轻链可变区，其中该抗体与IP-10特异性结合。
在另一实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含(a)人VH5-51基因的产物或源自该基因的重链可变区；和(b)人VkL18基因的产物或源自该基因的轻链可变区，其中该抗体与IP-10特异性结合。
在另一实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含(a)人VH4-61基因的产物或源自该基因的重链可变区；和(b)人VkA27基因的产物或源自该基因的轻链可变区，其中该抗体与IP-10特异性结合。
另一方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO24-34的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，(b)轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO73-83的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，(c)该抗体与IP-10特异性结合，且
(d)该抗体表现至少一种如下功能性质(i)该抗体抑制IP-10与CXCR3的结合；(ii)该抗体抑制IP-10诱导的钙流；(iii)该抗体抑制IP-10诱导的细胞迁移；(iv)该抗体与恒河猴IP-10交叉反应；(v)该抗体不与小鼠IP-10交叉反应；(vi)该抗体不与人MIG交叉反应；(vii)该抗体不与人ITAC交叉反应。
在一个优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ IDNO13-23的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO62-72的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO51-61的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。该抗体可以是，例如，人抗体、人源化或嵌合抗体。
另一方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中(a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO35-46的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列，(b)轻链可变区包含与选自SEQ ID NO84-94的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列，(c)该抗体与IP-10特异性结合，且(d)该抗体表现至少一种如下功能性质(i)该抗体抑制IP-10与CXCR3的结合；(ii)该抗体抑制IP-10诱导的钙流；(iii)该抗体抑制IP-10诱导的细胞迁移；(iv)该抗体与恒河猴IP-10交叉反应；(v)该抗体不与小鼠IP-10交叉反应；
(vi)该抗体不与人MIG交叉反应；(vii)该抗体不与人ITAC交叉反应。
该抗体可以是，例如，人抗体、人源化或嵌合抗体。
在本发明优选的实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含(a)包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含选自SEQ ID NO13-23的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含选自SEQ ID NO24-34的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含选自SEQ ID NO51-61的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含选自SEQ ID NO62-72的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(f)包含选自SEQ ID NO73-83的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中该抗体与IP-10特异性结合。
在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含(a)包含选自SEQ ID NO35-46的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含选自SEQ ID NO84-94的氨基酸序列的轻链可变区；其中该抗体与IP-10特异性结合。
在本发明的另一方面，提供与上述任何抗体竞争结合IP-10的抗体或其抗原结合部分。
本发明的抗体可以是，例如，如IgG1或IgG4同种型的全长抗体。或者，这些抗体可以是抗体片段，如Fab或Fab’2片段，或单链抗体。
本发明也提供一种免疫偶联物，其包含与治疗剂如细胞毒素或放射性同位素连接的本发明的抗体或其抗原结合部分。本发明也提供一种双特异性分子，其包含与第二功能部分连接的本发明的抗体或其抗原结合部分，该第二功能部分具有与该抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。
还提供包含本发明的抗体或其抗原结合部分或免疫偶联物或双特异性分子和药物可接受的载体的组合物。
本发明也包括编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含这些核酸的表达载体，和包含这些表达载体的宿主细胞。此外，本发明提供一种含有人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中该小鼠表达本发明的抗体，以及由这种小鼠制备的杂交瘤，其中该杂交瘤产生本发明的抗体。
另一方面，本发明提供一种抑制由活化T细胞或NK细胞介导的炎症或自身免疫应答的方法，包括使T细胞或NK细胞接触本发明的抗体或其抗原结合部分，从而使该炎症或自身免疫应答受到抑制。
再另一方面，本发明提供一种对需要治疗的受试者治疗炎症或自身免疫病的方法，包括向该受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，从而使该受试者的炎症或自身免疫病得到治疗。该疾病可以是，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎性肠病(例如溃疡性结肠炎、克罗恩病)、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、炎性皮肤病(例如牛皮癣、扁平苔藓)、自身免疫性甲状腺病(例如格雷夫病、桥本病)、舍格伦综合征、肺炎症(例如哮喘、慢性阻塞性肺病、肺结节病、淋巴细胞肺泡炎)、移植排斥、脊髓损伤、脑损伤(例如中风)、神经变性疾病(例如阿尔茨海默病、帕金森病)、龈炎、基因治疗诱发的炎症、血管发生疾病、炎性肾病(例如IgA肾病、膜增生性肾小球肾炎、急进性肾小球肾炎)和动脉粥样硬化。
又另一方面，本发明提供一种对需要治疗的受试者治疗与不利的IP-10活性有关的病毒或细菌感染的方法，包括向该受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，从而使该受试者的病毒或细菌感染得到治疗。例如，该抗体可以用来治疗病毒性脑膜炎、病毒性脑炎或细菌性脑膜炎。用本发明的方法治疗的病毒感染可以由例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、I型单纯疱疹病毒(HSV-1)或重度急性呼吸综合征(SARS)病毒介导。
本发明还提供根据此处提供的抗-IP-10抗体序列制备“第二代”抗-IP-10抗体的方法。例如，本发明提供制备抗-IP-10抗体的方法，包括(a)提供(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO1-12的CDR1序列、选自SEQ ID NO13-23的CDR2序列和/或选自SEQID NO24-34的CDR3序列；和(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO51-61的CDR1序列、选自SEQ ID NO62-72的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO73-83的CDR3序列；(b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，产生至少一个改变的抗体序列；和(c)使该改变的抗体序列表达为蛋白质。
本发明的其他特征和优点在下面的详述和实施例中是显而易见的，该详述和实施倒不应理解为限制性的。贯穿本申请中引用的所有参考文献、Genbank项、专利和公布的专利申请的内容均在此处清楚地引入作为参考。


图1A显示1D4人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO99)和氨基酸序列(SEQ ID NO35)。划出了CDR1(SEQ ID NO1)、CDR2(SEQ ID NO13)和CDR3(SEQ ID NO24)区，并指出了V、D和J的种系起源。
图1B显示1D4人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO110)和氨基酸序列(SEQ ID NO84)。划出了CDR1(SEQ IDNO51)、CDR2(SEQ ID NO62)和CDR3(SEQ ID NO73)区，并指出了V和J的种系起源。
图2A显示1E1人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO100)和氨基酸序列(SEQ ID NO36)。划出了CDR1(SEQ ID NO2)、CDR2(SEQ ID NO14)和CDR3(SEQ ID NO25)区，并指出了V和J的种系起源。
图2B显示1E1人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO111)和氨基酸序列(SEQ ID NO85)。划出了CDR1(SEQ IDNO52)、CDR2(SEQ ID NO63)和CDR3(SEQ ID NO74)区，并指出了V和J的种系起源。
图3A显示2G1人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO101)和氨基酸序列(SEQ ID NO37)。划出了CDR1(SEQ ID NO3)、CDR2(SEQ ID NO15)和CDR3(SEQ ID NO26)区，并指出了V和J的种系起源。
图3B显示2G1人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO112)和氨基酸序列(SEQ ID NO86)。划出了CDR1(SEQ IDNO53)、CDR2(SEQ ID NO64)和CDR3(SEQ ID NO75)区，并指出了V和J的种系起源。
图4A显示3C4人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO102)和氨基酸序列(SEQ ID NO38)。划出了CDR1(SEQ ID NO4)、CDR2(SEQ ID NO16)和CDR3(SEQ ID NO27)区，并指出了V、D和J的种系起源。
图4B显示3C4人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO113)和氨基酸序列(SEQ ID NO87)。划出了CDR1(SEQ IDNO54)、CDR2(SEQ ID NO65)和CDR3(SEQ ID NO76)区，并指出了V和J的种系起源。
图5A显示6A5人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO103)和氨基酸序列(SEQ ID NO39)。划出了CDR1(SEQ ID NO5)、CDR2(SEQ ID NO17)和CDR3(SEQ ID NO28)区，并指出了V、D和J的种系起源。
图5B显示6A5人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO114)和氨基酸序列(SEQ ID NO88)。划出了CDR1(SEQ IDNO55)、CDR2(SEQ ID NO66)和CDR3(SEQ ID NO77)区，并指出了V和J的种系起源。
图6A显示6A8人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO104)和氨基酸序列(SEQ ID NO40)。划出了CDR1(SEQ ID NO6)、CDR2(SEQ ID NO18)和CDR3(SEQ ID NO29)区，并指出了V和J的种系起源。
图6B显示6A8人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO115)和氨基酸序列(SEQ ID NO89)。划出了CDR1(SEQ IDNO56)、CDR2(SEQ ID NO67)和CDR3(SEQ ID NO78)区，并指出了V和J的种系起源。
图7A显示6B10人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO105)和氨基酸序列(SEQ ID NO41)。划出了CDR1(SEQ ID NO7)、CDR2(SEQ ID NO19)和CDR3(SEQ ID NO30)区，并指出了V、D和J的种系起源。
图7B显示6B10人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO116)和氨基酸序列(SEQ ID NO90)。划出了CDR1(SEQ IDNO57)、CDR2(SEQ ID NO68)和CDR3(SEQ ID NO79)区，并指出了V和J的种系起源。
图8A显示7C10人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO106)和氨基酸序列(SEQ ID NO42)。划出了CDR1(SEQ ID NO8)、CDR2(SEQ ID NO20)和CDR3(SEQ ID NO31)区，并指出了V、D和J的种系起源。
图8B显示7C10人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO117)和氨基酸序列(SEQ ID NO91)。划出了CDR1(SEQ IDNO58)、CDR2(SEQ ID NO69)和CDR3(SEQ ID NO80)区，并指出了V和J的种系起源。
图9A显示8F6人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO107)和氨基酸序列(SEQ ID NO43)。划出了CDR1(SEQ ID NO9)、CDR2(SEQ ID NO21)和CDR3(SEQ ID NO32)区，并指出了V、D和J的种系起源。
图9B显示8F6人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO118)和氨基酸序列(SEQ ID NO92)。划出了CDR1(SEQ IDNO59)、CDR2(SEQ ID NO70)和CDR3(SEQ ID NO81)区，并指出了V和J的种系起源。
图10A显示10A12人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO108)和氨基酸序列(SEQ ID NO44)。划出了CDR1(SEQ IDNO10)、CDR2(SEQ ID NO22)和CDR3(SEQ ID NO33)区，并指出了V和J的种系起源。另外，CDR1内的氨基酸残基32可以由半胱氨酸突变为丝氨酸(SEQ ID NO11)，产生SEQ ID NO45的VH序列。
图10B显示10A12人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO119)和氨基酸序列(SEQ ID NO93)。划出了CDR1(SEQ IDNO60)、CDR2(SEQ ID NO71)和CDR3(SEQ ID NO82)区，并指出了V和J的种系起源。
图11A显示13C4人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO109)和氨基酸序列(SEQ ID NO46)。划出了CDR1(SEQ IDNO12)、CDR2(SEQ ID NO23)和CDR3(SEQ ID NO34)区，并指出了V、D和J的种系起源。
图11B显示13C4人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO120)和氨基酸序列(SEQ ID NO94)。划出了CDR1(SEQ IDNO61)、CDR2(SEQ ID NO72)和CDR3(SEQ ID NO83)区，并指出了V和J的种系起源。
图12显示1D4、1E1、2G1、6A5、6A8、7C10和10A12的重链可变区氨基酸序列与人种系VH3-33氨基酸序列(SEQ ID NO47)的比对。
图13显示6B 10和8F6的重链可变区氨基酸序列与人种系VH3-30.3氨基酸序列(SEQ ID NO48)的比对。
图14显示3C4的重链可变区氨基酸序列与人种系VH5-51氨基酸序列(SEQ ID NO49)的比对。
图15显示13C4的重链可变区氨基酸序列与人种系VH4-61氨基酸序列(SEQ ID NO50)的比对。
图16显示1D4、2G1、6A5、6A8、10A12和13C4的轻链可变区氨基酸序列与人种系VKA27氨基酸序列(SEQ ID NO95)的比对。
图17显示1E1、6B 10和8F6的轻链可变区氨基酸序列与人种系VKL6氨基酸序列(SEQ ID NO96)的比对。
图18显示3C4的轻链可变区氨基酸序列与人种系VKL18氨基酸序列(SEQ ID NO97)的比对。
图19显示7C 10的轻链可变区氨基酸序列与人种系VKL15氨基酸序列(SEQ ID NO98)的比对。
发明详述本发明涉及与IP-10特异性结合并且抑制IP-10的功能性质的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体源自特定重链和轻链种系序列，和/或包含特定结构特征，如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供分离的抗体、制备该抗体的方法、含有该抗体的免疫偶联物和双特异性分子、和含有本发明的抗体、免疫偶联物或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及使用该抗体抑制炎症或自身免疫应答，例如用于治疗各种炎症或自身免疫病的方法，以及治疗与不利IP-10活性有关的病毒感染的方法。
为了使本发明更容易理解，首先定义了一些术语。其他的定义在整个发明详述内容中说明。
术语“干扰素γ诱导蛋白10”、“IP-10”和“CXCL10”可互换使用，包括人IP-10的变体、同种型和物种同源物。因此，本发明的人抗体在某些情况下可与来自人类以外物种的IP-10交叉反应。在其他情况下，该抗体对于人IP-10可能是完全特异性的，可能不表现出物种或其他类型的交叉反应性。人IP-10的完整氨基酸序列的Genbank登录号为NP_001556(SEQ ID NO121)。恒河猴IP-10的完整氨基酸序列的Genbank登录号为AAK95955(SEQ ID NO123)。小鼠IP-10的完整氨基酸序列的Genbank登录号为NP_067249(SEQ ID NO124)。
术语“CXCR3”是指IP-10(CXCL10)的受体。人CXCR3的完整氨基酸序列的Genbank登录号为NP_001495(SEQ ID NO122)。
术语“MIG”是指CXCR3的一种配体，也称作γ-干扰素诱导的单核因子，它不同于IP-10。人MIG的完整氨基酸序列的Genbank登录号为NP_002407(SEQ ID NO125)。
术语“ITAC”是指CXCR3的一种配体，也称作干扰素诱导的T细胞α化学引诱物，它不同于IP-10。人IATC的完整氨基酸序列的Genbank登录号为NP_005400(SEQ ID NO126)。
术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，导致选择性损伤、破坏或从人体中清除侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞，或在自身免疫或病理性炎症的情况下，正常人细胞或组织。
“信号转导途径”是指在信号从一个细胞的一部分传送到一个细胞的另一部分中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。如此处所用的，短语“细胞表面受体”包括，例如，能够接收信号和这种信号在细胞质膜中传播的分子和分子复合物。本发明的“细胞表面受体”的一个例子是与IP-10分子结合的CXCR3受体。
这里提到的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为VLx)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布在被称为构架区(FR)的更加保守的区域中。VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。
如此处所用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保持与抗原(例如IP-10)特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。术语抗体的“抗原结合部分”中所包括的结合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以利用重组方法通过合成接头连接在一起，该接头使它们能够制成一条蛋白质链，其中VL和VH区配对构成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等(1988)Science 242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用如完整抗体相同的方法对这些片段进行实用性筛选。
如此处所用的，“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与IP-10特异性结合的分离的抗体基本不含与除IP-10以外的抗原特异性结合的抗体)。但是，与IP-10特异性结合的分离的抗体与其他抗原如来自其他物种的IP-10分子具有交叉反应性。而且，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
如此处所用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和性。
如此处所用的，术语“人抗体”包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。而且，如果该抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，如此处所用的，术语“人抗体”不包括这样的抗体，即其中源自另一哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已移植到人构架序列上。
术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有可变区，其中构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与无限增殖细胞融合的B细胞，该B细胞从具有含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物例如转基因小鼠中获得。
如此处所用的，术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)中分离的抗体，(b)从经转化表达人抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪切为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。但是在某些实施方案中，这些重组人抗体可以进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列尽管源自人种系VH和VL序列并与之相关，但可能不是在体内人抗体种系谱(repertoire)中天然存在。
如此处所用的，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在此与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。
如此处所用的，术语“与人IP-10特异性结合”的抗体是指以5×10-9M或更低、更优选2×10-9M或更低、甚至更优选1×10-10M或更低的KD与人IP-10结合的抗体。“与恒河猴IP-10交叉反应”的抗体是指以5×10-8M或更低、更优选5×10-9M或更低、甚至更优选2×10-9M或更低的KD与恒河猴IP-10结合的抗体。“不与小鼠IP-10交叉反应”或“不与人MIG交叉反应”或“不与人ITAC交叉反应”的抗体是指以1.5×10-8M或更高、更优选5-10×10-8M或更高、甚至更优选1×10-7M或更高的KD与小鼠IP-10、人MIG或人ITAC结合的抗体。在某些实施方案中，这些不与小鼠IP-10、人MIG和/或人ITAC交叉反应的抗体在标准结合试验中表现出基本检测不到与这些蛋白质的结合。
如此处所用的，“抑制IP-10与CXCR3结合”的抗体是指以1nM或更低、更优选0.75nM或更低、甚至更优选0.5nM或更低、甚至更优选0.25nM或更低的Ki抑制IP-10与CXCR3结合的抗体。
如此处所用的，“抑制IP-10诱导的钙流”的抗体是指以10nM或更低、更优选7.5nM或更低、甚至更优选5nM或更低、甚至更优选2.5nM或更低的IC50抑制IP-10诱导的钙流的抗体。
如此处所用的，“抑制IP-10诱导的细胞迁移”的抗体是指以2μg/ml或更低、更优选1μg/ml或更低、甚至更优选0.5μg/ml或更低、甚至更优选0.25μg/ml或更低的IC50抑制人IP-10诱导的细胞迁移的抗体。
如此处所用的，术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如此处所用的，术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如此处所用的，术语“KD”是指解离常数，它是由Kd与Ka的比值获得的(即Kd/Ka)，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可能用本领域公知的方法测定。测定抗体KD的一种优选方法是使用表面等离振子共振，优选使用生物传感器系统，如Biacore系统。
如此处所用的，术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对于靶抗原的KD为10-8M或更低、更优选10-9M或更低、甚至更优选10-10M或更低。但是对于其他抗体同种型，“高亲和力”结合可能不同。例如，对于IgM同种型的“高亲和力”结合是指抗体具有10-7M或更低、更优选10-8M或更低的KD。
如此处所用的，术语“受试者”包括任何人或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类动物、爬行类动物等。
本发明的各个方面在下面的部分中进一步详细描述。
抗-IP-10抗体本发明的抗体用抗体的特定功能特征或性质来表征。例如，该抗体与人IP-10特异性结合。另外，该抗体也可以与来自一种或多种非人类灵长类动物如恒河猴的IP-10交叉反应。优选地，该抗体不与小鼠IP-10交叉反应。而且，尽管MIG和ITAC也是CXCR3受体的配体，但是本发明的抗体优选地不与人MIG或人ITAC交叉反应。
优选地，本发明的抗体与IP-10高亲和力地结合，例如KD为10-8M或更低，或10-9M或更低，甚至10-10M或更低。
此外，本发明的抗体能够抑制IP-10的一种或多种功能活性。例如，在一个实施方案中，该抗体抑制IP-10与CXCR3的结合。在另一实施方案中，该抗体抑制IP-10诱导的钙流。在又另一实施方案中，该抗体抑制IP-10诱导的细胞迁移(趋化性)。
评价抗体与各物种的IP-10和/或MIG或ITAC结合能力的标准试验在本领域中公知，包括，例如ELISA、Western印迹分析和RIA。合适的试验在实施例中详细描述。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域公知的标准试验如Biacore分析来评价。评价抗体对IP-10功能性质(例如受体结合、钙流、趋化性)的影响的试验在实施例中进一步详细描述。
因此，如根据本领域公知的和在此描述的方法所测定的，“抑制”一种或多种这样的IP-10功能性质(例如，生物化学、免疫化学、细胞、生理学或其他生物学活性等)的抗体，应当理解为涉及相对于不含该抗体时(例如，或者当存在无关特异性的对照抗体时)所见，特定活性统计学显著性降低。优选地，抑制IP-10活性的抗体导致统计学显著性地降低所测参数的至少10％，更优选20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，在某些优选实施方案中，本发明的抗体可抑制92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的IP-10功能活性。
单克隆抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4本发明优选的抗体是如实施例1和2所述分离并进行结构表征的人单克隆抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4。另外一种优选抗体是10A12S，其中10A12重链的氨基酸残基32(在VHCDR1内)从半胱氨酸突变为丝氨酸。1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S和13C4的VH氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO35-46中。1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4的VL氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO84-94中。
假定这些抗体中的每一个都能够与IP-10结合，则VH和VL序列可以“混合并匹配”，以产生本发明的其他的抗-IP-10结合分子。这些“混合并匹配的”抗体的IP-10结合可以用上文及实施例中所述的结合试验(例如ELISA)检测。优选地，当VH和VL链混合并匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列被替换为结构上相似的VH序列。同样，优选地，来自特定VH/VL配对的VL序列被替换为结构上相似的VL序列。例如，1D4、2G1、6A5、6A8、10A 12或10A12S的VH和VL序列特别容易混合并匹配，因为这些抗体使用源自相同种系序列(VH 3-33和Vk A27)的VH和VL序列，因此显示结构相似性。同样，6B10和8F6的VH和VL序列也特别容易混合并匹配，因为它们也使用源自相同种系序列(VH 3-30.3和Vk L6)的VH和VL序列，因此显示结构相似性。另外，例如，1D4、2G1、6A5、6A8、10A12或10A12S的VH序列可以与13C4的VL配对，因为1D4、2G1、6A5、6A8、10A12和10A12S的VH序列最初与种系Vk A27的VL序列配对，而13C4的VL序列也源自种系Vk A27。同样，7C10或1E1的VL序列也可以与1D4、2G1、6A5、6A8、10A12或10A12S的VH配对，因为7C10和1E1的VL序列最初与种系VH 3-33的VH序列配对，而1D4、2G1、6A5、6A8、10A12和10A12S的VH序列也源自种系VH 3-33。对于本领域技术人员来说显而易见的，结构相似序列的其他VH/VL配对也可以由此处对于单克隆抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4公开的VH和VL序列产生。
因此，在一个方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含(a)包含选自SEQ ID NO35-46的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含选自SEQ ID NO84-94的氨基酸序列的轻链可变区；其中该抗体与IP-10特异性结合。
优选的重链和轻链组合包括(a)包含SEQ ID NO35的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO84的氨基酸序列的轻链可变区；或(a)包含SEQ ID NO36的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO85的氨基酸序列的轻链可变区；或(a)包含SEQ ID NO37的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO86的氨基酸序列的轻链可变区；或(a)包含SEQ ID NO38的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO87的氨基酸序列的轻链可变区；或(a)包含SEQ ID NO39的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO88的氨基酸序列的轻链可变区；或(a)包含SEQ ID NO40的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO89的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO41的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO90的氨基酸序列的轻链可变区；或(a)包含SEQ ID NO42的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO91的氨基酸序列的轻链可变区；或(a)包含SEQ ID NO43的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO92的氨基酸序列的轻链可变区；或(a)包含SEQ ID NO44或45的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO93的氨基酸序列的轻链可变区；或(a)包含SEQ ID NO46的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO94的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一方案中，本发明提供包含1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S和13C4的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的抗体。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S和13C4的VHCDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO1-12中。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4的VHCDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO13-23中。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4的VHCDR3的氨基酸序列示于SEQ IDNO24-34中。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4的VKCDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO51-61中。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4的VKCDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO62-72中。1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4的VKCDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO73-83中。CDR区用Kabat系统划出(Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)。
假如这些抗体均能与IP-10结合，并且抗原结合特异性主要是由CDR1、2、3区提供的，则VHCDR1、2、3序列与VLCDR1、2、3序列可以“混合并匹配”(即来自不同抗体的CDR可以混合并匹配，但是每个抗体必须含有VHCDR1、2、3和VLCDR1、2、3)，以产生本发明的其他的抗-IP-10结合分子。这些“混合并匹配的”抗体的IP-10结合可以用上文及实施例中所述的结合试验(例如ELISA)检测。优选地，当VHCDR序列混合并匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替换为结构上相似的CDR序列。同样，当VLCDR序列混合并匹配时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地被替换为结构上相似的CDR序列。例如，1D4、1E1、2G1、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和10A12S的VHCDR1具有一定的结构相似性，因此容易混合并匹配，而3C4和13C4的VHCDR1与1D4、1E1、2G1、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和10A12S的VHCDR1没有结构相似性，因此应当不与它们混合并匹配，对于本领域技术人员而言显而易见的，通过将一个或多个VH和/或VLCDR区序列替换为来自此处对于单克隆抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4公开的CDR序列的结构上相似的序列，可以产生新的VH和VL序列。
因此，在另一个方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含(a)包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含选自SEQ ID NO13-23的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含选自SEQ ID NO24-34的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含选自SEQ ID NO51-61的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含选自SEQ ID NO62-72的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(f)包含选自SEQ ID NO73-83的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中该抗体与IP-10特异性结合。
在一个优选实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO1的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO13的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO24的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO51的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO62的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO73的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO2的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO14的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO25的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO52的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO63的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO74的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO3的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO15的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO26的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO53的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO64的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO75的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO4的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO16的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO27的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO54的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO65的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO76的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO5的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO17的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO28的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO55的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO66的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO77的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO6的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO18的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO29的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO56的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO67的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO78的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO7的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO19的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO30的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO57的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO68的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO79的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO8的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO20的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO31的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO58的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO69的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO80的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO9的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO21的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO32的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO59的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO70的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO81的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO10或11的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO22的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO33的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO60的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO71的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO82的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO12的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO23的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO34的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO61的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO72的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO83的轻链可变区CDR3。
具有特定种系序列的抗体在某些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
如在此证明的，已经制备了IP-10特异性人抗体，其包含是人种系VH 3-33基因、VH 3-30.3基因、VH 5-51基因或VH 4-61基因的产物或源自该基因的重链可变区。因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含是选自下组的人VH种系基因的产物或源自该基因的重链可变区VH 3-33、VH 3-30.3、VH 5-51和VH 4-61。优选地，该抗体是人IP-10多肽特异性的(例如包含Genbank登录号NP_001556的序列)。
在此还证明，已经制备了IP-10特异性人抗体，其包含是人种系Vk A27基因、Vk L15基因、Vk L6基因或Vk L18基因的产物或源自该基因的轻链可变区。因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含是选自下组的人Vk种系基因的产物或源自该基因的轻链可变区Vk A27、Vk L15、Vk L6和Vk L18。优选地，该抗体是人IP-10多肽特异性的(例如包含Genbank登录号NP_001556的序列)。
本发明优选的抗体既包含是上述人种系VH基因之一的产物或源自该基因的重链可变区，也包含是上述人种系Vk基因之一的产物或源自该基因的轻链可变区。因此，在另一实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含(a)是选自下组的人VH种系基因的产物或源自该基因的重链可变区VH 3-33、VH 3-30.3、VH 5-51和VH 4-61；和(b)是选自下组的人Vk种系基因的产物或源自该基因的轻链可变区Vk A27、Vk L15、Vk L6和Vk L18。优选地，该抗体是人IP-10多肽特异性的(例如包含Genbank登录号NP_001556的序列)。
本发明还提供包含重链和轻链可变区的优选组合的抗体，该重链和轻链可变区是特定VH和Vk种系基因的产物或源自该基因。例如，在一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体(a)包含是人VH 3-33基因(其编码SEQ ID NO47所示的氨基酸序列)的产物或源自该基因的重链可变区；(b)包含是人Vk A27、L15或L6基因(它们分别编码SEQ IDNO95、98、97所示的氨基酸序列)的产物或源自该基因的轻链可变区；且
(c)与IP-10特异性结合。
在一个实施方案中，该抗体包含是人Vk A27基因的产物或源自该基因的轻链可变区。分别具有VH 3-33和Vk A27的VH和VK的抗体的例子包括1D4、2G1、6A5、6A8、10A12和10A12S。在另一实施方案中，该抗体包含是人Vk L15基因的产物或源自该基因的轻链可变区。分别具有VH 3-33和Vk L15的VH和VK的抗体的一个例子是7C10。在另一实施方案中，该抗体包含人Vk L6基因的轻链可变区。分别具有VH 3-33和Vk L6的VH和VK的抗体的一个例子是1E1。
在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体(a)包含人VH 3-30.3基因(其编码SEQ ID NO48所示的氨基酸序列)的或源自该基因的重链可变区；(b)包含人Vk L6基因(其编码SEQ ID NO96所示的氨基酸序列)的或源自该基因的轻链可变区；且(c)与IP-10特异性结合。
分别具有VH 3-30.3和Vk L6的VH和VK的抗体的例子包括6B10和8F6。
在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体(a)包含人VH 5-51基因(其编码SEQ ID NO49所示的氨基酸序列)的或源自该基因的重链可变区；(b)包含人Vk L18基因(其编码SEQ ID NO97所示的氨基酸序列)的或源自该基因的轻链可变区；且(c)与IP-10特异性结合。
分别具有VH 5-51和Vk L18的VH和VK的抗体的一个例子是3C4。
在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体(a)包含人VH 4-61基因(其编码SEQ ID NO50所示的氨基酸序列)的或源自该基因的重链可变区；(b)包含人Vk A27基因(其编码SEQ ID NO95所示的氨基酸序列)的或源自该基因的轻链可变区；且(c)与IP-10特异性结合。
分别具有VH 4-61和Vk A27的VH和VK的抗体的一个例子是13C4。
如此处所用的，如果一种人抗体的可变区是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统中获得的，则该抗体包含是特定种系序列的“产物”或“源自”该序列的重链或轻链可变区。这样的系统包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用目标抗原筛查展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。是人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”该序列的人抗体可以这样鉴定将该人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，选择在序列上最接近于该人抗体序列(即有最高％同一性)的人种系免疫球蛋白序列。是特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”该序列的人抗体与该种系序列相比可能包含氨基酸差异，例如由于天然发生的体细胞突变或定点突变的有意引入。但是，选择的人抗体在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列一般至少90％相同，并且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比时，决定该人抗体属于人类的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95％、甚至至少96％、97％、98％或99％相同。一般来说，源自特定人种系序列的人抗体将显示与该人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相差不超过10个氨基酸。在某些情况下，该人抗体可显示与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相差不超过5个、甚至不超过4、3、2或1个氨基酸。
同源抗体在另一实施方案中，本发明的抗体包含的重链和轻链可变区含有与此处所述优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中该抗体保留了本发明抗-IP-10抗体的需要的功能性质。
例如，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中(a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO35-46的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；(b)轻链可变区包含与选自SEQ ID NO84-94的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；(c)该抗体与IP-10特异性结合，且(d)该抗体表现至少一种如下功能性质(i)该抗体抑制IP-10与CXCR3的结合；(ii)该抗体抑制IP-10诱导的钙流；(iii)该抗体抑制IP-10诱导的细胞迁移；(iv)该抗体与恒河猴IP-10交叉反应；(v)该抗体不与小鼠IP-10交叉反应；(vi)该抗体不与人MIG交叉反应；(vii)该抗体不与人ITAC交叉反应。
在各种实施方案中，该抗体可能表现一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种、或六种或多种以上(d)至(j)所列的功能性质。该抗体可以是，例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在另外的实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有分别与SEQ IDNO35-46和84-94的VH和VL区高度(即80％或更高)同源的VH和VL区的抗体可以如下获得诱变(例如定点或PCR介导的诱变)编码SEQ ID NO35-46和/或84-94的核酸分子，然后用此处所述的功能试验检测编码的改变抗体保留的功能(即以上(c)至(j)所述的功能)。
如此处所用的，两个氨基酸序列之间的百分同源性相当于两个序列之间的百分同一性。考虑为了两个序列之间进行最佳比对所需要引入的空位的数目和每个空位的长度后，两个序列之间的百分同一性是这两个序列共有的相同位置的数目的函数(即％同源性＝相同位置数/位置总数×100％)。两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定可以用如下面非限制性实施例中所述的数学算法实现。
两个氨基酸序列之间的百分同一性可以用已经整合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988))的算法进行确定，其使用PAM120权重残基表，12的空位长度罚分，4的空位罚分。另外，两个氨基酸序列之间的百分同一性也可以用已经整合入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1970))的算法进行确定，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和1、2、3、4、5或6的长度权重。
另外，或者，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来对公共数据库进行检索，例如鉴定相关序列。这种检索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的XBLAST程序(2.0版本)进行。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所述采用空位BLAST。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守修饰的抗体在某些实施方案中，本发明的抗体包含含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗体(例如1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S或13C4)的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中该抗体保留本发明抗-IP-10抗体的需要的功能性质。因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO24-34的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；(b)轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO73-83的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；(c)该抗体与IP-10特异性结合，且(d)该抗体表现至少一种如下功能性质(i)该抗体抑制IP-10与CXCR3的结合；(ii)该抗体抑制IP-10诱导的钙流；(iii)该抗体抑制IP-10诱导的细胞迁移；(iv)该抗体与恒河猴IP-10交叉反应；(v)该抗体不与小鼠IP-10交叉反应；(vi)该抗体不与人MIG交叉反应；(vii)该抗体不与人ITAC交叉反应。
在一个优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ IDNO13-23的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO62-72的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO51-61的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。
在各种实施方案中，该抗体可能表现一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种或六种或多种以上(d)至(j)所列的功能性质。这些抗体可以是，例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如此处所用的，术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变含该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域公知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，向本发明抗体中引入修饰。保守氨基酸置换是指将氨基酸残基替换为一个具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已经定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明抗体CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被置换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以用此处所述的功能试验检测改变的抗体保留的功能(例如以上(c)至(j)所述的功能)。
与本发明的抗-IP-10抗体结合相同表位的抗体在另一实施方案中，本发明提供与此处所述本发明的各种抗-IP-10抗体结合相同表位的抗体，例如与此处所述的1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S或13C4抗体结合相同表位的其他人抗体。这些其他抗体可以在标准IP-10结合试验中根据它们与本发明其他抗体如1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S或13C4交叉竞争(例如以统计学显著性方式竞争性抑制它们的结合)的能力来鉴定。测试抗体抑制例如1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S或13C4与人IP-10结合的能力证明，该测试抗体可以与该抗体竞争结合人IP-10；根据非限制性的理论，这种抗体可以与它所竞争的抗体结合人IP-10上相同或相关(例如结构上相似或空间上接近)的表位。在一个优选实施方案中，与1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S或13C4结合人IP-10上相同表位的抗体是一种人单克隆抗体。这些人单克隆抗体可以如实施例所述制备和分离。
改造的(engineered)和修饰的抗体本发明的抗体还可以如下制备用具有此处所公开的一种或多种VH和/或VL序列的抗体作为起始材料，改造一种修饰的抗体。可以通过修饰一个或多个可变区(即VH和/或VL)例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的一个或多个残基来改造抗体。另外，或者，可以通过修饰恒定区内的残基来改造抗体，例如改变该抗体的效应功能。
可以实施的一种类型的可变区改造是CDR移植。抗体主要是通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，在各个抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更加多样化。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，通过构建一种表达载体，其包含来自特定天然存在抗体的CDR序列，该CDR序列移植到来自具有不同性质的不同抗体的构架序列上，可以表达模拟该特定天然存在抗体的性质的重组抗体(参见，例如，Riechmann，L.等(1998)Nature 332323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321522-525；Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610029-10033；Winter的美国专利5,225,539号，和Queen等人的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370号)。
因此，本发明的另一实施方案涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，该CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO1-12、SEQID NO13-23和SEQ ID NO24-34的氨基酸序列，并且包含含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，该CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO51-61、SEQ ID NO62-72和SEQ IDNO73-83的氨基酸序列。因此，这些抗体含有单克隆抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S或13C4的VH和VLCDR序列，但是可含有与这些抗体不同的构架序列。
这些构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或发表的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在以下资源中发现“VBase”人种系序列数据库(可从因特网上www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)，以及Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242；Tomlinson，I.M.等(1992)“The Repertoire of Human Germline VHSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J.Mol.Biol.227776-798；和Cox，J.P.L.等(1994)“A Directory of Human Germ-line VHSegments Reveals a Strong Bias intheir Usage”Eur.J.Immunol.24827-836；其内容均在此引用作为参考。
用于本发明抗体的优选构架序列在结构上类似于选择的本发明抗体使用的构架序列，例如，类似于本发明优选的单克隆抗体使用的VH3-33、3-30.3、4-61或5-51序列[SEQ ID NO47-50]和/或VkA27、L6、L18或L15构架序列[SEQ ID NO95-98]。VHCDR1、2、3序列和VLCDR1、2、3序列可以移植到与该构架序列的来源种系免疫球蛋白基因具有相同序列的构架区上，或者CDR序列可以移植到与该种系序列相比含有一个或多个突变的构架区上。例如，已经发现，在某些情况中，将构架区的残基进行突变对于保持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参见，例如，Queen等的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是突变VH和/或VLCDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸序列，从而改善目标抗体的一种或多种结合性质(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变，引入突变，对抗体结合的影响，或者其他目标功能性质，可以用此处所述和实施例中提供的体外或体内试验来评价。优选引入(如上文所述的)保守修饰。这些突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但是优选置换。而且，一般改变CDR区内的不超过1、2、3、4或5个残基。
因此，在另一实施方案中，本发明提供分离的抗-IP-10单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含的重链可变区含有(a)VHCDR1区，其包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列，或与SEQ ID NO1-12相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHCDR2区，其包含选自SEQ ID NO13-23的氨基酸序列，或与SEQ ID NO13-23相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VHCDR3区，其包含选自SEQ ID NO24-34的氨基酸序列，或与SEQ ID NO24-34相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VLCDR1区，其包含选自SEQ ID NO51-61的氨基酸序列，或与SEQ ID NO51-61相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VLCDR2区，其包含选自SEQ ID NO62-72的氨基酸序列，或与SEQ IDNO62-72相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VLCDR3区，其包含选自SEQ ID NO73-83的氨基酸序列，或与SEQ ID NO73-83相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明一个优选的置换突变是将10A12mAb VH链CDR1内位点32处的半胱氨酸残基置换为丝氨酸残基。10A12的这种修饰形式在此称为10A12S。10A12的VH链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO44中，10A12S的VH链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO45中。
本发明的改造的抗体包括例如为了改善抗体性质而对其VH和/或VL内的构架残基进行了修饰的抗体。进行这样的构架修饰一般是为了降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基“回复突变”为相应的种系序列。更特别地，经历体细胞突变的抗体可含有与该抗体的来源种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架序列与该抗体的来源种系序列，可以鉴定这些残基。例如，对于6A5，VH的氨基酸残基#2(FR1内)是甲硫氨酸，而在相应的VH3-33种系序列中该残基为缬氨酸(见图12)。为了使构架区序列恢复为其种系构型，通过例如定点诱变或PCR介导的诱变，体细胞突变可以“回复突变”为种系序列(例如，6A5的VH的残基2可以从甲硫氨酸“回复突变”为缬氨酸)。这些“回复突变”的抗体也包括在本发明内。
另一种类型的构架修饰涉及对构架区内、甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基进行突变，以除去T细胞表位，从而降低该抗体的潜在的免疫原性。该方法也被称为“脱免疫”，在Carr等人的公布号为20030153043的美国专利中详细记载。
除了在构架区或CDR区内进行的修饰以外，或者作为它的替代，本发明的抗体可以改造为在Fc区内包括修饰，一般是为了改变该抗体的一种或多种功能性质，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体也可以化学修饰(例如一个或多个化学部分可以连接到该抗体上)，或者修饰改变其糖基化，以改变该抗体的一种或多种功能性质。这些实施方案均在下文详细描述。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使该铰链区中半胱氨酸残基的数量改变，例如增加或减少。该方法在Bodmer等人的美国专利5,677,425号中详细记载。改变CH1铰链区中半胱氨酸的数量是为了，例如，促进轻链和重链的装配，或提高或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低该抗体的生物学半衰期。更具体地，向Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得相对于天然Fc-铰链结构域的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合，该抗体的SpA结合减弱。该方法在Ward等人的美国专利6,165,745号中详细记载。
在另一实施方案中，修饰抗体以提高其生物学半衰期。可以使用各种方法。例如，可以引入一个或多个如下突变T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利6,277,375所述。或者，为了提高生物学半衰期，该抗体可以在CH1或CL区内进行改变，使之含有来自IgG Fc区CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的5,869,046和6,121,022号所述。
在其他实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应功能。例如，可以将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320、322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体具有改变的对效应配体的亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。改变对其亲和力的效应配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1成分。该方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中更详细地描述。
在另外一个实施例中，可以将选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中更详细地描述。
在另外一个实施例中，改变氨基酸位点231和239中的一个或多个氨基酸残基，从而改变该抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中进一步描述。
在另外一个实施例中，为了提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力，通过在下列位点处修饰一个或多个氨基酸修饰Fc区238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439。该方法在Presta的PCT公布WO 00/42072中进一步描述。而且，人IgG1上对于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经作图，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.2766591-6604)。位点256、290、298、333、334和339处的特定突变显示改善了与FcγRIII的结合。另外，下列组合突变体显示改善了FcγRIII结合T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在另一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即该抗体缺乏糖基化)。例如，为了提高抗体对抗原的亲和力，可以改变糖基化。这样的糖基化修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，导致一个或多个可变区构架糖基化位点消失，从而消除了该位点处的糖基化。这种糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述。
另外，或者，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，如具有数量减少的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体，或具有增多的等分GlcNac结构的抗体。这种改变的糖基化模式已经证明提高抗体的ADCC能力。这种糖修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中已有描述，能够用作宿主细胞在其中表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hanai等人的EP 1,176,195描述了一种细胞系，其具有功能破坏的RUT8基因，该基因编码一种岩藻糖基转移酶，因此这种细胞系中表达的抗体显示低岩藻糖基化。Presta的PCT公布WO03/035835记载了一种变异CHO细胞系，Lec13细胞，其具有降低的使岩藻糖连接到Asn(297)-连接的碳水化合物上的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.27726733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342记载了经改造表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β(1，4)-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，因此该工程细胞系中表达的抗体显示增加的等分GlcNac结构，导致抗体的ADCC活性提高(参见，Umana等(1999)Nat.Biotech.17176-180)。
本发明包括的此处所述抗体的另一种修饰是PEG化。例如，为了提高抗体的生物学(例如血清)半衰期，可以将该抗体PEG化。为了PEG化一种抗体，在一个或多个PEG基团变为与该抗体或抗体片段连接的条件下，将该抗体或其片段一般与聚乙二醇(PEG)如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。如此处所用的，术语“聚乙二醇”意在包括用于将其他蛋白质衍生化的任何PEG形式，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，要PEG化的抗体是一种无糖基化的抗体。将蛋白质PEG化的方法在本领域中公知，并且可以用于本发明的抗体。参见，例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
改造抗体的方法如上所述，通过修饰VH和/或VL序列或与之连接的恒定区，具有此处公开的VH和VL序列的抗-IP-10抗体能够用于产生新的抗-IP-10抗体。因此，在本发明的另一方面，本发明的抗-IP-10抗体，例如1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S或13C4的结构特征，用来产生结构上相关的抗-IP-10抗体，该结构相关的抗体保留本发明抗体的至少一种功能性质，如与人IP-10和恒河猴IP-10结合，但是不与小鼠IP-10或人MIG或人ITAG结合，并且也抑制IP-10的一种或多种功能性质(例如，CXCR3结合、钙流、趋化性)。例如，1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12、10A12S或13C4的一个或多个CDR区或其突变，可以与已知的构架区和/或其他CDR重组组合，如上所述产生另外的重组改造的本发明的抗-IP-10抗体。其他类型的修饰包括以上部分所述的修饰。用于改造方法的起始材料是此处提供的一种或多种VH和/或VL序列，或其一个或多个CDR区。为了产生工程化抗体，不一定实际制备(即表达为蛋白质)具有此处提供的一种或多种VH和/或VL序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而是用该序列中所含的信息作为起始材料，产生源自原始序列的“第二代”序列，然后制备该“第二代”序列，并将其表达为蛋白质。
因此，在另一实施方案中，本发明提供一种制备抗-IP-10抗体的方法，包括
(a)提供(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO1-12的CDR1序列、选自SEQ ID NO13-23的CDR2序列和/或选自SEQID NO24-34的CDR3序列；和(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO51-61的CDR1序列、选自SEQ ID NO62-72的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO73-83的CDR3序列；(b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，从而产生至少一个改变的抗体序列；和(c)使该改变的抗体序列表达为蛋白质。
可以利用标准分子生物学技术制备和表达改变的抗体序列。
优选地，由改变的抗体序列编码的抗体保留此处所述抗-IP-10抗体的一种、一些或全部功能性质，该功能性质包括但不限于(i)与人IP-10特异性结合；(ii)抑制IP-10与CXCR3的结合；(iii)抑制IP-10诱导的钙流；(iv)抑制IP-10诱导的细胞迁移；(v)与恒河猴IP-10交叉反应；(vi)不与小鼠IP-10交叉反应；(vii)不与人MIG交叉反应；和(viii)不与人ITAC交叉反应。
改变的抗体可表现一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种、六种或多种或七种或多种以上(i)至(viii)所列的功能性质。
改变的抗体的功能性质可以用本领域中使用的和/或此处所述的，如实施例中所述的标准试验(例如ELISA、钙流测定、趋化性测定)来评价。
在改造本发明抗体的方法的某些实施方案中，可以沿全部或部分抗-IP-10抗体编码序列随机或选择性引入突变，并可以对获得的修饰的抗-IP-10抗体筛选其结合活性和/或如此处所述的其他功能性质。突变方法在本领域中已经描述。例如，Short的PCT公布WO 02/092780记载了利用饱和诱变、合成连接装配或它们的组合产生和筛选抗体突变的方法。另外，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679也记载了利用计算筛选方法优化抗体的生理化学性质的方法。
编码本发明的抗体的核酸分子本发明的另一方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。该核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本纯化的形式存在。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他方法，与其他细胞成分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白质分离纯化时，核酸是“分离的”或“使得基本上纯的”。参见，F.Ausubel等编著(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含内含子序列。在一个优选实施方案中，该核酸是cDNA分子。
本发明的核酸可以利用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤(例如由如下文进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码通过杂交瘤制备的抗体轻链和重链的cDNA可以用标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，编码抗体的核酸可以从文库中获得。
本发明优选的核酸分子是编码1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12或13C4单克隆抗体的VH和VL序列的核酸分子。编码1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4的VH序列的DNA序列分别显示在SEQ IDNO99-109中。编码1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4的VL序列的DNA序列分别显示在SEQ IDNO110-120中。
一旦获得编码VH和VL片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因，转化为Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性接头的另一种DNA片段可操作地连接。如在本文中使用的，术语“可操作地连接”意思是两个DNA片段连接在一起，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在读框内。
通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另外一种DNA分子可操作地连接，可以将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences ofProteins of Immunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human SerVices，NIH出版号91-3242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选地是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与只编码重链CH1恒定区的另外一种DNA分子可操作地连接。
通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另外一种DNA分子可操作地连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologiclInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但是最优选地是κ恒定区。
为了产生scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可以与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另外一种片段可操作地连接，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，其VL和VH区通过柔性接头连接(参见，例如Bird等(1988)Science 242423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；McCafferty等(1990)Nature 348552-554)。
本发明的单克隆抗体的产生通过多种技术能制备本发明的单克隆抗体(mAb)，包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256495的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交技术，但是原则上，能使用制备单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌基因转化。
制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。用小鼠产生杂交瘤是一种完善确立的程序。免疫程序和用于融合的免疫脾细胞的分离技术是本领域公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是公知的。
本发明的嵌合或人源化抗体可以根据如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术改造为含有非鼠(例如人类)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠可变区连接到人恒定区上(参见，例如，Cabilly等人的美国专利4,816,567号)。为了产生人源化抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠CDR区插入人构架内(参见，例如，Winter的美国专利5,225,539号，和Queen等人的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370号)。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。这种抗IP-10的人单克隆抗体能用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在此分别称作HuMab小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在此通称作“人Ig小鼠”。
HuMab小鼠(Medarex，Inc.)包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和灭活内源μ和κ链基因座的靶向突变(参见，例如，Lonberg等(1994)Nature 368(6474)856-859)。因此，该小鼠表现出降低的小鼠IgM或κ表达，并且对免疫有响应，导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，产生高亲和性人IgGκ单克隆(Lonberg，N.等(1994)，同上；综述Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 11349-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93，和Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546)。HuMab小鼠的制备和使用，以及该小鼠携带的基因组修饰，详细描述于下面的文献中Taylor.L.等(1992)Nucleic Acids Research 206287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 903720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.1522912-2920；Taylor，L.等(1994)International Immunology6579-591；和Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14845-851，这些文献的内容全文在此引入作为参考。进一步参见，美国专利5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；都属于Lonberg和Kay；和Surani等人的美国专利5,545,807；PCT公布号WO 92/03918，WO93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884和WO 99/45962，都属于Lonberg和Kay；和Korman等人的PCT公布号WO 01/14424。
在另一实施方案中，本发明的人抗体可以用转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生。这种小鼠在此称为“KM小鼠”，在Ishida等人的PCT公布WO 02/43478中详细记载。
再者，另外的表达人免疫球蛋白基因的转基因动物系统在本领域中可以获得，能够用来产生本发明的抗-IP-1抗体。例如，可以使用一种称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的另外的转基因系统，这种小鼠在例如Kucherlapati等人的美国专利5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中记载。
而且，另外的表达人免疫球蛋白基因的转染色体动物系统在本领域中可以获得，能够用来产生本发明的抗-IP-1抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其称作“TC小鼠”；这种小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97722-727中记载。另外，携带人重链和轻链转染色体的牛在本领域中已经记载(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20889-894)，并且能够用来产生本发明的抗-IP-1抗体。
本发明的人单克隆抗体也可以使用用于筛查人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备。用于分离人抗体的这些噬菌体展示方法在本领域中已经建立。参见，例如，Ladner等人的美国专利5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利5,427,908和5,580,717；McCaffarty等人的美国专利5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
本发明的人单克隆抗体也可以用SCID小鼠制备，SCID小鼠中重构了人类免疫细胞，因此在免疫时能够产生人类抗体应答。这种小鼠在例如Wilson等人的美国专利5,476,996和5,698,767中记载。
人Ig小鼠的免疫当使用人Ig小鼠产生本发明的人抗体时，根据Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology14845-851；和PCT公布WO 98/24884和WO 01/14424所述，用纯化的或富集的IP-1抗原和/或重组IP-10或IP-10融合蛋白制剂免疫该小鼠。优选地，第一次输注时小鼠为6-16周龄。例如，可以使用纯化的或重组的IP-10抗原的制剂(5-20μg)腹膜内免疫人Ig鼠。
产生抗IP-10完全人单克隆抗体的详细程序在下面的实施例1中描述。用各种抗原积累的经验证明，当最初使用弗氏完全佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫，接着隔周用弗氏不完全佐剂中的抗原腹膜内免疫(最多共六次)时，转基因小鼠产生应答。但是，发现弗氏佐剂之外的佐剂也是有效的。另外，发现在没有佐剂时，全细胞具有高度免疫原性。免疫方案进程中用眶后取血获得的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA(如下所述)筛选血浆，具有足够抗-IP-1人免疫球蛋白效价的小鼠用于进行融合。在处死之前3天用抗原对小鼠静脉内加强免疫并且取出脾。预期对于每次免疫可能需要融合2-3次。每一种抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCo12株都使用。另外，HCo7和HCo12转基因可以杂交，产生具有两种不同人重链转基因的一种小鼠(HCo7/HCo12)。
产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤的制备为了制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，从接受免疫的小鼠中分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并且与合适的无限增殖细胞系例如小鼠骨髓瘤细胞系融合。对得到的杂交瘤筛选抗原特异性抗体的产生。例如，使用50％PEG，来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液能与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。细胞以大约2×105平板接种于平底微量滴定板中，接着在含有20％胎克隆血清，18％“653”条件基质，5％Origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，5mM HEPES，0.055mM 2-巯基乙醇，50单位/毫升青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素和1×HAT的选择性培养基(Sigma；融合24小时后加入HAT)中温育两周。大约两周之后，在其中用HT替换了HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA对各孔筛选人单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天之后观察培养基。分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，如果对于人IgG，单克隆抗体仍然是阳性，则能通过限制性稀释至少亚克隆两次。然后体外培养稳定的亚克隆，在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为了纯化人单克隆抗体，选择的杂交瘤可以在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇瓶中生长。过滤上清液，浓缩，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。洗脱下来的IgG通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查以确保纯度。缓冲溶液换成PBS，用1.43的消光系数根据OD280测定浓度。将单克隆抗体分成等份并且在-80℃下保存。
产生本发明单克隆抗体的转染瘤的制备利用例如本领域公知的重组DNA技术结合基因转染方法(例如，Morrison，S.(1985)science 2291202)，在宿主细胞转染瘤中也能产生本发明的抗体。
例如，为了表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目标抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)，获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并将其插入到表达载体中，使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。在上下文中，术语“可操作地连接”意思是抗体基因连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列发挥它们调节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列与使用的表达宿主细胞匹配。抗体轻链基因和抗体重链基因可被插入到分别的载体中，或者，更通常地，两个基因插入到同一表达载体中。抗体基因通过标准方法插入到表达载体中(例如，抗体基因片段上的互补限制性位点与载体连接，或者如果不存在限制性位点，则平端连接)。通过插入到已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH段与载体中的CH段可操作地连接，而VL段与载体中的CL段可操作地连接，此处描述的抗体的轻链和重链可变区能用来产生任何抗体同种型的全长抗体基因。另外，或者，重组表达载体能编码有利于宿主细胞分泌抗体链的信号肽。抗体链基因能被克隆到载体中，使得该信号肽与该抗体链基因的氨基末端在读框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因，本发明的重组表达载体还带有控制该抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调节序列例如描述于Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))。本领域技术人员应当认识到，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调节元件也可由来自不同来源的序列组成，例如SRα启动子系统，其含有来自SV40早期启动子的序列和人1型T细胞白血病病毒的长末端重复序列(Takebe，Y.等(1988)Mol.Cell.Biol.8466-472)。
除了抗体链基因和调节序列，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有利于筛选载体已经导入其中的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216，4,634,665和5,179,017，都属于Axel等人)。例如，选择性标记基因一般给其中导入载体的宿主细胞带来抗药性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞，用于氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。各种形式的术语“转染”意在包括常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。虽然理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选在真核细胞中表达抗体，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为这样的真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装和分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。据报道，抗体基因的原核表达无法高产量地产生活性抗体(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 612-13)。
用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，和DHFR选择性标记一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，用于NSO骨髓瘤细胞时，另一种优选表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达的时间，或更优选地，足以使抗体分泌到培养宿主细胞的培养基中的时间，产生抗体。可应用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
抗体与抗原结合的表征通过例如标准ELISA，可以检测本发明的抗体与IP-10的结合。简要地说，以PBS中0.25μg/ml的纯化IP-10包被微量滴定板，然后用PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。向各个孔中加入抗体的稀释液(例如，来自IP-10免疫小鼠的血浆的稀释液)，并且在37℃下温育1-2小时。培养板用PBS/Tween洗涤，之后和与碱性磷酸酶偶联的第二试剂(例如，对于人抗体，为山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起在37℃下温育1小时。洗涤后，培养板用pNPP底物(1mg/ml)显色，并且在OD405-650下分析。优选地，显示最高效价的小鼠用于融合。
如上所述的ELI SA分析也可以用来筛选表现出与IP-10免疫原有阳性反应性的杂交瘤。将与IP-10高亲合力结合的杂交瘤进行亚克隆，并且进一步表征。从每个杂交瘤中选择保留母细胞反应性的一个克隆(通过ELISA)，制备5-10小瓶细胞库，在-140℃下保存，用于抗体纯化。
为了纯化抗-IP-10抗体，在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇瓶中培养选择的杂交瘤。过滤上清液并且浓缩，然后用蛋白质A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析。通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。将缓冲溶液换成PBS，并且使用1.43的消光系数根据OD280测定浓度。将单克隆抗体分成等份并且在-80℃下保存。
为了确定选择的抗-IP-10单克隆抗体是否与独特表位结合，使用商售试剂(Pierce，Rockford，IL)将各种抗体生物素化。如上所述，使用IP-10包被的ELISA板进行应用未标记单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行的竞争研究。使用链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针检测生物素化mAb的结合。
为了确定纯化抗体的同种型，可以用对特定同种型抗体特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，在4℃下用1μg/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔过夜。用1％BSA封闭之后，平板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照物在室温下反应1-2小时。这些孔然后与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶偶联的探针反应。如上所述使平板显色并且分析。
可以通过Western印迹法进一步检测抗-IP-10人IgG与IP-10抗原的反应性。简要地说，制备IP-10并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用所检测的单克隆抗体探查。人IgG的结合可以用抗人IgG碱性磷酸酶检测，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)显色。
免疫偶联物另一方面，本发明的特征在于与治疗性部分如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素偶联的抗-IP-10抗体或其片段。这些偶联物在此称为“免疫偶联物”。包括一个或多个细胞毒素的免疫偶联物称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对(例如杀伤)细胞有害的任何试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。治疗剂还包括，例如，抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化剂(例如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，氨茴霉素类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
能与本发明抗体偶联的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin，和它们的衍生物。刺孢霉素抗体偶联物的一个例子是可商品购得的(MylotargTM；Wyeth-Ayerst)。
可以利用本领域可用的接头技术将细胞毒素与本发明的抗体偶联。已经用于将细胞毒素与抗体偶联的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择，例如，在溶酶体室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的接头，该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。
关于细胞毒素的类型，用于偶联治疗剂与抗体的接头和方法的进一步讨论，参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 31089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53247-264。
本发明的抗体也可以与放射性同位素偶联，产生细胞毒性放射性药物，也称作放射性免疫偶联物。能够与诊断或治疗性使用的抗体偶联的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。制备放射性免疫偶联物的方法在本领域中已经建立。放射性免疫偶联物的例子可以作为商品获得，包括ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，能够利用类似的方法使用本发明的抗体制备放射性免疫偶联物。
本发明的抗体偶联物可用于修饰给定的生物学反应，且药物部分不应理解为局限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可包括，例如，具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应调节物，如淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
使这种治疗性部分与抗体偶联的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies ForDrug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(编)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review”，in MonoclonalAntibodies’84Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，inMonoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。
双特异性分子另一方面，本发明的特征在于包含本发明的抗-IP-10抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可进行衍生化或连接到另一功能性分子上，如另一种肽或蛋白质(例如另一种抗体或受体的配体)上，以生成与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的抗体实际上可以进行衍生化或连接到一种以上的其他功能性分子上，以生成与两个以上不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；这样的多特异性分子也包括在此处所用的术语“双特异性分子”内。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可与一种或多种其他结合分子如其他抗体、抗体片段、肽或结合模拟物功能性连接(如通过化学偶联、遗传融合、单价结合等)，从而得到双特异性分子。
因此，本发明包括包含至少一种对IP-10的第一结合特异性和对第二种目标表位的第二结合特异性的双特异性分子。在本发明一个特定实施方案中，第二种目标表位是Fc受体，如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括既能与表达FcγR、FcαR或FcεR的效应细胞(如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))结合，又能与表达IP-10的靶细胞结合的双特异性分子。这些双特异性分子将表达IP-10的细胞导向于效应细胞，并且触发Fc受体介导的效应细胞活性，如表达IP-10的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧阴离子的产生。
在其中双特异性分子是多特异性分子的本发明的一个实施方案中，除抗-Fc结合特异性和抗-IP-10结合特异性之外，该分子可进一步包括第三结合特异性。在一个实施方案中，该第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白质结合并因而增强抗靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是与给定分子如抗原或受体结合，并因而导致结合决定簇对Fc受体或靶细胞抗原的作用增强的抗体、功能性抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可与Fc受体或靶细胞抗原结合。或者，抗增强因子部分可以与一种实体结合，该实体不同于第一和第二结合特异性所结合的实体。例如，抗增强因子部分可与细胞毒性T细胞结合(如通过导致抗靶细胞免疫应答增强的CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫细胞)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段作为结合特异性，包括如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv。抗体也可以是轻链或重链二聚体，或任何其最小片段，如Fv或单链构建体，如Ladner等人的美国专利号4,946,778所述，该专利的内容引入作为参考。
在一个实施方案中，对Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，其结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。如此处所用的，术语“IgG受体”是指位于染色体1上的8个γ-链基因的任何一个。这些基因编码总共12个跨膜或可溶性受体同种型，这些同种型分为3个Fcγ受体类型FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选实施方案中，Fcγ受体是人类高亲和力FcγRI。人类FcγRI是72kDa的分子，显示对单体IgG的高亲和力(108-109M-1)。
某些优选抗-Fcγ单克隆抗体的制备和表征由Fanger等人在PCT申请WO 88/00052和美国专利号4,954,617中描述，在此处将其教导整体引入作为参考。这些抗体在与受体的Fcγ结合位点不同的位点处与FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位结合，因而，其结合基本不被生理学水平的IgG阻断。用于本发明中的特定抗-FcγRI抗体为mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心获得，ATCC保藏号为HB9469。在另外的实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的产生和表征描述于Graziano，R.F.等(1995)J.Immunol 155(10)4996-5002和PCT公布WO 94/10332中。产生H22抗体的细胞系以HA022CL1的名称保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为CRL 11177。
在另外一些优选实施方案中，对Fc受体的结合特异性由可与人IgA受体如Fc-α受体(FcαRI(CD89))结合的抗体提供，其结合优选地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”意在包括位于染色体19上的一个α-基因的基因产物(FcαRI)。已知该基因编码几个55-110kDa的可变剪接的跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性和嗜中性粒细胞上组成型表达，但不在非效应细胞群体上组成型表达。FcαRI对IgA1和IgA2两者均具有中等亲和力(约5×107M-1)，在暴露于细胞因子如G-CSF或GM-CSF后该亲和力增加(Morton，H.C.等(1996)CriticalReviews in Immunology 16423-440)。已描述了4种FcαRI-特异性单克隆抗体，鉴定为A3、A59、A62和A77，它们在IgA配体结合结构域之外与FcαRI结合(Monteiro，R.C.等(1992)J.Immunol.1481764)。
FcαRI和FcγRI是用于本发明的双特异性分子的优选触发受体，因为它们(1)主要表达于免疫效应细胞，如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞上；(2)以高水平表达(如每个细胞5,000-100,000个)；(3)是细胞毒性活性(如ADCC、吞噬作用)的介质；(4)介导导向于它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原呈递。
优选人单克隆抗体，可在本发明的双特异性分子中使用的其他抗体是鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
本发明的双特异性分子可通过应用本领域中公知的方法偶联组分结合特异性，如抗-FcR和抗-IP-10结合特异性而制备。例如，双特异性分子的每一种结合特异性可单独生成，然后彼此偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用于共价偶联。交联剂的例子包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰-硫代乙酸盐(SATA)、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸盐(SPDP)和磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己基-1-羧酸盐(sulfo-SMCC)(参见，例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.1601686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 828648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132)；Brennan等(1985)Science 22981-83和Glennie等(1987)J.Immunol.1392367-2375所描述的方法。优选的偶联剂为SATA和sulfo-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可通过两个重链C-末端铰链区的巯基键合而偶联。在一个特别优选的实施方案中，对铰链区进行修饰以使其在偶联前含有奇数个巯基残基，优选1个。
或者，两种结合特异性可在同一载体中编码，并在相同的宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb x mAb，mAb x Fab，Fab x F(ab’)2或配体x Fab融合蛋白质时，该方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于如美国专利号5,260,203、美国专利号5,455,030、美国专利号4,881,175、美国专利号5,132,405，美国专利号5,091,513、美国专利号5,476,786、美国专利号5,013,653、美国专利号5,258,498和美国专利号5,482,858中。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(如生长抑制)或Western印迹分析进行证实。这些试验中的每一个通常通过应用对感兴趣的复合物特异性的标记试剂(如抗体)来检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，利用如识别和特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段可检测FcR-抗体复合物。或者，这些复合物可利用多种其他免疫分析来检测。例如，可对抗体进行放射性标记并且在放射免疫测定(RIA)中使用(参见，例如，Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，1986年3月，在此引入作为参考)。通过如使用γ计数器或闪烁计数器的方法或者通过放射自显影方法，能够检测放射性同位素。
药物组合物另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药物可接受的载体配制在一起的一种或组合的本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分。这样的组合物可以包含一种或组合的(例如两种或多种不同的)本发明的抗体或免疫偶联物或双特异性分子。例如，本发明的药物组合物可以含有组合的可与靶抗原上不同表位结合或具有互补活性的抗体(或免疫偶联物或双特异性剂)。
本发明的药物组合物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，联合治疗可包括本发明的抗-IP-10抗体联合至少一种其他的抗炎剂或免疫抑制剂。可在联合治疗中使用的治疗剂的例子在下面本发明抗体的应用一节中更详细地描述。
如此处所用的，“药物可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包被物、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体、免疫偶联物或双特异性分子包被于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
本发明的药物组合物可包含一种或多种药物可接受的盐。“药物可接受的盐”是指保持了亲代化合物的所需生物活性且不引起任何不想要的毒理学作用的盐(参见如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些源自非毒性无机酸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等的盐，以及源自非毒性有机酸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等的盐。碱加成盐包括那些源自碱土金属如钠、钾、镁、钙等的盐，以及源白非毒性有机胺如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的盐。
本发明的药物组合物也可含有药物可接受的抗氧化剂。药物可接受的抗氧化剂的例子包括(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明的药物组合物中的适当的含水或不含水载体的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其适当的混合物，植物油如橄榄油，和注射用有机酯如油酸乙酯。例如通过应用包被材料如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的颗粒大小，和通过应用表面活性剂，可维持适当的流动性。
这些组合物也可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述的灭菌程序或通过包含各种抗细菌和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等而确保防止存在微生物。也可能需要在组合物中包含等渗剂，例如，糖、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。
药物可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。使用这样的用于药学活性物质的介质和试剂是本领域公知的。除了任何常规介质或与活性化合物不相容的试剂范围外，包括其在本发明的药物组合物中的应用。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。
治疗组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和它们的合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。
通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和来自上面所列举的其他所需成分的灭菌载体中制备分散剂。在用于制备无菌注射液的灭菌粉末剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其前述无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量随着要治疗的受试者和特定的给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以在100％中计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药物可接受的载体相组合。
调节剂量方案，以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一大丸剂，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所指示的，剂量可以按比例减小或增加。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易施用并且配药均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为要治疗的受试者的单位剂量的物理不连续单位；每一个单位含有预定量的活性化合物，该活性化合物的量经计算与必需的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这样的用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。
对于抗体的施用，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、每3-6月一次。本发明的抗-IP-1抗体的优选剂量方案包括经静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，该抗体使用如下给药程序之一给药(i)每4周共6次，然后每3周；(ii)每3周；(iii)3mg/kg体重一次，然后每3周1mg/kg体重。
在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在该情况中，每种抗体的给药剂量落在所述范围内。抗体通常在有必要时多次施用。单次给药之间的间隔可以是，例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是不定期的，例如根据测定患者中抗靶抗原的抗体的血液水平指示进行。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。
或者，抗体可以作为持续释放制剂施用，在此情况中需要频率较低的施用。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体显示最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。施用的剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔施用相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔施用较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者显示疾病症状部分或完全改善。之后，患者可以以预防性方案施用。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可进行改变，以获得对特定患者、组合物和施用方式有效实现所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平将依赖于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。
本发明的抗-IP-1抗体的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重性降低，无疾病症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或残疾。在类风湿性关节炎(RA)的情况中，治疗有效剂量优选地防止RA相关物理症状进一步恶化，如疼痛、乏力、晨僵(持续1个小时以上)、弥漫性肌肉痛、食欲丧失、虚弱、关节痛伴温热、肿胀、触痛、不活动后关节僵直。治疗有效剂量优选地也防止或延缓RA的发病，例如在出现疾病早期或初步征兆时这可能是希望的。同样，也包括延缓RA相关的慢性进展。RA诊断中使用的实验室检测包括化学(包括IP-10水平的测定)、血液学、血清学和放射学方法。因此，监测以上所述指标的任何临床或生化试验都可以用来确定特定治疗是否是用于治疗RA的治疗有效剂量。本领域技术人员能够根据如下因素确定这种量，如受试者体重、受试者症状的严重性和选择的特定组合物或施用途径。
本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种施用途径施用。本领域技术人员应当理解，施用途径和/或方式根据期望的结果而不同。用于本发明抗体的优选施用途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如注射或输注。如此处所用的短语“肠胃外施用”是指不同于肠和局部施用的施用模式，通常通过注射，包括但不局限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，本发明的抗体也可以通过非肠胃外途径施用，如局部、表皮或粘膜途径施用，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。
活性化合物可以使用保护化合物不被快速释放的载体制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法是专利或者一般为本领域技术人员公知。参见，例如，Sustained andcontrolled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，编著，MarcelDekker，Inc.，New York，1978。
治疗组合物可应用本领域公知的医疗装置施用。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针的皮下注射装置施用，如在美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。用于本发明的公知的植入物和组件的例子包括美国专利号4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利号4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利号4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注设备；美国专利号4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统和美国专利号4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利在此引入作为参考。许多其他这样的植入物、递送系统和组件是本领域技术人员公知的。
在某些实施方案中，可配制本发明的人单克隆抗体以确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)排除了许多高亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗化合物跨过BBB(如果需要)，可将它们配制在如脂质体中。对于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体可包含一种或多种选择性地转运入特定细胞或器官内的部分，从而增强靶向的药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。靶向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233134)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.2699090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4273。
本发明的应用和方法本发明的抗体(和免疫偶联物和双特异性分子)具有许多体外和体内诊断和治疗应用。例如，可以如在体外或来自体内地对培养的细胞施用这些分子，或者在受试者中例如在体内施用，以治疗、预防或诊断多种疾病。如此处使用的，术语“受试者”意在包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类动物和爬行类动物。这些方法特别适合于治疗患有异常IP-10表达相关疾病的人类患者。当抗IP-10抗体与另一种药剂一起施用时，这两种药剂可以依次或同时施用。
在一个实施方案中，本发明的抗体(和免疫偶联物和双特异性分子)可以用于检测IP-10的水平或含有IP-10的细胞的水平。这可以如下实现，例如，在允许抗体与IP-10之间形成复合物的条件下，使样品(如体外样品)和对照样品接触抗-IP-10抗体。检测并比较样品和对照中抗体与IP-10之间形成的任何复合物。例如，能够用本发明的组合物进行本领域公知的标准检测方法，如ELISA和流式细胞分析。
因此，一方面，本发明进一步提供了检测样品中IP-10(例如人IP-10抗原)的存在或测定IP-10的量的方法，包括在允许抗体或其部分与IP-10之间形成复合物的条件下，使样品和对照样品接触可与IP-10特异性结合的本发明的抗体或其抗原结合部分。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品之间复合物形成的差异指示样品中存在IP-10。
本发明范围内还包括试剂盒，其中包括本发明的组合物(例如抗体、人抗体、免疫偶联物和双特异性分子)和使用说明。该试剂盒可以进一步包括至少一种另外的试剂，或本发明的一种或多种另外的抗体(例如，具有不同于第一抗体地与靶抗原上的表位结合的补充活性的抗体)。试剂盒一般包括指示该试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。
已知IP-10对活化的T细胞和NK细胞具有化学引诱作用，并且使这些细胞募集到炎症和自身免疫应答部位。因此，本发明的抗-IP-10抗体(和免疫偶联物和双特异性分子)可以用于抑制多种临床适应症中由活化T细胞和/或NK细胞介导的炎症或自身免疫应答。本发明因此提供了一种抑制由活化T细胞和/或NK细胞介导的炎症或自身免疫应答的方法，包括使T细胞或NK细胞接触本发明的抗体或其抗原结合部分(或本发明的免疫偶联物或双特异性分子)，使得炎症或自身免疫应答受到抑制。可以应用本发明抗体的炎症或自身免疫疾病的具体例子包括但不限于如下A.多发性硬化症和其他脱髓鞘病已经显示在多发性硬化症的一种小鼠模型——鼠实验性变应性脑脊髓炎(EAE)中，IP-10mRNA的表达提高(Godiska，R.等(1995)J.Neuroimmunol.58167476)。而且，发现在急性脱髓鞘事件过程中，MS患者的脑脊液中IP-10水平升高(Sorensen，T.L.等(1999)J.Clin.Invest.103807-815；Franciotta等(2001)J.Neuroimmunol115192-198)。也显示在MS病变中星形胶质细胞表达IP-10，但是在未累及的白质中不表达(Balashov，K.E.等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 966873-6878)，MS斑内的巨噬细胞和实质周围的星形胶质细胞表达(Simpson，J.E.等(2000)Neuropathol.Appl.Neurobiol.26133-142)。PCT专利公开WO 02/15932表明在小鼠肝炎病毒(MHV)MS模型中施用抗-IP-10抗体导致T淋巴细胞和巨噬细胞侵入减少，脱髓鞘的进展受到抑制，髓鞘再生提高，神经功能改善(参见Liu，M.T.等(2001)J.Imununol.1674091-4097)。在鼠EAE中已经证明施用鼠抗-IP-10抗体降低了临床和组织学疾病发病率和严重性(Fife，B.T.等(2001)J.Immunol.1667617-7624)。
基于以上所述，通过给需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗MS和其他脱髓鞘病。该抗体可以单独使用或与其他抗MS剂如干扰素β-1a(例如Avonex，Rebif)、干扰素β-1b(例如Betaseron)、乙酸格拉默(例如Copaxone)和/或米托蒽醌(例如Novantrone)联合使用。
B.类风湿性关节炎已经显示在类风湿性关节炎(RA)患者的滑液、滑液组织和血清中IP-10水平显著升高(Patel，D.D.等(2001)Clin.Immunol.9839-45；Hanaoka，R.等(2003)Arthritis Res.and Therapy.5R74-R81)。IP-10受体CXCR3已经证明在RA患者滑液组织内的肥大细胞上优先表达(Ruschpler，P.等(2003)Arthritis Res.Ther.5R241-R252)。在佐剂诱导的关节炎(AA)大鼠模型中，报道了对自身IP-10的可检测的自身抗体应答(Salomon，I.等(2002)J.Immunol.1692685-2693)。而且，施用编码IP-10的DNA疫苗增强了大鼠内中和抗-IP-10抗体的产生，这些IP-10自身抗体能够将对AA的抗性过继转移给幼稚大鼠(Salomon，I.等，同上文)。
基于以上所述，通过给需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗类风湿性关节炎。该抗体可以单独使用或与其他抗RA剂联合使用，其他抗RA剂例如非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛药、皮质激素(例如泼尼松、氢化可的松)、TNF抑制剂(包括adilimumab(Humira)、依那西普(Enbrel)和英夫利昔单抗(Remicade)、缓解疾病的抗风湿性药物(包括氨甲喋呤、环磷酰胺、环孢霉素A、金诺芬、硫唑嘌呤、硫代苹果酸金钠、硫酸羟氯喹、来氟米特、米诺环素、青霉胺和柳氮磺吡啶)、纤维肌痛药、骨质疏松症药和痛风药。
C.炎性肠病已经显示在取自溃疡性结肠炎患者的结肠活检组织中浸润固有层的细胞中IP-10的表达显著提高(Uguccioni，M.等(1999)Am.J.Pathol.155331-336)。此外，已经证明IP-10的中和能保护小鼠在急性结肠炎时不患上皮溃疡，并且提高滤泡细胞的存活率(Sasaki，S.等(2002)Eur.J.Immunol.323197-3205)。另外，在发生类似于人克罗恩病的结肠炎的IL-10-/-小鼠中，用抗-IP-10抗体处理导致炎症的得分改善(Singh，U.P.等(2003)J.Immunol.1711401-1406)。
基于以上所述，通过给需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗炎性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。该抗体可以单独使用或与其他抗IBD剂联合使用，其他抗IBD剂例如含美沙拉秦的药物(包括柳氮磺吡啶和其他含5-氨基水杨酸(5-ASA)的药物，如奥沙拉秦和巴柳氮)，非甾体抗炎药(NSAIDs)，镇痛药，皮质激素(例如泼尼松、氢化可的松)，TNF抑制剂(包括adilimumab(Humira)、依那西普(Enbrel)和英夫利昔单抗(Remicade)，免疫抑制剂(如6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤和环胞素A)和抗生素。
D.系统性红斑狼疮已经显示系统性红斑狼疮(SLE)患者中血清IP-10水平明显升高，而且该水平与疾病活动度相关(参见，例如Narumi，S.等(2000)Cytokine121561-1565)。因此，在另一实施方案中，通过给需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗SLE。该抗体可以单独使用或与其他抗SLE剂联合使用，其他抗SLE剂例如非甾体抗炎药(NSAIDs)，镇痛药，皮质激素(例如泼尼松、氢化可的松)，免疫抑制剂(如环磷酰胺、硫唑嘌呤和氨甲喋呤)，抗疟药(如羟氯喹)和抑制dsDNA抗体产生的生物药物(例如LJP 394)。
E.I型糖尿病已经显示在I型糖尿病患者中，特别是在新近发病的患者中，血清IP-10水平升高，而且该水平与GAD自身抗体阳性患者中GAD-反应性产γ-干扰素T细胞的数量相关(Shimada，A.等(2001)Diabetes Care24510-515)。在一项单独的研究中，发现在新诊断的该病患者中和该病高危患者中血清IP-10水平升高，而且IP-10浓度与IFN-γ水平相关(Nicoletti，F.等(2002)Diabetologia 451107-1110)。而且，已经证明β细胞分泌IP-10，导致T细胞的化学引诱，并且证明CXCR3缺陷小鼠中I型糖尿病的发病延迟(Frigerio，S.等(2002)Nature Medicine81414-1420)。
因此，在另一实施方案中，通过给需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗I型糖尿病。该抗体可以单独使用或与其他抗糖尿病药如胰岛素联合使用。
F.炎性皮肤病已经显示IP-10的表达与多种炎性皮肤病有关。例如，已经在活动性牛皮癣斑的角质形成细胞和真皮浸润物中检测到IP-10(Gottlieb，A.B.等(1988)J.Exp.Med.168941-948)。另外，真皮CD3+淋巴细胞表达CXCR3，提示CXCR3参与T淋巴细胞向牛皮癣真皮的运送(Rottman，J.B.等(2001)Lab.Invest.81335-347)。因此，在另一实施方案中，通过给需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗牛皮癣。该抗体可以单独使用或与其他药物或治疗联合使用，例如局部治疗(例如类固醇、煤焦油、卡泊三烯、他佐罗汀、地蒽酚、水杨酸)，光疗，全身药物治疗(例如氨甲喋呤、口服类视黄醇、环孢霉素A、富马酸酯)，和/或生物药物(例如alefacept，efalizumab)。
扁平苔藓是皮肤和口腔粘膜的一种慢性炎性疾病，已经证明它与浸润的表达CXCR3的CD4+和CD8+T细胞有关，而且CD8+浸润的溶细胞性T细胞在其溶细胞颗粒中含有IP-10，并且病变角质形成细胞过量表达IP-10(Iijima，W.等(2003)Am.J.Pathol.163261-268)。因此，在另一实施方案中，通过给需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗扁平苔藓。该抗体可以单独使用或与其他药物或治疗例如抗炎药、抗组胺类、皮质激素和光疗联合使用。
已经显示在其他炎性皮肤病如慢性盘状红斑性狼疮和Jessner皮肤淋巴细胞浸润中IP-10表达升高(Flier，J.等(2001)J.Pathol.194398-405)。因此，通过给需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗这些炎性皮肤病。如上所述，该抗体可以单独使用或与其他药物或治疗联合使用。
G.自身免疫性甲状腺病已经显示在格雷夫斯病(GD)患者的甲状腺中IP-10和CXCR3均表达，但是在正常甲状腺组织中不表达(或较低表达)；新近发病的GD患者中表达最高(Romagnani，P.等(Am.J.Pathol.161195-206)。在桥本氏甲状腺炎患者的甲状腺组织中也显示IP-10表达(Kemp，E.H.等(2003)Clin.Endocrinol.59207-213)。因此，在另一实施方案中，通过给需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗自身免疫性甲状腺病，包括格雷夫斯病和桥本氏甲状腺炎。该抗体可以单独使用或与其他药物或治疗例如抗甲状腺药、放射性碘和甲状腺次全切除术联合使用。
H.舍格伦综合征已经显示在舍格伦综合征(SS)患者的唾液腺中IP-10mRNA的表达显著增量调节，在与淋巴浸润物相邻的导管上皮中表达最突出(参见，例如，Ogawa，N.等(2002)Arthritis Rheum.462730-2741)。因此，在另一实施方案中，通过给需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗舍格伦综合征。该抗体可以单独使用或与其他抗SS药物联合使用，其他抗SS药物例如人工润滑剂(例如不含防腐剂的人工泪液、人工唾液、没有气味的皮肤洗剂、盐水鼻腔喷剂和阴道润滑剂)，用于治疗干眼症的Lacristerts，用于治疗口干燥的盐酸匹罗卡品(Salagen)和ceyimeline(Eyoxac)，非甾体抗炎病(NSAIDs)，类固醇和免疫抑制药。
I.肺炎症在变应性哮喘小鼠模型中已经检测到IP-10的表达，结果证明在变应原攻击后肺中的IP-10增量调节，并且IP-10的过量表达与气道活动过度提高、嗜酸粒细胞增多、IL-4水平升高和CD8+淋巴细胞募集有关(Medoff，B.D.等(2002)J.Immunol.1685278-5286)。另外，已经显示发展慢性阻塞性肺病(COPD)的吸烟者在细支气管上皮中表达IP-10(Saetta，.M.等(2002)Am.J.Respir.Crit.Care Med.1651404-1409)。另外，已经证明在肺结节病和淋巴细胞肺泡炎患者的支气管肺泡灌洗液和中有高水平的IP-10(Agostini，C.等(1998)J.Immunol.1616413-6420)。
因此，在另一实施方案中，通过给需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗特征在于肺炎症的疾病，如哮喘、COPD、肺结节病或淋巴细胞肺泡炎。该抗体可以单独使用或与其他减轻肺炎症的药物联合使用，这些其他药物如色甘酸钠、奈多罗米钠、吸入皮质激素、系统(例如口服)皮质激素、短效β拮抗剂、短效支气管扩张剂、长效β拮抗剂或激动剂(口服或吸入)、白三烯调节剂、茶碱和氧疗。
J.移植排斥已经显示IP-10在移植组织排斥中起作用。例如，用中和抗IP-10抗体处理小鼠提高了小肠同种异体移植物的存活率并且减少了固有层中宿主T细胞和NK细胞的积累(Zhang，Z.等(2002)J.Immunol.1683205-3212)。此外，在接受胰岛异体移植的小鼠中，抗-IP-10抗体处理也导致异体移植物存活率提高，而淋巴细胞移植物浸润降低(Baker，M.S.等(2003)Surgery 134126-133)。另外，心脏异体移植物，而不是正常心脏，显示表达IP-10和CXCR3，并且升高的IP-10水平与心脏异体移植物的血管病变有关(Zhao，D.X.等(2002)J Immunol.1691556-1560)。CXCR3和IP-10也显示由浸润肺异体移植物的炎症细胞表达(Agostini，C.等(2001)Am.J.Pathol.1581703-1711)。在鼠肺移植模型中显示，CXCR3或IP-10的体内中和缓解了梗阻性细支气管炎综合征(BOS)，后者是肺移植接受者存活的主要限制因素(Belperio J.A.等(2002)J.Immunol.1691037-1049)。
基于以上所述，本发明还提供一种通过向需要治疗的移植接受者施用本发明的IP-10抗体而抑制移植排斥的方法。可以治疗的组织移植物的例子包括但不限于肝、肺(例如BOS的治疗)、肾、心脏、小肠和胰岛细胞。该抗体可以单独使用或与其他抑制移植排斥的药物联合使用，这些其他药物如免疫抑制剂(例如，环孢霉素A、硫唑嘌呤、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、霉酚酸酯、西罗莫司、雷帕霉素、他克莫司)，抗感染剂(例如，阿昔洛韦、克霉唑、更昔洛韦、制霉菌素、甲氧苄氨嘧啶磺胺甲基异噁唑)，利尿剂(例如布美他尼、呋塞米、美托拉宗)和溃疡药物(例如西咪替丁、法莫替丁、兰索拉唑、奥美拉唑、雷尼替丁、硫糖铝)。
K.脊髓损伤脊髓的挫伤导致炎症细胞的浸润。已经证明IP-10在脊髓损伤后的继发性变性中起关键作用(Gonzalez等(2003)Exp.Neurol.184456-463；参见PCT专利公布WO 03/06045)。已经显示在损伤6和12小时后的挫伤大鼠脊髓中(McTigue，D.M.等(1998)J.Neurosci.Res.53368-376)和损伤6小时后的损伤小鼠脊髓中(Gonzalez等(2003)，同上文)，IP-10显著升高。因此，脊髓损伤后IP-10活性的抑制已经表明可用于减轻炎症细胞浸润，从而减轻炎症的继发组织损伤。这种抑制也可以减轻炎症细胞的浸润，减少继发变性，改善外伤性脑损伤和中风后的恢复。因此，本发明还提供一种对需要治疗的受试者治疗脊髓损伤和脑损伤(例如中风)的方法，包括对该受试者施用本发明的抗-IP-10抗体。该抗体可以单独使用或与其他药物如其他抗炎剂联合使用。
L.神经变性疾病已经发现与阿尔茨海默病(AD)相关病理学改变相关地，中枢神经系统内IP-10和CXCR3的表达增量调节(Xia，M.Q.和Hyman，D.T.(1999)J.Neurovirol.532-41)。在AD脑内，CXCR3显示在各个皮质和皮质下区域中的神经元和神经元病变中组成型表达，IP-10在星形胶质细胞中表达，与正常脑相比其水平显示升高(Xia，M.Q等(2000)J.Neuroimmunol.108227-235)。因此，通过给需要治疗的受试者单独施用或与其他治疗剂联合施用抗IP-10抗体，本发明的抗体可以用于治疗神经变性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病。可以与抗-IP-10抗体联合用于阿尔茨海默病治疗的药物的例子包括胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐、利凡斯的明、加兰他敏、他克林)和维生素E。可以与抗-IP-10抗体联合用于帕金森病治疗的药物的一个例子是左旋多巴。
M.龈炎边缘性牙周炎与牙龈组织发炎有关。在发炎的人牙龈组织中已经发现产生IP-10的细胞，以及表达CXCR3受体的细胞(Kabashima，H.等(2002)Cytokine 2070-77)。因此，在另一实施方案中，通过给需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗龈炎。该抗体可以单独使用或与其他药物或治疗，如抗龈炎漱口剂(例如抗生素漱口剂)、牙周刮治和根面平整术和牙周手术联合使用。
N.基因治疗相关的炎症在基因治疗中用作腺病毒载体的复制缺陷型腺病毒能够在病毒载体感染的组织中引起急性损伤和炎症。已经证明这些腺病毒载体通过依赖衣壳的NFkB活化来诱导IP-10的表达(Borgland，S.L.等(2000)J.Virol.743941-3947)。因此，本发明的抗-IP-10抗体可以用于抑制在使用病毒载体如腺病毒载体(它刺激不希望的IP-10的产生)的基因治疗过程中IP-10诱导的损伤和/或炎症。
O.血管发生的疾病已经显示IP-10在体外和体内抑制血管发生(Strieter等(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.21051-57；Angiolillo等(1995)J.Exp.Med.182155-162；Luster等(1995)J.Exp.Med.182219-231)。血管发生在许多疾病过程如创伤愈合反应中起关键作用。例如，损伤的脊髓中的脉管系统保持活跃重塑(remodeling)的状态，直到损伤后至少28天(Popovich等(1997)J.Comp.Neurol.377443-464)。
IP-10被认为是通过抑制内皮细胞生长和趋化性发挥其血管抑制作用。这是通过其肝素结合基序以及通过受体介导的机制实现的。通过肝素结合基序，它防止生血管因子FGF-2和VEFG165与它们的受体结合。它也通过受体介导的过程发挥作用。IP-10的受体CXCR3经选择剪切，产生两种已知的变体CXCR3A和CXCR3B。IP-10与CXCR3A受体的结合导致靶细胞的增殖和趋化性，而IP-10与CXCR3B受体的结合具有抑制生长和趋化性的相反的作用。IP-10通过CXCR3B受体作为血管抑制因子起作用(Lasagni等(2003)J.Exp.Med.1971537-1549)。
基于以上所述，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗需要血管生成的疾病，例如，IP-10的血管抑制行为延迟或阻止了愈合及加剧疾病过程的情形。这样的疾病包括1)异常生理性新血管形成，它可影响创伤愈合、雌性动情周期、妊娠、锻炼诱发的肥大等；2)可能需要新血管形成刺激的适应症，包括侧副管形成的诱导(包括心肌缺血、外周局部缺血、脑缺血)，冠状动脉疾病，周围血管疾病，中风，创伤愈合，器官移植如胰岛细胞移植后移植物移入，骨折和肌腱康复，整形外科手术，组织工程，再狭窄，脱发，褥疮和淤积性溃疡，胃肠溃疡，胎盘功能不全，无菌性坏死，肺动脉高压和系统性高血压，血管性痴呆，阿尔茨海默病，脑常染色体显性动脉病伴皮质下梗死和脑白质病(CADASIL)；甲状腺假肿和淋巴管性水肿；和3)可能需要血管重塑的适应症，包括血管畸形、牛皮癣和先兆子痫。本发明的抗体可以单独使用或者与其他血管发生诱导剂联合使用。
P.炎性肾病已报道IgA肾病、膜性增生性肾小球肾炎或急进性肾小球性肾炎患者的肾小球膜细胞表达CXCR3受体(Romagnani，P.等(1999)J.Am.Soc.Nephrol.102518-2526)。此外，在肾毒性肾炎的小鼠模型中，肾炎诱发7天后在肾炎肾皮质中IP-10mRNA水平升高6倍(Schadde，E.等(2000)Nephrol.Dial.Transplant.151046-1053)。另外，在肾小球肾炎病人的肾活检标本中观察到与正常肾相比高水平的IP-10表达(Romagnani，P.等(2002)J.Am.Soc.Nephrol.1353-64)。因此，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗炎性肾病，包括IgA肾病、膜性增生性肾小球肾炎和急进性肾小球性肾炎。本发明的抗体可以单独使用或与肾小球肾炎治疗中使用的其他药物或治疗如抗生素、利尿剂、高血压药物治疗和透析联合使用。
Q.动脉粥样硬化IP-10已经证明是血管平滑肌的促有丝分裂和趋化因子，这是平滑肌细胞引起动脉粥样硬化发病机理的一个重要特征(Wang，X.等(1996)J.Biol.Chem.27124286-24293)。也显示IP-10在LPS或干扰素γ处理后在平滑肌细胞中诱导，也在气囊血管成形术后在大鼠颈动脉中诱导(Wang，X.等(1996)，同上文)。此外，已经证明IP-10在粥样斑相关内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞中表达，提示IP-10在活化T细胞募集和保留中的作用，该现象已经在动脉粥样硬化形成过程中在血管壁病变中观察到(Mach，F.等(1999)J.Clin.Invest.1041041-1050)。因此，本发明的抗IP-10抗体可用于治疗或预防动脉粥样硬化。该抗体可以单独使用或与动脉粥样硬化治疗中使用的其他药物或治疗如高血压药物和降胆固醇药联合使用。
R.病毒感染在各种病毒感染中IP-10可能增量调节，并且在募集活化T细胞对抗病毒感染中可能起有益作用。但是在某些情况中，病毒感染过程中IP-10的产生可能导致不利的作用，因此IP-10活性可能是不希望的，可以利用本发明的抗-IP-10抗体在这些病毒感染中抑制IP-10活性。
例如，已经显示IP-10刺激人类免疫缺陷病毒(HIV)在单核细胞来源的巨噬细胞和外周血淋巴细胞中的复制(Lane，B.R.等(2003)Virology 307122-134)。而且，在HIV感染患者的脑脊液和脑中，以及在HIV gp120-转基因小鼠的中枢神经系统中，IP-10水平升高(Asensio，V.C.等(2001)J.Virol.757067-7077)。
在慢性迁延性丙型肝炎(HCV)患者和慢性活动性肝炎患者中也显示IP-10水平升高(Narumi，S.等(1997)J.Immunol.1585536-5544)。在HCV感染的肝中，显示肝细胞表达IP-10，但是肝内的其他细胞型不表达IP-10，与血液相比，在肝中发现显著较高比例的CXCR3阳性T细胞(Harvey，C.E.等(2003)J Leukoc.Biol.74360-369)。
在小鼠中已经显示IP-10分泌增多与对急性眼I型单纯疱疹病毒(HSV-1)感染的炎症应答有关，用抗-IP-10抗体治疗HSV-1感染的小鼠显示减少了单核细胞向角膜基质的浸润，减轻了角膜病理，并且抑制了急性感染过程中病毒从角膜基质向视网膜的进展(Carr，D.J.等(2003)JVirol.7710037-10046)。
也显示IP-10在病毒性脑膜炎中表达。证明IP-10存在于病毒性脑膜炎患者的CSF中，引起对嗜中性粒细胞、外周血单核细胞和活化T细胞的趋化活性(Lahrtz，F.等(1997)Eur.J Immunol.272484-2489；Lahrtz，F.等(1998)J.Neuroimmunol.8533-43)。
基于以上所述，通过向需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可以用于治疗与不希望的IP-10活性有关的病毒感染。可以治疗的病毒感染的非限制性例子包括HIV(例如HIV-诱发的脑炎)、HCV、HSV-1、病毒性脑膜炎和重度急性呼吸综合征(SARS)。该抗体可以单独使用或与其他抗病毒剂联合使用，其他抗病毒剂例如，用于HIV感染的核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和/或蛋白酶抑制剂(和它们的组合)，用于HCV感染的干扰素α2a、PEG化的干扰素α2a和/或利巴韦林，和用于HSV-1感染的阿昔洛韦、伐昔洛韦和/或泛昔洛韦。
S.细菌感染细菌感染诱导累及的细胞产生IP-10(参见Gasper，N.A.等(2002)Infect Immun.704075-82)。特别是已知细菌性脑膜炎也引起IP-10表达(Lapinet，J.A.等(2000)Infect Immun.686917-23)。在细菌感染模型中，曲细精管的睾丸体细胞也产生IP-10，强烈提示这些趋化因子在睾丸炎症过程中的嗜中性粒细胞和T淋巴细胞积累中可能起作用，该现象传统上在细菌感染的发病机制中观察到(Aubry，F.等(2000)Eur Cytokine Netw.11690-8)。
基于以上所述，通过向需要治疗的受试者施用抗体，本发明的抗-IP-10抗体可用于治疗与不希望的IP-10活性有关的细菌感染。细菌感染的例子包括但不限于细菌性脑膜炎和细菌性肺炎。该抗体可以单独使用或与其他抗菌剂如抗生素联合使用。
本发明进一步通过下面的实施例进行阐述，不应将该实施例理解为进一步的限制。全部附图和在本申请中引用的全部参考文献、专利和公开专利申请的内容均引用作为参考。
实施例1抗IP-10人单克隆抗体的产生抗原纯化的源自大肠杆菌的重组人IP10(PeproTech，Inc.，目录号300-12)或与匙孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联的纯化的重组人IP10用作抗原。
转基因HuMab和KM小鼠用HuMab转基因小鼠的HCo7、HCo12和HCo17株和转基因转染色体小鼠的KM株制备抗人IP10的完全人单克隆抗体，它们均表达人抗体基因。在这些小鼠株的每一个中，已经如Chen等(1993)EMBOJ.12811-820所述将内源小鼠κ轻链基因纯合地破坏，并且已经如PCT公布WO 01/09187的实施例1所述将内源小鼠重链基因纯合地破坏。这些小鼠株的每一个都携带人κ轻链转基因KCo5，如Fishwild等(1996)Nature Biotechnology 14845-851所述。HCo7株携带HCo7人重链转基因，如美国专利号5,545,806；5,625,825；和5,545,807所述。HCo12株携带HCo12人重链转基因，如PCT公布WO 01/09187的实施例2所述。HCo17株携带HCo17人重链转基因，如下面的实施例8所述。KM株含有SC20转染色体，如PCT公布WO 02/43478所述。
HuMab和KM的免疫为了生成抗IP-10的完全人单克隆抗体，用纯化的来自大肠杆菌的重组IP10或IP10-KLH偶联物作为抗原免疫HuMab小鼠和KM小鼠。用于HuMab小鼠的一般性免疫方案由Lonberg，N.等(1994)Nature368(6474)856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology14845-851和WO 98/24884描述。在第一次输注抗原时小鼠为6-16周龄。利用纯化的IP-10抗原重组制剂(5-50μg)(例如从表达IP-10的转染大肠杆菌细胞中纯化的)腹膜内、皮下(Sc)或通过足垫注射免疫HuMab小鼠和KM小鼠。
转基因小鼠用完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原腹膜内(IP)、皮下(Sc)或通过足垫(FP)免疫两次，然后用不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原IP、Sc或FP免疫3-21天(最多可达总共11次免疫)。通过眶后采血监测免疫应答。通过ELISA对血浆进行筛选(如下文所述)，具有足够的抗-IP10人免疫球蛋白效价的小鼠用于进行融合。在处死和取出脾之前3天和2天时，用抗原通过静脉内对小鼠进行加强免疫。一般对每一种抗原进行10-35次融合。每种抗原对几十只小鼠进行免疫。总共82只HCo7、HCo12、HCo17和KM小鼠株用IP10免疫。
产生抗-IP1-抗体的HuMab或KM小鼠的选择为了选择产生可与IP10结合的抗体的HuMab或KM小鼠，如Fishwild，D.等(1996)所述通过ELISA检测来自接受免疫的小鼠的血清。简要地说，用纯化的来自大肠杆菌的重组IP10，在PBS中以1-2μg/ml的浓度，50μl/孔的量，包被微量滴定板，4℃下温育过夜，然后用200μl/孔的在PBS/Tween(0.05％)中的5％鸡血清封闭。将来自IP10免疫的小鼠的血浆的稀释液加入各孔中，室温下温育1-2小时。培养板用PBS/Tween洗涤，然后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人IgG Fc多克隆抗体在室温下温育1小时。洗涤后，培养板用ABTS底物(Sigma，A-1888，0.22mg/ml)显色，并用分光光度计在OD 415-495处分析。显示最高抗-IP10抗体效价的小鼠用于进行融合。融合如下文所述进行，通过ELISA检测杂交瘤上清液的抗-IP10活性。
产生抗IP10人单克隆抗体的杂交瘤的产生根据标准规程，用PEG将从HuMab小鼠和KM小鼠中分离的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后根据抗原特异性抗体的产生筛选获得的杂交瘤。使用50％PEG(Sigma)将来自接受免疫的小鼠的脾淋巴细胞单细胞悬液与1/4数量的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)融合。将细胞以约1×105/孔的密度平板接种于平底微量滴定板上，然后在选择性培养基中温育约两周，该培养基含有10％胎牛血清、10％P388D1(ATCC，CRL TIB-63)条件介质、3-5％于DMEM(Mediatech，CRL 10013，含高浓度葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)中的origen(IGEN)、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma，CRLP-7185)。1-2周后，将细胞培养于用HT替代了其中的HAT的培养基中。然后通过ELISA(如上所述)对各个孔进行人抗IP10单克隆IgG抗体的筛选。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天后监测培养基。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，并且如果对于人IgG抗-IP10单克隆抗体仍然是阳性，则通过有限稀释亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生小量的抗体用于进一步表征。
选择杂交瘤克隆1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A12和13C4用于进一步的分析。
实施例2抗IP-10人单克隆抗体的结构表征编码1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、6B10、7C10、8F6、10A 12和13C4单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列利用标准PCR技术从相应的杂交瘤获得，并利用标准DNA测序技术进行测序。在单独的DNA测序不足以明确确定抗体结构的情况下，也进行蛋白质分析(例如N-末端氨基酸分析和质谱分析)，并将其结果与DNA序列分析进行比较，从而确定正确的抗体结构。结构分析结果如下1D4的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1A和SEQ ID NO99和35中。1D4的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1B和SEQ ID NO110和84中。
1E1的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2A和SEQ ID NO100和36中。1E1的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2B和SEQ ID NO111和85中。
2G1的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图3A和SEQ ID NO101和37中。2G1的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图3B和SEQ ID NO112和86中。
3C4的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图4A和SEQ ID NO102和38中。3C4的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图4B和SEQ ID NO113和87中。
6A5的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图5A和SEQ ID NO103和39中。6A5的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图5B和SEQ ID NO114和88中。
6A8的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图6A和SEQ ID NO104和40中。6A8的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图6B和SEQ ID NO115和89中。
6B10的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图7A和SEQ ID NO105和41中。6B10的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图7B和SEQ ID NO116和90中。
7C10的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图8A和SEQ ID NO106和42中。7C10的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图8B和SEQ ID NO117和91中。
8F6的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图9A和SEQ ID NO107和43中。8F6的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图9B和SEQ ID NO118和92中。
10A12的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图10A和SEQ ID NO108和44中。10A12的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图10B和SEQ ID NO119和93中。
13C4的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图11A和SEQ ID NO109和46中。13C4的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图11B和SEQ ID NO120和94中。
1D4、1E1、2G1、6A5、6A8、7C10和10A12重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，这些抗体重链应用了来自人种系VH3-33的VH段。1D4、1E1、2G1、6A5、6A8、7C10和10A12 VH序列与种系VH3-33序列(SEQ ID NO47)的比对显示于图12中。利用Kabat CDR区测定系统对1D4、1E1、2G1、6A5、6A8、7C10和10A12VH序列的进一步分析划出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图1A、2A、3A、5A、6A、8A和10A所示。
6B10和8F6重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，这些抗体重链应用了来自人种系VH3-30.3的VH段。6B10和8F6VH序列与种系VH3-30.3序列(SEQ ID NO48)的比对显示于图13中。利用Kabat CDR区测定系统对6B10和8F6VH序列的进一步分析划出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图7A和9A所示。
3C4重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，该抗体重链应用了来自人种系VH5-51的VH段。3C4 VH序列与种系VH5-51序列(SEQ ID NO49)的比对显示于图14中。利用Kabat CDR区测定系统对3C4VH序列的进一步分析划出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，如图4A所示。
13C4重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，该抗体重链应用了来自人种系VH4-61的VH段。13C4 VH序列与种系VH4-61序列(SEQ ID NO50)的比对显示于图15中。利用Kabat CDR区测定系统对13C4VH序列的进一步分析划出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，如图11A所示。
1D4、2G1、6A5、6A8、10A12和13C4轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，这些抗体轻链应用了来自人种系VkA27的VL段。1D4、2G1、6A5、6A8、10A12和13C4VL序列与种系VkA27序列(SEQ ID NO95)的比对显示于图16中。利用Kabat CDR区测定系统对1D4、2G1、6A5、6A8、10A12和13C4VL序列的进一步分析划出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图1B、3B、5B、6B、10B和11B所示。
1E1、6B10和8F6轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，这些抗体轻链应用了来自人种系VkL6的VL段。1E1、6B10和8F6VL序列与种系VkL6序列(SEQ ID NO96)的比对显示于图17中。利用Kabat CDR区测定系统对1E1、6B10和8F6VL序列的进一步分析划出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图2B、7B和9B所示。
3C4轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，3C4轻链应用了来自人种系VkL18的VL段。3C4VL序列与种系VkL18序列(SEQ ID NO97)的比对显示于图18中。利用Kabat CDR区测定系统对3C4VL序列的进一步分析划出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，如图4B所示。
7C10轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，7C10轻链应用了来自人种系VkL15的VL片段。7C10 VL序列与种系VkL15序列(SEQ ID NO98)的比对显示于图19中。利用Kabat CDR区测定系统对7C10 VL序列的进一步分析划出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，如图8B所示。
实施例3抗-IP-10人单克隆抗体的结合特异性和结合动力学的表征在该实施例中，通过Biacore分析检测抗-IP-10抗体的结合亲和力、结合动力学和结合特异性。另外，通过ELISA检测结合特异性和交叉竞争。
Biacore分析通过Biacore分析(Biacore AB，Uppsala，瑞典)表征抗-IP-10抗体的亲和力和结合动力学。使用Biacore AB提供的EDC/NHS偶联方案，将大肠杆菌表达的、纯化的重组人IP-10(R&D Systems)与CM5传感器芯片@97RU偶联。使HBS EP缓冲液(Biacore AB提供)中浓度为33-267nM的抗体以40μl/min的流速流过，来检测结合。检测抗原-抗体结合动力学5分钟，解离动力学8分钟。用BAIevaluation软件(BiacoreAB)将结合和解离曲线与1∶1Langmuir结合模型进行拟合。曲线拟合仅考虑对应于结合和解离阶段最初几十秒的数据，以使亲合力的影响最小化。该实验在25℃和37℃下均进行。对25℃结合测定的KD、kon和koff值显示在表1中，37℃结合的结果显示在表2中表125℃时与人IP-10的结合特征

*6A5第2批是从6A5杂交瘤上清液中纯化的与样品6A5相比独立的抗体样品。
表237℃时与人IP-10的结合特征

在25℃和37℃下测定抗体的半衰期(单位为小时)，其定义为在解离阶段一半抗体-抗原复合物解离所用的时间。通过延长解离曲线达到解离传感图Y轴50％减少所需的时间，确定该值。结果显示在下面的表3中表325℃和37℃时抗体的半衰期

使用与以上对于人IP-10所述相同的方法，通过Biacore分析测定25℃时这些抗体与恒河猴IP-10、人MIG、人ITAC和小鼠IP-10的交叉反应性。人MIG、人IP-10和小鼠IP-10作为商品获得(PeproTech，RockyHill，NJ)，而恒河猴IP-10通过重组表达制备，并且通过标准方法纯化。抗原与CM5传感器芯片@140RUs(恒河猴IP-10)、457RUs(人MIG)、206RUs(人ITAC)和150RUs(小鼠IP-10)偶联。通过使HBS EP缓冲液中浓度为133nM的抗体流动5分钟获得结合传感图。然后停止流动，监测解离5分钟。用BAIevaluation软件(Biacore AB)将结合和解离曲线与Langmuir结合模型进行拟合。交叉反应性实验的结果总结在下面的表4中表4抗-IP-10与各种CXCR3配体的交叉反应性


ELISA分析应用ELISA测定进行另外的实验，来检测抗-IP-10抗体对于人MIG、恒河猴IP-10或小鼠IP-10的抗原交叉反应性。用于ELISA的程序如以上实施例1中所述，不同之处在于微量滴定板是用1μg/ml重组人IP-10、人MIG(PeproTech，目录号300-26)、小鼠IP-10(PeproTech，目录号250-16)或重组恒河猴IP-10包被。结果表示为EC50值(单位为ng/ml)，总结在下面的表5中表5经ELISA测定的抗-IP-10与各种CXCR3配体的交叉反应性

也用生物素化形式的6A5和2G1通过ELISA进行各种抗-IP-10抗体之间的交叉竞争研究，以确定这些抗体是否识别IP-10上的不同表位。竞争性ELISA的程序类似于以上实施例1中所述的ELISA。简要地说，用纯化的来自大肠杆菌的重组IP-10在PBS中以0.2μg/ml的浓度包被微量滴定板，50μl/孔，并在4℃下温育过夜。然后用200μl/孔在PBS/Tween(0.05％)中的5％鸡血清封闭这些孔。向每孔中加入纯化的人抗人IP-10抗体的稀释液(从2μg/ml至3.91ng/ml)，在室温下温育30分钟。用PBS/Tween洗板，然后与0.1μg/ml生物素-6A5或生物素-2G1温育30分钟。用PBS/Tween洗板3次。洗涤后，向每孔中加入用5％鸡血清1∶2000稀释的磷酸酶标记的链霉抗生物素(KPL，目录号15-30-00)，并在室温下温育1小时。洗涤后，培养板用p-NPP底物(Moss，Inc，批号10274021)显色，并用分光光度计在OD405下分析。如预期的，未标记的2G1能够与生物素-2G1竞争结合IP-10，而且，未标记的6A5、7C10、10A12、10A12S、6B10、8F6和1D4都能够竞争生物素-2G1与人IP-10的结合。同样，未标记的的6A5能够与生物素-6A5竞争结合IP-10，而且，未标记的2G1、7C10、10A12、10A12S、6B10、8F6和1D4都能够竞争生物素-6A5与人IP-10的结合。这些结果表示，这些抗体中的每一个都具有对人IP-10的相同表位(或表位组)的结合特异性。
实施例4IP-10与CXCR3结合的抑制在该实施例中，检测了抗-IP-10抗体抑制人IP-10与其受体CXCR3在受体表达细胞上结合的能力。首先，对125I-IP-10与经转染表达CXCR3的300.19细胞的结合进行Scatchard分析。细胞在含有10％FCS和G418选择剂的RPMI培养基中生长。使用前，细胞在4℃下用Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次，调节为4×107细胞/ml。实验前一天，用200μl 0.1％聚乙烯亚胺溶液封闭玻璃纤维板(Millipore MultiScreen，目录号MAFBN0B50)。在研究当天，使用Millipore多支管吸出封闭缓冲液。用200μl结合缓冲液(50mMHEPES，pH 7.2，1mM CaCl2，5mM MgCl2，0.5％BSA)洗板3次。向每孔中加入25μl结合缓冲液，接着加入25μl 1000倍过量的未标记的IP-10或结合缓冲液。加入浓度逐渐增加的25μl125I-IP-10(Amersham，目录号IM332-25μCi)，接着以1×106细胞/孔的密度加入25μl细胞。培养板在平板摇床上室温温育60分钟，用洗涤缓冲液(10mM HEPES，pH 7.2，0.5M NaCl，0.5％BSA)以每次洗涤200μl的体积洗涤3次。干燥培养板，加入25μl闪烁液，在Wallac Microbeta计数器上对该培养板进行计数。数据用Prism软件分析，计算KD。对于受体结合测得平均KD为0.231。
然后，检测抗-IP-10抗体抑制100pM125I-hIP-10与表达CXCR3的细胞结合的能力。竞争测定以类似于以上所述实验的方法进行。简要地说，向玻璃纤维滤板上加入25μl结合缓冲液，接着加入25μl浓度逐渐增加的抗-IP-10抗体。加入25μl125I-IP-10，至终浓度为0.100nM。最后，以1×106细胞/孔的密度加入25μl细胞，培养板在平板摇床上室温温育60分钟，如上所述洗涤并计数。用Prism软件计算EC50值。Ki值(单位为nM)用以下公式确定Ki＝EC501+[L]/KD结果总结在下面的表6中表6IP-10与CXCR3结合的抑制

实施例5IP-10诱导的钙流的抑制在该实施例中，使用经转染表达CXCR3的300.19细胞或抗-CD3活化的表达CXCR3的人外周血淋巴细胞(PBL)检测抗-IP-10抗体抑制IP-10诱导的钙流的能力。为了制备PBL，用标准Ficoll分离法纯化正常人血液。通过将细胞加入以3μg/ml抗-CD3抗体包被的培养板中并且在含10％FBS的RPMI中生长，刺激纯化的人PBL。温育3天后，将细胞保持在含500U/ml IL-2的生长培养基中。在研究当天，洗涤细胞，并将其以2.5×107细胞/ml的密度重悬浮在培养基中。经转染表达CXCR3的300.19细胞在含10％FBS的RPMI中生长。将300.19细胞以2×106细胞/ml重悬浮在生长培养基中。
为了进行测定，将100μl细胞悬浮液加入用聚-D-赖氨酸包被的黑边透明底96孔板(Corning/Costar，目录号3667)中。向每孔中加入100μl Calcium 3试剂盒的加样染料(FlexStationTM，MolecularDevices，Inc.，Sunnyvale，CA)，培养板以1100RPM离心4分钟，37℃温育30分钟。使用96孔试剂板，在含20mM HEPES和1％FBS的Hanks平衡盐溶液(对于300.19细胞为800pM，对于人PBL为1200pM)中稀释人IP-10(Peprotech，目录号300-12)。抗体在含有IP-10的试剂板中连续稀释。包括只含缓冲液或只含IP-10的对照孔。向含有染料标记的细胞的培养板中每孔加入22μl IP-10/抗体溶液，用FlexStationTM仪器按照使用说明书在200秒的时间内监测Calcium 3荧光，以确定钙流。按照标准方法(参见，例如，Smart D.等(1999)Br.J.Pharmacol.1281-3)将20-100秒之间的钙流进行积分，计算曲线下面积(AUC)。数据用PrismTM软件(Molecular Devices，Inc.)分析，确定IC50值(单位为nM)。结果总结在下面的表7中表7IP-10诱导的钙流的抑制


实施例6IP-10诱导的细胞迁移的抑制在体外趋化性试验中检测抗-IP-10抗体抑制IP-10诱导的细胞迁移的能力。在这些实验中使用表达CXCR3的300.19细胞，该细胞用以下成分刺激(i)100ng/ml重组人IP-10(rhIP-10)；(ii)用IFNγ(其诱导天然IP-10和MIG的分泌)刺激的THP-1细胞的上清液，其中THP-1来源的IP-10浓度为16ng/ml，并通过加入2.5μg/ml抗-MIG(R&DSystems)阻断MIG活性；或(iii)100ng/ml重组恒河猴IP-10(rrmIP-10)。使用各种浓度的抗体评价细胞迁移的抑制，并测定趋化指数。
具体而言，使用标准96孔板试验(Multiscreen MIC板(Millipore))评价趋化性的抑制。5μm滤纸用于转染的细胞系；3μm滤纸用于初级细胞。应答细胞(300.19CXCR3+；MBP-特异性人PBMC细胞)以1×106细胞/ml重悬浮于趋化缓冲液(RPMI+1％BSA或FBS)中。将100μl细胞悬浮液加至上孔中，37℃下温育30分钟。在加至下孔之前应用5％CO2。
人和恒河猴IP-10制备为100ng/ml；对于THP-1来源的IP-10，THP-1细胞用IFN-γ(0.2ng/ml)刺激，收集上清液；使用纯的MS CSF来源的IP-10。配体在150μL趋化缓冲液中制备，并置于下层区室中。
对于趋化抑制试验，在测定前，配体与不同浓度的指定抗-IP-10抗体(5μg/ml，2.5μg/ml，1.25μg/ml，0.613μg/ml，0.3μg/ml，0.015μg/ml)在37℃和5％CO2下预温育30分钟。上层区室置于孔的上方，孔在37℃和5％CO2下预温育2小时。在温育结束时，从上层区室中吸出应答细胞。小心拿去上层区室。在400倍放大倍数下在4个随机视野/孔中计数细胞。将三个孔的数据进行平均，表示为趋化指数(即响应配体的迁移相比单独培养基的倍数)。结果表示为IC50值，总结在下面的表8中
表8IP-10诱导的细胞迁移的抑制

也检测了抗-IP-10抗体抑制表达CXCR3的300.19细胞响应多发性硬化(MS)患者脑脊液(CSF)迁移的能力。再向CSF样品中加入2.5μg/ml的抗-MIG抗体中和MIG的活性。来自两个实验的结果表示为IC50值，总结在下面的表9中表9MS-CSF诱导的细胞迁移的抑制

也用表达CXCR3的300.19细胞和200ng/ml重组人MIG(R&DSystems)进行了细胞迁移研究，以检测抗-IP-10抗体抑制MIG诱导的细胞迁移的能力。抗-IP-10抗体6B10、8F6、1D4、6A5第2批、10A12和10A12S以1μg/ml单独检测，发现它们不抑制MIG诱导的细胞迁移。
实施例7抗体与MS患者脑切片的结合在该实施例中，检测了抗-IP-10抗体对多发性硬化(MS)患者的脑切片染色的能力。来自一名57岁女性MS患者的脑切片在死后19.8小时获得，显示不规则形状的室周斑(1.3cm×1.0cm)，在其余白质中呈现大量其他较小的斑块。LFB染色显示完全脱髓鞘。使用6A5(第2批)和10A12S抗-IP-10抗体，以及抗-GFAP和抗-CD68作为阳性对照，和阴性对照抗体，对切片进行免疫组化检查。
切片的抗-IP-10染色使用标准免疫组化程序。切片用2％-10％血清封闭。以100μl/切片加入在2％血清中1∶100稀释的第一抗体(例如6A5)，然后在室温下温育1小时。任选地，切片在4℃下温育过夜，并洗涤。然后加入第二抗-人生物素化抗体(用2％血清稀释(100μl/切片))，在室温下温育30-60分钟。通过加入在MeOH中的稀H2O2除去内源性过氧化物酶。然后，以100μl/切片加入ABC溶液(Vector Labs)，在室温下温育30分钟。DAB底物溶液在使用前即时制备。以100μl/切片加至玻片上，然后在暗处温育10-20分钟(如显色需要)。玻片然后用苏木精核染液复染3分钟(1分钟后检查进展)。最后将玻片在2％碳酸氢钠中温育45秒，产生颜色。
结果显示，6A5和10A12S都能够在MS患者的脑切片中与IP-10原位结合，6A5染色比10A12S染色更强。
实施例8转基因小鼠HCo17株的构建通过同时注射pHC2的80kb插入片段(Taylor等(1994)Int.Immunol.，6579-591)、pVX6的25Kb插入片段和yIgH24染色体的约460kb酵母人工染色体片段，产生HCo17转基因小鼠株。单独的pHC2构建体完全能够在体内重排，形成功能性人重链免疫球蛋白基因座；增加pVX6和yIgH24是为了贡献另外的种系VH多样性。用来产生HCo17的DNA混合物的各种成分如下所述。
上述pHC2插入片段含有4个功能性人种系VH基因段1-69(DP-10)，5-51(DP-73)，4-34DP-63)和3-30.3(DP-46)。另外，该构建体还含有包括15个功能性D段、全部6个J段以及μ和γ1恒定区段和功能性μ-γ1转换区的人基因组序列。
pVX6插入片段含有3个人种系VH段VH1-18(DP-14)、VH5-51(DP-73)和VH3-23(DP-47)。将含有种系人VH1-18(DP-14)基因以及大约2.5kb的5’侧翼和5kb的3’侧翼基因组序列的8.5kb HindIII/SalIDNA片段亚克隆到质粒载体pSP72(Promega，Madison，Wis.)中，产生质粒p343.7.16。将包含种系人VH5-51(DP-73)基因以及大约5kb的5’侧翼和1kb的3’侧翼基因组序列的7kb BamHI/HindIII DNA片段克隆到基于pBR322的质粒克隆载体pGP1f(Taylor等(1992)Nucleic Acids Res.206287-6295)中，产生质粒p251f。由pGP1f衍生的一种新克隆载体，pGP1k，用EcoRV/BamHI消化，连接到10kb EcoRV/BamHI DNA片段内，该片段含有种系人VH3-23(DP47)基因，以及大约4kb的5’侧翼和5kb的3’侧翼基因组序列。得到的质粒p112.2RR.7用BamHI/SalI消化，并与纯化的p251f的7kb BamHI/SalI插入片段连接。获得的质粒pVx4用XhoI消化，并与p343.7.16的8.5kb XhoI/SalI插入片段连接。获得含有与另外两种V基因相同方向的VH1-18基因的克隆。该克隆命名为pVx6，然后用NotI消化，以用于制备插入片段。
最初使用VH3和VH4家族特异性引物，通过PCR筛选鉴定酵母人工染色体(YAC)yIgH24，并根据VH含量对人染色体14作图。已经明确yIgH24含有VH段，包括VH家族的成员VH1、VH2、VH3、VH4和VH5，特别是至少VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH2-26、VH3-30、VH3-30.5、VH3-30.3、VH3-33、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH4-28、VH4-30、VH4-30.4、VH4-30.3、VH4-31、VH4-34、4-39和VH5-51。
纯化的来自pVX6(26kb)、pHC2(80kb)和yIgH24(约460kb)的插入片段以1∶1∶1的摩尔比组合，如Hogan等(B.Hogan等，Manipulating theMouse Embryo.，A Laboratory Manual，第二版，1994，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，N.Y.)所述，显微注射到半天大的(C57BL/6J xDBA/2J)F2胚胎的原核中。由注射胚胎发育成的小鼠建立含有来自pVx6、HC2和yIgH24的序列的转基因小鼠建立者系(founder line)。该系命名为(HCo17)25950。
(HCo17)25950系然后与含有CMD突变(在PCT公布WO 01/09187的实施例1中描述)、JKD突变(Chen等(1993)EMBO J.12811-820)和(KCo5)9272转基因(Fishwild等(1996)Nature Biotechnology 14845-851)的小鼠杂交。获得的小鼠在内源性小鼠重链和κ轻链基因座已经纯合破坏的背景中表达人免疫球蛋白重链和κ轻链转基因。
序列表概述



等同方案本领域技术人员将认识到，或者仅仅使用常规实验就能够确定，在此处描述的本发明具体实施例的很多等同方案。这样的等同方案包括在下面的权利要求书中。
序列表<110>米德列斯公司等<120>IP-10抗体及其用途<130>MXI-312PC<150>60/529180<151>2003-12-10<160>126<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>5<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Ser Tyr Gly Met His1 5<210>2<211>5<212>PRT<213>人<400>2Thr Tyr Gly Met His1 5<210>3<211>5<212>PRT<213>人<400>3Asn Cys Gly Met His
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<400>12Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser1 5<210>13<211>17<212>PRT<213>人<400>13Val Ile Trp Phe Glu Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>14<211>17<212>PRT<213>人<400>14Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Asp<210>15<211>17<212>PRT<213>人<400>15Leu Ile Gly Tyr Asp Gly Ile Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>16<211>17<212>PRT
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<211>15<212>PRT<213>人<400>28Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val1 5 10 15<210>29<211>15<212>PRT<213>人<400>29Glu Gly Asp Gly Ser Ser Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val1 5 10 15<210>30<211>13<212>PRT<213>人<400>30Glu Gly Gly Tyr Thr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr1 5 10<210>31<211>14<212>PRT<213>人<400>31Glu Arg Gly Thr His Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Asp Tyr1 5 10<210>32<211>11<212>PRT<213>人
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65 70 75 80Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu85 90 95Gly Ala Gly Ser Ser Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>36<211>120<212>PRT<213>人<400>36Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys AlaAla Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asn Ile Ala Val Ala Asp Val Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120<210>37<211>121<212>PRT<213>人<400>37Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Cys20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45Ala Leu Ile Gly Tyr Asp Gly Ile Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Trp Pro Glu Gly Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>38<211>123<212>PRT<213>人<400>38Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Pro Ser Tyr20 25 30trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Val Ile Ser Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Pro Phe Phe Gln tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>39<211>124<212>PRT<213>人<400>39Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly GlyVal Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp100 105 110Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>40<211>124<212>PRT<213>人<400>40Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Glu Asp Tyr Ala Ala Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Ser Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp100 105 110Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>41<211>246
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权利要求
1.一种分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与人IP-10特异性结合，并且显示至少一种如下性质(a)抑制IP-10与CXCR3的结合；(b)抑制IP-10诱导的钙流；(c)抑制IP-10诱导的细胞迁移；(d)与恒河猴IP-10交叉反应；(e)不与小鼠IP-10交叉反应；(f)不与人MIG交叉反应；(g)不与人ITAC交叉反应。
2.权利要求1的抗体，其为IgG1或IgG4同种型的全长抗体。
3.权利要求1的抗体，其为抗体片段或单链抗体。
4.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与IP-10特异性结合，并且包含是选自下组的人VH种系基因的产物或源自该基因的重链可变区人VH3-33基因、人VH3-30.3基因、人VH5-51基因和人VH4-61基因。
5.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与IP-10特异性结合，并且包含选自下组的人Vk种系基因的产物或源自该基因的轻链可变区人VkA27基因、人VkL15基因、人VkL6基因和人VkL18基因。
6.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与IP-10特异性结合，并且包含(a)选自下组的人VH种系基因的产物或源自该基因的重链可变区人VH3-33基因、人VH3-30.3基因、人VH5-51基因和人VH4-61基因；和(b)选自下组的人Vk种系基因的产物或源自该基因的轻链可变区人VkA27基因、人VkL15基因、人VkL6基因和人VkL18基因。
7.权利要求6的抗体，其包含(a)人VH3-33基因的产物或源自该基因的重链可变区；和(b)选自下组的人Vk种系基因的产物或源自该基因的轻链可变区人VkA27基因、人VkL15基因、人VkL6基因。
8.权利要求7的抗体，其包含人VkA27基因的产物或源自该基因的轻链可变区。
9.权利要求7的抗体，其包含人VkL15基因的产物或源自该基因的轻链可变区。
10.权利要求7的抗体，其包含人VkL6基因的产物或源自该基因的轻链可变区。
11.权利要求6的抗体，其包含(a)人VH3-30.3基因的产物或源自该基因的重链可变区；(b)人VkL6基因的产物或源自该基因的轻链可变区。
12.权利要求6的抗体，其包含(a)人VH5-51基因的产物或源自该基因的重链可变区；(b)人VkL18基因的产物或源自该基因的轻链可变区。
13.权利要求6的抗体，其包含(a)人VH4-61基因的产物或源自该基因的重链可变区；(b)人VkA27基因的产物或源自该基因的轻链可变区。
14.权利要求4-13任一项的抗体，其中所述IP-10是人IP-10。
15.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区；其中(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO24-34的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，(b)轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO73-83的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，(c)该抗体与IP-10特异性结合，且(d)该抗体表现至少一种如下功能性质(i)该抗体抑制IP-10与CXCR3的结合；(ii)该抗体抑制IP-10诱导的钙流；(iii)该抗体抑制IP-10诱导的细胞迁移；(iv)该抗体与恒河猴IP-10交叉反应；(v)该抗体不与小鼠IP-10交叉反应；(vi)该抗体不与人MIG交叉反应；(vii)该抗体不与人ITAC交叉反应。
16.权利要求15的抗体，其中重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO13-23的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO62-72的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。
17.权利要求16的抗体，其中重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO51-61的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。
18.权利要求15的抗体，其为人抗体。
19.权利要求15的抗体，其为人源化或嵌合抗体。
20.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中(a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO35-46的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列，(b)轻链可变区包含与选自SEQ ID NO84-94的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列，(c)该抗体与IP-10特异性结合，且(d)该抗体表现至少一种如下功能性质(i)该抗体抑制IP-10与CXCR3的结合；(ii)该抗体抑制IP-10诱导的钙流；(iii)该抗体抑制IP-10诱导的细胞迁移；(iv)该抗体与恒河猴IP-10交叉反应；(v)该抗体不与小鼠IP-10交叉反应；(vi)该抗体不与人MIG交叉反应；(vii)该抗体不与人ITAC交叉反应。
21.权利要求20的抗体，其为人抗体。
22.权利要求20的抗体，其为人源化或嵌合抗体。
23.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含(a)包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含选自SEQ ID NO13-23的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含选自SEQ ID NO24-34的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含选自SEQ ID NO51-61的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含选自SEQ ID NO62-72的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(f)包含选自SEQ ID NO73-83的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中该抗体与IP-10特异性结合。
24.权利要求23的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO1的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO13的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO24的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO51的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO62的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO73的轻链可变区CDR3。
25.权利要求23的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO2的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO14的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO25的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO52的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO63的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO74的轻链可变区CDR3。
26.权利要求23的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO3的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO15的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO26的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO53的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO64的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO75的轻链可变区CDR3。
27.权利要求23的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO4的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO16的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO27的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO54的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO65的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO76的轻链可变区CDR3。
28.权利要求23的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO5的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO17的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO28的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO55的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO66的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO77的轻链可变区CDR3。
29.权利要求23的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO6的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO18的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO29的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO56的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO67的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO78的轻链可变区CDR3。
30.权利要求23的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO7的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO19的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO30的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO57的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO68的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO79的轻链可变区CDR3。
31.权利要求23的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO8的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO20的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO31的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO58的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO69的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO80的轻链可变区CDR3。
32.权利要求23的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO9的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO21的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO32的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO59的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO70的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO81的轻链可变区CDR3。
33.权利要求23的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO10或11的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO22的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO33的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO60的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO71的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO82的轻链可变区CDR3。
34.权利要求23的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO12的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO23的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO34的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO61的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO72的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO83的轻链可变区CDR3。
35.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含(a)包含选自SEQ ID NO35-46的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含选自SEQ ID NO84-94的氨基酸序列的轻链可变区；其中该抗体与IP-10特异性结合。
36.权利要求35的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO35的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO84的氨基酸序列的轻链可变区。
37.权利要求35的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO36的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO85的氨基酸序列的轻链可变区。
38.权利要求35的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO37的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO86的氨基酸序列的轻链可变区。
39.权利要求35的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO38的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO87的氨基酸序列的轻链可变区。
40.权利要求35的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO39的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO88的氨基酸序列的轻链可变区。
41.权利要求35的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO40的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO89的氨基酸序列的轻链可变区。
42.权利要求35的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO41的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO90的氨基酸序列的轻链可变区。
43.权利要求35的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO42的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO91的氨基酸序列的轻链可变区。
44.权利要求35的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO43的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO92的氨基酸序列的轻链可变区。
45.权利要求35的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO44或45的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO93的氨基酸序列的轻链可变区。
46.权利要求35的抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO46的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO94的氨基酸序列的轻链可变区。
47.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它与权利要求1-46任一项的抗体竞争结合IP-10。
48.一种组合物，其含有权利要求1-46任一项的抗体或其抗原结合部分，和药物可接受的载体。
49.一种免疫偶联物，其包含与治疗剂连接的权利要求1-46任一项的抗体或其抗原结合部分。
50.权利要求49的免疫偶联物，其中所述治疗剂是一种细胞毒素。
51.权利要求49的免疫偶联物，其中所述治疗剂是一种放射性同位素。
52.一种组合物，其含有权利要求49-51任一项的免疫偶联物和药物可接受的载体。
53.一种双特异性分子，其包含与第二功能部分连接的权利要求1-46任一项的抗体或其抗原结合部分，该第二功能部分具有与该抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。
54.一种组合物，其含有权利要求53的双特异性分子和药物可接受的载体。
55.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-46任一项的抗体或其抗原结合部分。
56.一种表达载体，其包含权利要求55的核酸分子。
57.一种宿主细胞，其包含权利要求56的表达载体。
58.一种含有人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中该小鼠表达权利要求1-46任一项的抗体。
59.由权利要求58的小鼠制备的杂交瘤，其中该杂交瘤产生所述抗体。
60.一种抑制由活化T细胞或NK细胞介导的炎症或自身免疫应答的方法，包括使T细胞或NK细胞接触权利要求1-46任一项的抗体或其抗原结合部分，从而使该炎症或自身免疫应答受到抑制。
61.一种对需要治疗的受试者治疗炎症或自身免疫病的方法，包括向该受试者施用权利要求1-46任一项的抗体或其抗原结合部分，从而使该受试者的炎症或自身免疫病得到治疗。
62.权利要求61的方法，其中所述疾病是多发性硬化症。
63.权利要求61的方法，其中所述疾病选自类风湿性关节炎、炎性肠病(例如溃疡性结肠炎、克罗恩病)、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、炎性皮肤病(例如牛皮癣、扁平苔藓)、自身免疫性甲状腺病(例如格雷夫病、桥本病)、舍格伦综合征、肺炎症(例如哮喘、慢性阻塞性肺病、肺结节病、淋巴细胞肺泡炎)、移植排斥、脊髓损伤、脑损伤(例如中风)、神经变性疾病(例如阿尔茨海默病、帕金森病)、龈炎、基因治疗诱发的炎症、血管发生疾病、炎性肾病(例如IgA肾病、膜增生性肾小球肾炎、急进性肾小球肾炎)和动脉粥样硬化。
64.一种治疗需要治疗的受试者中病毒或细菌感染的方法，其中所述病毒或细菌感染和不利的IP-10活性有关的，所述方法包括向该受试者施用权利要求1-46任一项的抗体或其抗原结合部分，从而使该受试者的病毒或细菌感染得到治疗。
65.权利要求64的方法，其中所述病毒感染是由人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、I型单纯疱疹病毒(HSV-1)或重度急性呼吸综合征(SARS)病毒介导的。
66.一种制备抗-IP-10抗体的方法，包括(a)提供(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO1-12的CDR1序列、选自SEQ ID NO13-23的CDR2序列和选自SEQ IDNO24-34的CDR3序列；和(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO51-61的CDR1序列、选自SEQ ID NO62-72的CDR2序列和选自SEQ ID NO73-83的CDR3序列；(b)改变至少一个可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，该序列选自重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列，从而产生至少一个改变的抗体序列；和(c)使该改变的抗体序列表达为蛋白质。
全文摘要
本发明提供分离的单克隆抗体，特别是人抗体，它与IP－10高亲和力地结合，抑制IP－10与其受体的结合，抑制IP－10诱导的钙流，并且抑制IP－10诱导的细胞迁移。也提供了编码本发明抗体的核酸分子，用于表达本发明抗体的表达载体、宿主细胞和方法。还提供了包含本发明抗体的免疫偶联物、双特异性分子和药物组合物。本发明还提供应用本发明的抗体抑制IP－10活性的方法，包括用于治疗各种炎症和自身免疫病的方法。
文档编号C07K16/28GK1889979SQ200480036843
公开日2007年1月3日 申请日期2004年12月10日 优先权日2003年12月10日
发明者施里坎特·德施潘德, 黄海纯, 莫汉·斯里尼瓦桑, 约瑟芬·M·卡达雷尔利, 王长玉, 戴维·帕斯莫尔, 范吉普拉姆·S·兰甘, 托马斯·E·莱恩, 汉斯·S·基尔斯特德, 迈克尔·T·利厄 申请人:米德列斯公司