专利名称：Fsh的纯化方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质纯化领域，特别是促卵泡激素(FSH)的纯化。
背景技术：
促卵泡激素(FSH)是一种属于促性腺激素类的可注射的蛋白质。FSH用于女性和男性病人的不孕和生殖紊乱的治疗。
天然状态下，FSH产生于垂体腺。FSH用于制药时可以重组产生(rFSH)，或者可以从绝经后的妇女尿中分离得到(uFSH)。
FSH用于女性病人在辅助生殖技术(ART)中诱导排卵(OI)和控制性超排卵(COH)。在一个典型的诱导排卵治疗疗程中，病人在大约6到12天内每天给予FSH或其变量注射(大约75到300IU FSH/日)。在一种典型的控制性超排卵治疗疗程中，病人在大约6到12天内每天给予FSH或其变量注射(大约150到600IU FSH/日)。
FSH也用于诱导精子减少的男性病人的精子产生。在促性腺激素分泌不足的性腺机能减退的男性病人中，用150IU FSH每周3次并结合2,500IUhCG每周两次的疗程已经成功地取得了精子数量的提高[Burgues et al.；Subcutaneous self-administration of highly purified follicle stimulating hormoneand human chorionic gonadotrophin for the treatment of malehypogonadotrophic hypogonadism.Spanish Collaborative Group on MaleHypogonadotrophic Hypogonadism；Hum.Reprod.；1997，12，980-6]。
因为FSH在治疗生殖紊乱中的重要性，所以最好提供高纯度和高比活性的FSH。FSH治疗需要重复注射。高度纯化的FSH制剂可以皮下给药，病人也可以自己给药，因此大大方便和依从了病人。
Lynch等人描述了一种人垂体FSH的纯化方法[The extraction andpurification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinisinghormone；Acta Endocrinologica，1988，288，12-19]。该方法包括阴离子和阳离子交换层析法以及尺寸排阻层析法。该方法所得垂体FSH的比活性为4,990IU/mg，包括16IU/mg LH在内(免疫测定)。用干重或于溶液中在280nm的光谱下吸收来测定蛋白质含量(假定A2801cm时1g/l等于1)。
WO 98/20039(IBSA Institut Biochimique SA)描述了一种起始于尿提取物也称为人绝经期促性腺激素(hMG)的人尿中FSH纯化方法。该方法用DEAE型的弱碱性阴离子交换树脂进行离子交换层析法，然后在有一蒽醌衍生物作为配体的树脂上进行亲和层析。该方法据称产生的尿FSH不含LH，其比活性为6,870IU/mg(免疫测定)。蛋白质含量用假定1mg/ml的水溶液在1cm通道的石英透明小玻璃管中在277nm时光密度为0.62。
WO 00/63248(Instituto Massone SA)描述了一种促性腺激素包括人尿中的FSH的纯化方法。该方法涉及以下步骤一强阳离子烃基硫酸型树脂的离子交换层析、一强阴离子树脂的离子交换层析以及疏水作用层析(HIC)。据报道，所得的一FSH制剂的比活性为8,400IU/mg(Steelman-PohleymethodAssay of the follicle stimulating hormone based on the augmentationwith human chorionic gonadotrophin；Endocrinology；1953，53，604-616)和每75IU FSH少于1IU LH生物活性(rat seminal vesicle weight gain methodVanHell H，Matthijsen R & GA Overbeek；Acta Endocrinol，1964，47，409)。用劳里方法测定蛋白质含量[O.H.Lowry et al.，J.Biol.Chem.，1951，193，265]。
US 5,990,288(Musick等人)描述了一种生物样品中的FSH的纯化方法，如人垂体腺或人绝经后的尿。该方法用干亲和层析。据称，该方法所得人垂体FSH的比活性为7,066IU(免疫测定)/mg和少于1IU(免疫测定)/mg的LH，以及尿FSH的比活性为6,298IU(免疫测定)/mg和少于3IU(免疫测定)/mg的LH。蛋白质含量用吸收光谱法在280nm测定(假定A2801cm时1g/l等于1)。
Chiba等人[Isolation and partial characterisation of LH，FSH and TSH fromcanine pituitary gland；Endocrinol.J.，1997，44，205-218]描述了一种包括FSH的犬垂体促性腺激素纯化技术，该纯化技术采用伴刀豆球蛋白(Con)A亲和层析、疏水作用层析(HIC)和Cu++固定金属离子层析。据报道，用FSH放射性受体测定方法测定生物活性和用BioRad蛋白质试剂盒(BioRadLaboratories CA USA)测定蛋白质含量，所得到的FSH的比活性为2.17IU/g蛋白质。
WO 88/10270(Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA)描述了一种人尿中的FSH的纯化方法。该方法包括免疫层析，采用以双乙烯砜与Sepharose 4B结合的FSH-特异的固定单克隆抗体，然后进行反相HPLC。所得到的FSH不含LH和其他尿蛋白，并比活性为6,200IU/mg的冻干粉末(Steelman-Pohley方法)。该制剂为首次的FSH制剂，因其高纯度，而适合皮下注射。
因此需要开发新的FSH纯化方法。
发明简述本发明的目的是提供一种重组FSH或FSH变异体纯化新方法。
本发明首先提供了一种重组人FSH或FSH变异体的纯化方法，其包括以下步骤(1)离子交换层析；(2)固定金属离子层析；(3)疏水作用层析(HIC)。
可以以任何顺序进行。
附图简述
图1所示为rhFSH纯化的流程图。
图2所示为未加工的rhFSH在280nm时经光密度检测，在Q琼脂糖凝胶FF上层析的洗脱图。
图3所示为部分纯化的rhFSH在280nm时经光密度检测的IMAC层析洗脱图。
图4所示为部分纯化的rhFSH在280nm时经光密度检测的DEAE琼脂糖凝胶层析洗脱图。
图5所示为部分纯化的rhFSH在280nm时经光密度检测的苯基琼脂糖凝胶层析洗脱图。
图6所示为用一种Source 30RPC柱进行RPC步骤的洗脱图。
缩写以下缩写用于本发明中的描述FSH促卵泡激素；
rFSH重组FSH；hFSH人FSH；rhFSH重组人FSHBV柱床体积DEAE二乙基氨基乙基IMAC固定金属离子层析OD光密度HIC疏水作用层析HPLC高效液相层析IRMA免疫放射测定KD或kD千道尔顿HCP宿主细胞蛋白，用于表达FSH的宿主细胞蛋白IPC过程控制中RP-HPLC反相高效液相层析Q FF在Q琼脂糖FF上的阴离子交换发明详述本发明提供了一种重组人FSH或FSH变异体的纯化方法，所述的方法包括以下步骤(1)离子交换层析；(2)固定金属离子层析；(3)疏水作用层析(HIC)。
可以以任何顺序进行。
本发明的纯化方法可以得到一种纯度可与已知FSH产品如Gonal-F(Serono)和Metrodin-HP(Serono)相比较的纯化FSH。纯化的起始材料是重组FSH。
发明优选实施例本发明的纯化方法包括离子交换层析步骤。在一个优选实施例中，离子交换层析步骤使用强阴离子交换树脂，特别优选一种季铵树脂，如Q琼脂糖凝胶FF(Amersham Biosciences)，或一种有以下相似特性的树脂
离子交换类型强阴离子总容量(mmol/ml) 0.18-0.25排阻限(球蛋白) 4×106颗粒形式球形，直径45-165μm颗粒结构交联琼脂糖，6％pH操作稳定性2-12pH清洗稳定性1-14在25℃1巴15cm柱床高度，XK 50/30柱的线性流速400-700cm/h在离子交换层析步骤中，洗脱优选用有弱碱性pH(如在7.2或大约7.2到9.0或大约9.0，或8.0或大约8.0到9.0或大约9.0，最佳8.5或大约8.5)缓冲液。适合的缓冲液包括，如，硼酸盐缓冲液、三乙醇胺/亚胺二乙酸。最优选pH值为8.5或大约为8.5的硼酸盐缓冲液。洗脱缓冲液的浓度较佳10或大约10到100mM或大约100mM的范围内，更佳为25或大约25到75mM或大约75mM，最佳在50mM或大约50mM。
在离子交换层析步骤之前，为了浓缩未加工的FSH，最好进行一次超滤步骤。超滤(或渗滤)较佳用一种为3-10kD或大约为3-10kD的截止膜，最佳5kD或大约5kD。
本发明的方法也包括固定金属离子层析步骤。在一个优选实施例中，固定金属离子层析用一种有三齿配位螯合基团的树脂，例如亚胺二乙酸(IDA)，和一个二价金属，M2+，如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Mg2+和Co2+，优选Cu++。金属离子螯合基团附着在一适合的固定支持物上，如，琼脂糖凝胶。一种优选的树脂是螯合琼脂糖凝胶FF(Amersham Biosciences)，或其他有以下相似特性的树脂组合物 高度交联的6％琼脂糖颗粒大小45-165μm配体间隔基上的亚胺二乙酸基团偶合化学环氧的金属离子容量30-37μmol Cu2+/ml
pH稳定性(操作)3-13pH稳定性(短期)2-14压力/流速 基质200-400cm/h，1巴(100kPa)，XK 50/60柱，床高25cm固定金属离子层析步骤中的洗脱应该用咪唑、磷酸盐或醋酸盐缓冲液，特别优选醋酸盐，如醋酸铵。洗脱液的pH值为7.5或大约7.5到10或大约10，优选pH值8.0或大约8.0到9.5或大约9.5，特别优选pH值9或大约9。在洗脱液中的缓冲液种类的浓度较佳应该为0.1或大约0.1到2或大约2M，更佳为0.5或大约0.5到1或大约1M，最佳大约0.75M或大约0.75M。
本发明的方法也包括疏水作用层析步骤。在一个优选实施例中，疏水作用层析用一种树脂，如苯基琼脂糖凝胶FF HS(Amersham Biosciences)或其他有以下相似特性的树脂进行基质6％高度交联的球形琼脂糖平均颗粒大小90μm疏水配体苯基配体密度40pH稳定性(短 2-14期)pH稳定性(长 3-13期和操作范围)疏水作用层析步骤中的洗脱较佳使用弱碱性pH(如在7.2或大约7.2到9.0或大约9.0，更佳7.5或大约7.5到8.5或大约8.5，最佳8.25或大约8.25)缓冲液。一种特别优选的洗脱液是醋酸铵(50mM)/硫酸铵(0.25M)，较佳pH值为8.25或大约8.25。
疏水作用层析步骤之后，也可以进行反相层析步骤(RPC)。RPC较佳使用如SOURCE 30 RPC(Amersham Biosciences)的树脂。洗脱较佳使用如醋酸铵缓冲液，较佳为弱碱性pH，如pH 7-8.5或大约pH 7-8.5，更佳为大约7.5或7.6。缓冲液溶液较佳含有5-25％(体积/体积)或大约5-25％，较佳10-20％或大约10-20％的可与水混合的有机溶剂，该溶剂较佳为C1到C3酒精，最佳为2-丙醇(异丙醇)。
疏水作用层析步骤、固定金属离子层析和疏水作用层析(HIC)可以以任何顺序进行，但优选首先进行离子交换层析。余下固定金属离子层析和疏水作用层析(HIC)步骤可以以任何顺序进行，但优选如下所示的顺序(1)离子交换层析，(2)固定金属离子层析，和(3)疏水作用层析(HIC)。
在另一个优选实施例中，步骤(2)和步骤(3)之间还有一离子交换层析步骤(2a)，特别优选使用一种弱碱性交换树脂进行，如，一种带有二氨乙基基团的交换树脂，特别是DEAE琼脂糖凝胶FF。在一特别优选的实施例中，纯化步骤以如下顺序进行(1)离子交换层析，(2)固定金属离子层析，(2a)第二次离子交换层析，和(3)疏水作用层析(HIC)。
在一个特别优选的实施例中，本发明的方法包括有如下性质的步骤(1)离子交换层析(较佳用一强阴离子交换树脂，如Q琼脂糖凝胶FF)；(2)固定金属离子层析(较佳用螯合琼脂糖凝胶FF，将Cu++用作金属离子)；(2a)第二次离子交换层析(较佳用一弱阴离子交换树脂，如DEAE琼脂糖凝胶FF)；(3)疏水作用层析(HIC)(较佳用苯基琼脂糖凝胶FF HS)。
第二次离子交换层析(2a)较佳将醋酸铵缓冲液用作洗脱液，较佳pH值为8.5或大约为8.5。醋酸铵缓冲液较佳浓度为0.05或大约0.05到0.5或大约0.5M，更佳为0.11或大约0.11M。
在另一个优选实施例中，任何层析步骤后(特别优选在反相层析步骤后)，FSH样品进行超滤浓缩。超滤(或渗滤)较佳用3-10KD或大约3-10KD的截止膜，最佳为5KD或大约为5KD。
在一个特别优选的实施例中，如下步骤以如下所示顺序进行(0)超滤(较佳用5KD或大约5KD的截止膜)，(1)离子交换层析(较佳用Q琼脂糖凝胶FF)，(2)固定金属离子层析(较佳用螯合琼脂糖凝胶FF和Cu++)，(2a)第二次离子交换层析(较佳用DEAE琼脂糖凝胶FF)，和(3)疏水作用层析(HIC)(较佳用苯基琼脂糖凝胶FF HS)，(4)反相层析(RPC)(较佳用SOURCE30RPC)，以及(5)超滤(较佳用5KD的截止膜)。
为了保证纯化的制剂没有病毒，可能需要将FSH样品进行纳米级过滤。纳米级过滤可以在纯化过程中的任何步骤中进行，然而，特别优选在第二次离子交换树脂之后，或在反相层析之后或疏水作用层析之后进行纳米级过滤.可以进行多于一次的纳米级过滤，如进行两次纳米级过滤。
在一个特别优选的实施例中，本发明的方法包括如下步骤(0)超滤(较佳用5KD或大约5KD的截止膜)，(1)离子交换层析(较佳用Q琼脂糖凝胶FF)，(2)固定金属离子层析(较佳用螯合琼脂糖凝胶FF和Cu++)，(2a)第二次离子交换层析(较佳用DEAE琼脂糖凝胶FF)，和(3)疏水作用层析(HIC)(较佳用苯基琼脂糖凝胶FF HS)，(4)反相层析(RPC)(较佳用SOURCE 30RPC)，以及(5)超滤(较佳用5KD的截止膜)，(6)纳米级过滤。
贮存/冻干从如上所述的纯化过程中得到的含有纯化的FSH的液态组合物可以按原来样子冷冻贮存，或者在纯化之后，洗脱物进行冻干(“冷冻-干燥”)，去掉溶剂。所得到的液体或冻干产品称为“FSH散料”。
FSH配方本发明的FSH或FSH变异体或根据本发明的方法纯化了的FSH应该制成注射剂，肌肉或皮下注射，较佳为皮下注射。
FSH制剂可以冻干，在这种情况下，在注射之前则要将它溶解在水里作注射。FSH制剂也可以是一种液体制剂，在这种情况下，不需要任何溶解，可以直接注射。
FSH可以是单剂量或多剂量。如果是多剂量，较佳含有抑菌剂如苯甲醇、间甲酚、百里酚或酚，较佳为苯甲醇或间甲酚。单剂量配方也可以含有一种抑菌剂。
本发明的FSH可以与赋形剂和稳定剂一起配制，如蔗糖和甘露醇。也可以含有抗氧化剂，如蛋氨酸。更可以含有一种表面活性剂，如TWEEN(较佳为TWEEN 20)，或者聚醚(较佳为聚醚F68)。
在一个特别优选的多剂量配方里，由本发明的方法所生产的FSH通过溶于水再与蔗糖、磷酸盐缓冲液(pH7)、聚醚F68、蛋氨酸和间甲酚或苯甲醇配制成注射剂。
适应症本发明的FSH适用于需要FSH的各种治疗。特别适用于诱导排卵，控制辅助生殖技术中的控制性超排卵和精子减少症治疗中的皮下给药。它可以与其他促性腺激素如LH和hCG一起结合使用，也可以与增加对FSH反应的化合物如克罗米酚，以及芳香酶抑制剂如阿纳托唑、来曲唑、法倔唑和YM-511一起使用。
序列SEQ ID NO.1人糖蛋白α亚单位；SEQ ID NO.2hFSHβ亚单位SEQ ID NO.3hFSHβ亚单位变异体1SEQ ID NO.4hFSHβ亚单位变异体2SEQ ID NO.5hFSHβ亚单位变异体3本文中所用的促卵泡激素，或者FSH是指作为全长成熟蛋白质提出的人FSH(hFSH)。FSH是一个含有人糖蛋白α亚单位和人FSHβ亚单位的二聚体。人糖蛋白α亚单位的蛋白质序列为SEQ ID NO.1，人FSHβ亚单位的蛋白质序列为SEQ ID NO.2。
所用术语“重组”指通过重组DNA技术而产生的FSH制剂(参见例如WO85/01958)。用重组技术表达FSH的方法的一个实施例是，用编码FSHα亚单位和β亚单位的DNA序列转染真核细胞，如在EP 0 211 894和EP 0 487512中所述，不管在一个载体还是在两个载体上均有一亚单位，每个亚单位都有一单个启动子。编码FSH的DNA可以是一个cDNA或其含有内含子。用重组技术生成FSH的方法的另一个实施例是用同源重组技术以有效连接的方式把一异源调节片段插入到编码FSH的一个或两个亚单位的内生序列中，如欧洲专利号EP 0 505 500(Applied Research Systems ARS Holding NV)所述。一些WO 99/57263(Transkaryotic Therapies)中所公开的方法也可以考虑，其中一个亚单位异源插入细胞，而另一个亚单位经同源重组插入一个异源调节片段以激活基因组序列而表达。本发明的方法可以用于纯化以上述任何一种方法所表达的FSH。
“重组细胞”的表达指经插入一个异源DNA而产生的细胞，包括以上所提到的任何一种遗传操作方法。
FSH较佳由含有编码人糖蛋白α亚单位和FSHβ亚单位的一个或多个载体的DNA转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组产生。编码α亚单位和β亚单位的DNA可以在相同的或不同的载体中出现。
“FSH变异体”的表达指包含一些在氨基酸序列、糖基化模式或在亚单位之间的连接与人FSH不同但呈现FSH活性的分子。例子包括CTP-FSH，即一种长效的经修饰的重组FSH，其由野生型α亚单位和杂交β亚单位构成，其中hCG的羧基末端肽融合于FSHβ亚单位的C末端，如LaPolt等人；Endocrinology；1992，131，2514-2520；或Klein等人；Development andcharacterization of a long-acting recombinant hFSH agonist；Human Reprod.2003，18，50-56]所述。还包括单链CTP-FSH，一种单链分子，其由如下序列(从N末端到C末端)构成
其中βFSH表示FSHβ亚单位，βhCG CTP(113-145)表示hCG羧基末端肽，αFSH表示FSHα亚单位，如Klein等人所述[Pharmacokinetics andpharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulatinghormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxyterminalpeptide in the rhesus monkey；Fertility & Sterility；2002，77，1248-1255]。FSH变异体的其他实施例包括具有在α亚单位和/或β亚单位中所引入的糖基化位点的FSH分子，如在WO 01/58493(Maxygen)中所示，以及亚单位之间有S-S键的FSH分子，如在WO 98/58957中所示。FSH变异体的其他实施例包括含有FSH序列和hCG或LH序列的嵌合分子，如在WO 91/16922和WO 92/22568中所述的那些。
这里所指的FSH变异体也包括短于SEQ ID NO.2的全长成熟蛋白质的β亚单位的羧基末端缺失。在SEQ IDS NO.3、4和5中有人FSHβ亚单位的羧基末端缺失。可以理解为β链的羧基末端变异体与一个已知的α亚单位形成二聚体，由此形成一个FSH变异异源二聚体。
在一个优选实施例中，FSH在CHO细胞中重组产生。
在一个优选实施例中，根据本发明的方法产生的纯化的FSH适用于皮下给药，病人可以自身给药。
“未加工的重组FSH”的表达指在采取任何层析步骤之前表达FSH的重组细胞中的细胞培养上清液。该表达包括了上清液未加工的形式(从细胞中分离)，也包括浓缩的和/或过滤的和/或超滤的上清液。
与FSH活性相关的术语“生物活性”是指一种FSH制剂引起与FSH相关的生物反应的能力，如在Steelman-Pohley测定中得到的卵巢重量[Assay ofthe follicle stimulating hormone based on the augmentation with humanchorionic gonadotrophin；Endocrinology；1953，53，604-616]，或者女性病人的卵泡生长。女性病人的卵泡生长可以通过超声波估算，如，根据在刺激后第8天平均直径大约有16mm的卵泡数量。生物活性可经一种对于FSH可接受的标准来估算。
可以测定在FSH制剂中LH的含量，如，用LH特定的免疫测定法，如Delfia hLH Spec(Wallac Oy，Turku，Finland)。
关于FSH的“比活性”术语指以IU表示的制剂的生物活性除以蛋白质重量，IU根据公认的FSH的生物测定法如Steeelman Pohley生物测定法测出，蛋白质重量根据一种总蛋白含量的测定法来测定，如劳里测定法[O.H.Lowry，N.J.Rosebrough，A.L.Farr and R.J.Randall(1951)J.Biol.Chem.193265；Hartree E.E.(1972).Anal.Biochem.48422；J.R.Dulley and P.A.Grieve(1975)Anal.Biochem.64136]，Bradford测定法[Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72，248]，或者在280nm的吸收值测定。本发明的FSH的比活性较佳为大于或大约4000IU/mg，更佳为大于或大约6000IU/mg，再佳为大于或大约7000IU/mg，最佳为大于或大约8000IU/mg，其中生物活性用Steelman-Pohley测定法测定，而蛋白质含量用280nm时的光密度测定。
实施例纯化如下实施例提供了从在15和75L的生物反应器中生成的浓缩未加工r-hFSH开始纯化的r-hFSH。
图1所示为以下详细描述的纯化过程的流程图，所得到的纯化的rhFSH即称为“rhFSH散料”。
所有的缓冲液pH和传导值都基于+25℃；即，传导值用一种装配有温度探针的仪器测定，而所得到的值自动地对不同温度进行补偿且基于+25℃。
关于传导测量，相关温度系数始终是设定为2。
步骤0浓缩的未加工rhFSH渗滤设备·超滤系统型号Pellicon Mini(Millipore或等同产品)
·5KD的超滤截止膜，聚醚砜型号BIOMAX(Millipore或等同产品)，0.1m2·蠕动泵型号Masterflex或等同产品材料·浓缩的未加工r-hFSH·起始重量由DELFIA免疫测定法测出的FSH为200-400mg(75L生物反应器)·氢氧化钠粒-(Merck)·纯净水(Modulab或等同产品)·硼酸·十水四硼酸钠·氢氧化钠(颗粒)·硼酸盐缓冲液(50mM硼酸钠pH 8.5±0.1)3.06g硼酸和10g二水四硼酸钠加入900mL纯净水，搅拌，加到1L超滤过程所有操作都在冷却条件下进行(3-8℃)。
浓缩的未加工r-hFSH(1-1.5L)在以下条件下超滤·缓冲液50mM硼酸钠pH 8.5±0.1，传导性1.9±0.2mS/cm·渗透流速15-25mL/分钟·入口压力1.5-2.2巴·透膜压力1.5-1.8巴其中透膜压力(TMP)＝(入口压力+出口压力)/2rhFSH溶液浓缩至1L体积。
·保留物部分用1倍体积的纯净水稀释，然后浓缩至1L(洗涤)；·洗涤步骤再重复两次；·检查渗透传导性，如果少于1.5mS/cm则样品进入下一步，否则继续重复洗涤步骤。
渗透传导性＜1.5mS/cm·1倍体积的保留物部分用2倍体积的平衡缓冲液稀释，然后浓缩至原体积。
·此操作再重复两次。
·检查渗透的PH和传导性，如果分别是8.5±0.1和1.9±0.2mS/cm，渗透则进入下一步骤，否则重复洗涤步骤。
渗透pH＝8.5±0.1渗透传导性1.9±0.2mS/cm·收集保留物部分，超滤膜用平衡缓冲液洗涤三次，以此方法收集并集中保留物部分，至最终收集体积大约为0.6-1.2L。
收集体积0.6-1.2L·此部分贴上如下标签《起始Q》·5×0.5mL样品贮存在-20℃进行IPC。
·测量此部分体积(如不超过两天则可贮存在+5±3℃)。
·样品经如下分析280nm下的OD、pH、传导性和免疫测定(DELFIA)r-hFSH含量以及RP-HPLC。
步骤1在Q琼脂糖凝胶FF上的阴离子交换设备·层析柱XK 50/20·蠕动泵型号Masterflex或等同产品·冷却室·装备有2条记录频道的UV监测器(光径长度2.5mm)(AmershamBiosciences或等同产品)·UV分光光度计(Shimadzu或等同产品)·pH计(Metrohm或等同产品)·传导性测量仪(Metrohm或等同产品)·天平(MettlerToledo或等同产品)·蠕动泵型号Masterflex或等同产品材料·从超滤步骤得到的浓缩的未加工r-hFSH·起始量由DELFIA法测出的FSH为200-400mg
·氢氧化钠粒-(Merck)·纯净水(Modulab或等同产品)·硼酸·十水四硼酸钠·氢氧化钠(颗粒)·氯化钠·冰醋酸缓冲液·平衡缓冲液50mM硼酸钠pH 8.5±0.1，传导性1.9±0.2mS/cm·洗脱缓冲液50mM硼酸钠，0.13M NaCl pH 8.5±0.1，传导性16±1.5mS/cm·反提取剂1.5M NaCl·清洗溶液10.1M醋酸·清洗溶液20.5M NaOH·贮存溶液0.01MNaOH装柱根据厂家的用法说明用Q琼脂糖凝胶高流速树脂装柱。装好的柱尺寸如下直径5cm柱床高度11cm±10％柱床体积190-240mL纯化过程所有操作在如下条件下进行·温度3-8℃·线性流速240-280cm/小时柱的清洗层析柱至少用1个柱床体积(BV)的NaOH 0.5M冲洗，然后用3BV的纯净水漂洗。
柱的平衡层析柱用6-7或更多BV的平衡缓冲液冲洗，平衡缓冲液为50mM硼酸钠pH 8.5±0.1，传导性1.9±0.2mS/cm。
检查pH和传导性，继续洗涤直到层析柱的流出物参数在如下目标值内pH 8.5±0.1，传导性1.9±0.2mS/cm起始材料制备从超滤步骤得到的浓缩和渗滤的r-hFSH以材料部分所指示的量进行解冻。
检查pH和传导性，保留样品进行IPC(5×0.5mL)。
装样将起始材料装入平衡的层析柱。
洗涤当装样完成后，层析柱用2-3BV的平衡缓冲液冲洗。记录收集的体积，保留样品进行IPC 5×0.5mL，并丢弃此洗涤部分。
洗脱用50mM硼酸钠，0.13M NaCl pH 8.5±0.1，传导性16±1.5mS/cm开始洗脱。r-hFSH在洗脱开始后0.7-1.0BV开始流出。
根据层析图2显示的两个峰收集4.5BV的洗脱部分。
记录收集体积，抽取样品进行IPC(5×0.5mL)。洗脱部分贮存在4℃不超过两天。
此洗脱部分含有半纯化的r-hFSH。
步骤(2)在螯合琼脂糖凝胶FF上的IMAC设备·层析柱C10/40(Amersham Biosciences)·蠕动泵型号miniplus 2 Gylson或等同产品·装备有2个记录频道的UV监测器(光径长度2.5mm)(AmershamBiosciences或等同产品)·冷却室
·UV分光光度计(Shimadzu或等同产品)·pH计(Metrohm或等同产品)·传导性测量仪(Metrohm或等同产品)·天平(MettlerToledo或等同产品)·蠕动泵型号Masterflex或等同产品材料·Q琼脂糖凝胶FF后的r-hFSH·氢氧化钠粒-(Merck)·纯净水(Modulab或等同产品)·硼酸·十水四硼酸钠·氢氧化钠(颗粒)·氯化钠·EDTA·醋酸铵·硫酸铜·25％氨溶液缓冲液金属带电荷溶液0.2M硫酸铜酸化水1L纯净水中加入1mL的冰醋酸，搅拌平衡缓冲液50mM硼酸钠pH 8.25±0.1，0.5M NaCl洗脱0.75M醋酸铵pH 9.0±0.1，传导性±0.5mS/cm再生溶液0.5M NaCl，50mM EDTA清洗溶液0.5M NaOH贮存溶液0.01M NaOH装柱根据厂家的用法说明与螯合琼脂糖凝胶高流速树脂装柱。装好的柱尺寸如下直径10mm柱床高度22±10％柱床体积16-20mL
纯化过程所有操作在如下条件下进行·温度5±3℃·线性流速240-300cm/小时柱的清洗层析柱至少用1个柱床体积(BV)的NaOH 0.5M冲洗，然后用3BV的纯净水漂洗。
柱的充电用5-6BV的酸化水冲洗层析柱，直到pH＜4.5(用pH试纸)。然后用3BV的0.2M硫酸铜冲洗，再用4-5BV的酸化水冲洗直到吸收值(280nm)达到基线。
柱的平衡层析柱用6或更多BV的平衡缓冲液，50mM硼酸钠pH 8.25±0.1，0.5M NaCl，传导性50±5mS/cm冲洗。
检查pH和传导性，继续洗涤直到层析柱的流出物参数在如下目标值范围外pH 8.25±0.1，传导性50±5mS/cm起始材料制备从Q琼脂糖凝胶FF步骤得到的r-hFSH加入35％的正磷酸调节pH到8.25±0.1，加入NaCl调节传导性到50±5mS/cm。抽取样品进行IPC(5×0.5mL)。
装样将起始材料装入如上平衡的层析柱。
洗涤当装样完成后，层析柱用5-10BV的平衡缓冲液50mM硼酸钠pH8.25±0.1，0.5M NaCl，传导性50±5mS/cm冲洗。抽取样品进行IPC 5×0.5mL，并丢弃洗涤部分。
洗脱用0.075M醋酸铵pH 9.0±0.1，传导性7.2±0.5mS/cm开始洗脱。
在洗脱开始后的0.5BV之后r-hFSH开始以主峰流出。
大约在丢弃首个0.5BV溶液之后，当OD线急剧升高时开始收集5-7BV主峰的溶液。
抽取样品进行IPC(5×0.5mL)且洗脱部分贮存在3°-8℃不超过两天。
图3显示的是IMAC洗脱图。
此洗脱部分含有半纯化的r-hFSH。
步骤(2a)在DEAE琼脂糖凝胶FF上的阴离子交换设备·层析柱Vantage L 22/40·蠕动泵型号miniplus 2Gylson或等同产品·冷却室·装备有2条记录频道的UV监测器(光径长度2.5mm)(AmershamBiosciences或等同产品)·UV分光光度计(Shimadzu或等同产品)·pH计(Metrohm或等同产品)·传导性测量仪(Metrohm或等同产品)·天平(MettlerToledo或等同产品)·蠕动泵型号Masterflex或等同产品材料·IMAC后的r-hFSH·氢氧化钠粒-(Merck)·纯净水(Modulab或等同产品)·氢氧化钠(颗粒)·氯化钠·醋酸铵·25％氨溶液缓冲液平衡缓冲液0.11M醋酸铵pH 8.5±0.1，传导性±0.5mS/cm再生溶液1.5M NaCl
清洗溶液0.5M NaOH贮存溶液0.01M NaOH装柱根据厂家的用法说明用DEAE琼脂糖高流速树脂装柱。装好的柱尺寸如下直径22mm柱床高度16-17cm柱床体积65-70mL纯化过程所有操作在如下条件下进行·温度5±3℃·线性流速240-300cm/小时柱的清洗层析柱至少用1个柱床体积(BV)的NaOH 0.5M冲洗，然后用3BV的纯净水漂洗。
柱的平衡层析柱用6或更多BV的平衡缓冲液0.11M醋酸铵，pH 8.5±0.1，传导性10.2±0.5mS/cm冲洗。
检查pH和传导性，继续洗涤直到层析柱的流出物参数在如下目标值范围外pH 8.5±0.1，传导性10.5±0.5mS/cm起始材料制备从IMAC步骤得到的r-hFSH加入冰醋酸调节pH到8.5±0.1，加入纯净水调节传导性到10.5±0.5mS/cm(至少需要1倍体积的水调节传导性至目的值)。
抽取样品进行IPC(5×0.5mL)。
装样将起始材料装入如上平衡的层析柱。
洗涤当装样完成后，层析柱用3-6BV的平衡缓冲液0.11M醋酸铵，pH8.25±0.1，传导性10.2±0.5mS/cm冲洗。
抽取样品进行IPC 5×0.5mL，此部分贮存在+5±3℃不超过两天。
图4显示的是DEAE琼脂糖凝胶FF层析洗脱图。
步骤(3)在苯基琼脂糖凝胶FF HS上的疏水作用层析设备·层析柱XK 26/30·蠕动泵型号miniplus 2 Gylson或等同产品·装备有2条记录频道的UV监测器(光径长度2.5mm)(AmershamBiosciences或等同产品)·冷却室·UV分光光度计(Shimadzu或等同产品)·pH计(Metrohm或等同产品)·传导性测量仪(Metrohm或等同产品)·天平(MettlerToledo或等同产品)·蠕动泵型号Masterflex或等同产品材料·DEAE后的r-hFSH·氢氧化钠粒-(Merck)·纯净水(Modulab或等同产品)·氢氧化钠(颗粒)·氯化钠·醋酸铵·硫酸铵·25％氨溶液缓冲液平衡缓冲液50mM醋酸铵，1M硫酸铵pH 8.25±0.1，传导性142±8mS/cm洗涤缓冲液50mM醋酸铵，0.9M硫酸铵pH 8.25±0.1，传导性130±5mS/cm
洗脱缓冲液50mM醋酸铵，0.25M硫酸铵pH 8.25±0.1，传导性50±3mS/cm反提取剂纯净水清洗溶液0.5M NaOH贮存溶液0.01M NaOH装柱根据厂家的用法说明用DEAE琼脂糖凝胶高流速树脂装柱。装好的柱尺寸如下直径34mm柱床高度14-15cm柱床体积125-135mL纯化过程所有操作在如下条件下进行·温度5±3℃·线性流速240-300cm/小时柱的清洗层析柱至少用1个柱床体积(BV)的NaOH 0.5M冲洗，然后用3-5BV的纯水漂洗。
柱的平衡层析柱用5-6或更多BV的平衡缓冲液50mM醋酸铵，1M硫酸铵，pH8.25±0.1，传导性140±8mS/cm冲洗。
检查pH和传导性，继续洗涤直到层析柱的流出物参数在如下目标值范围内pH 8.25±0.1，传导性140±8mS/cm起始材料制备从DEAE步骤得到的r-hFSH加入1M硫酸铵并加入25％的氨溶液调节pH到8.25±0.1。
抽取样品进行IPC(5×0.5mL)，将此部分装入苯基柱。
装样将起始材料装入如上平衡的层析柱。
装样后洗涤当装样完成后，层析柱用3-6BV的平衡缓冲液50mM醋酸铵，1M硫酸铵，pH 8.25±0.1，传导性140±5mS/cm冲洗。
抽取样品进行IPC 5×0.5mL，并丢弃此洗涤部分。
洗涤当装样完成后，层析柱用3-6BV的洗涤缓冲液50mM醋酸铵，0.9M硫酸铵，pH 8.25±0.1，传导性130±5mS/cm冲洗。
抽取样品进行IPC 5×0.5mL，并丢弃此洗涤部分。
洗脱用洗脱缓冲液开始洗脱过程。
在洗脱开始后的0.5-0.8BV之后r-hFSH开始以主峰流出。
根据层析图5，当吸收值(280nm)升高时开始收集3-4BV主峰。
抽取样品进行IPC(5×0.5mL)且此洗脱部分贮存在+5±3℃不超过一天。
步骤(4)在Source 30 RPC上的反相层析设备·层析柱Vantage L 22/40·装备有2条记录频道的UV监测器(光径长度2.5mm)(AmershamBiosciences或等同产品)·蠕动泵(Minipulse 2 Gillson或等同产品)·UV分光光度计(Shimadzu或等同产品)·pH计(Metrohm或等同产品)·传导性测量仪(Metrohm或等同产品)·天平(Mettler Toledo或等同产品)材料·HIC后的r-hFSH中间体·Source 30 RPC树脂(Amersham Biosciences)·醋酸铵-Merck·冰醋酸-Merck·氢氧化钠粒-Merck·50％NaOH溶液-J.T.Baker
·25％氨溶液-Merck·2-丙醇-Merck·氢氧化钠粒-Merck缓冲液碱性缓冲液50mM醋酸铵pH 7.6±0.2，传导性6.5±0.5mS/cm平衡缓冲液50mM醋酸铵pH 7.6±0.2，含有13％的2-丙醇(V/V)洗脱缓冲液50mM醋酸铵pH 7.6±0.2，含有20％的2-丙醇(V/V)再生溶液50mM醋酸铵pH 7.6±0.2，含有35％的2-丙醇(V/V)清洗溶液0.5M NaOH贮存溶液0.01M NaOH装柱根据厂家的用法说明用Source 30 RPC树脂装柱。装好的柱尺寸如下直径22mm柱床高度13-14cm柱床体积49.4-53.2mL纯化过程起始材料制备将HIC后的中间体加到含有13％(V/V)2-丙醇的层析柱中。
所有操作在如下条件下进行温度室温(+20±5℃)线性流速300-450cm/小时柱的清洗层析柱至少用1个柱床体积(BV)的NaOH 0.5M冲洗，然后用6BV的纯净水漂洗。
柱的平衡层析柱用7-10或更多BV的平衡缓冲液50mM醋酸铵，pH 7.6±0.2，含有13％的2-丙醇(V/V)冲洗。
装样将如上准备的起始材料HIC后的r-hFSH装入层析柱。
装样后洗涤当装样完成后，层析柱用7-10BV的平衡缓冲液冲洗。
抽取样品进行IPC 5×0.5mL，并丢弃此洗涤部分。
洗脱用洗脱缓冲液开始洗脱过程。
在洗脱开始后的0.5-0.8BV之后r-hFSH开始以主峰流出。
根据层析图6，当吸收值(280nm)升高时开始收集5-7BV主峰。收集完成后将溶液用纯净水按1∶2稀释，减少与r-hFSH接触的2-丙醇的百分比。
抽取样品进行IPC(5×0.5mL)且此洗脱部分贮存在+5±3℃不超过一天。
此洗脱部分含有纯化的r-hFSH。
柱的再生洗脱完成后，层析柱用至少3BV的再生缓冲液冲洗。
抽取样品进行IPC(5×0.5mL)，并丢弃此部分。
清洗用3BV的0.5M NaOH然后至少1-2BV的水冲洗层析柱，停止冲洗1小时，再用6BV的纯净水冲洗层析柱。
贮存用3BV的贮存溶液0.01M NaOH冲洗层析柱，且贮存至下一次使用。
步骤5大量超滤设备·1Vivaflow 200PE S，RC或Hydrosart截止5KD(Sartorius)·蠕动泵(型号Masterflex或等同产品)·UV分光光度计(Shimadzu或等同产品)·pH计(Metrohm或等同产品)·传导性测量仪(Metrohm或等同产品)材料·r-hFSH-HIC洗脱物
·氢氧化钠粒-(Merck)·纯净水(Modulab或等同产品)·氮(操作压力3巴)-UPP级缓冲液渗滤溶液r-hFSH用纯净水超滤清洗溶液0.5M NaOH贮存溶液0.5M NaOH过程所有操作在冷却室进行(+5±3℃)。
超滤r-hFSH-HIC洗脱物溶液在Vivaflow系统中循环，然后浓缩至容量小于20ML。
保留物部分用4倍体积的纯净水稀释，然后浓缩至＜20ML。
洗涤步骤按如前所述方法重复5-7次。
渗透的pH和传导性分别为7.1±0.2和6.2±0.5Ms/cm.如果在此值范围外，则重复洗涤步骤。
渗透pH＝7.1±.2--渗透传导性＝6.2±0.5Ms/cm以合适的容积收集保留物部分，根据OD(280nm)得到r-hFSH最终浓度大约为0.5-0.7mg/mL。
抽取样品(10×0.5Ml)进行分析。样品和散料都贮存在-20℃。
步骤6去除病毒的纳米级过滤步骤材料和设备·r-hFSH中间体溶液(DEAE后或RPC后超滤的)·47mm预过滤器型号Fluorodine II FTKDJL(Pall)或VVLP 0.1μ(Millipore)；·47mm过滤器型号NFP(Millipore)或DV20(Pall)；·纯净水
·pH试纸·氢氧化钠·经调节氮源·完全不锈钢过滤系统(Millipore)·硅和聚乙烯管缓冲液清洗溶液0.5M NaOH过程所有操作在室温下进行(+23±3℃)。
纳米级过滤将DEAE后或RPC后超滤过的rFSH注入系统，在0.1μ的过滤器上预先过滤，过滤开始时打开氮压直到起始压力为0.5巴，位于圆盘固定器的出口阀打开，以净化系统。
当第一滴溶液出现时，关掉圆盘固定器的出口阀，氮压力上升到2.3-2.8巴。
氮压维持在2.3-2.8巴，溶液进行过滤。
操作条件总结如下
样品的生物活性用Steelman-Pohley卵巢重量增加方法测定纯化的r-hFSH生物活性。可以用生物活性除以在280nm处吸收所测定的蛋白质含量(假设ε＝9.95M-1cm-1)，也可以用生物活性除以用劳里法测定的蛋白质含量来计算比活性。纯化的r-hFSH散料比活性显示于表1。
表1本发明的纯化的r-hFSH散料比活性
序列表<110>应用研究系统ARS股份公司(APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDINGN.V.)<120>FSH纯化<130>WO 893<160>5<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>92<212>PRT<213>智人<400>1Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro1 5 10 15Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys20 25 30Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu35 40 45Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser50 55 60Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr65 70 75 80Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90<210>2<211>111<212>PRT<213>智人<400>2Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu100 105 110<210>3<211>108<212>PRT<213>智人<400>3Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu100 105<210>4<211>109<212>PRT<213>智人<400>4Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met100 105<210>5<211>110<212>PRT<213>智人<400>5Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys100 105 110
权利要求
1.一种重组人FSH或FSH变异体的纯化方法，其特征在于，所述的纯化方法包括使FSH经受以下步骤(1)离子交换层析；(2)固定金属离子层析；(3)疏水作用层析(HIC)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离子交换层析采用一种强阴离子交换树脂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的阴离子交换树脂是Q琼脂糖凝胶FF或一种有类似性质的树脂。
4.如权利要求1至3中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的离子交换层析用硼酸盐缓冲液作为洗脱液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的硼酸盐缓冲液pH值为8.5或大约为8.5。
6.如权利要求1至5中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的固定金属离子层析用一种有三齿螯合基团的树脂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的螯合基团是亚氨基二乙酸。
8.如权利要求1至7中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的固定金属离子层析用螯合琼脂糖凝胶FF或一种有相似性质的树脂。
9.如权利要求1至8中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的固定金属离子层析用一种选自Cu2+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Mg2+和Co2+的金属离子。
10.如权利要求1至8中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的固定金属离子层析用Cu2+。
11.如权利要求1至10中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的固定金属离子层析用醋酸铵作为洗脱液。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的醋酸铵缓冲液pH值为9或大约为9。
13.如权利要求l至12中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的疏水作用层析(HIC)用苯基琼脂糖凝胶FFHS或有相似性质的树脂。
14.如权利要求1至13中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的疏水作用层析(HIC)用醋酸铵(50mM)/硫酸铵(0.25M)作为洗脱液。
15.如权利要求1至14中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的方法包括在固定金属离子层析步骤之后以及疏水作用层析之前的第二次离子交换层析步骤(2a)。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的第二次离子交换层析步骤用一弱阴离子交换树脂。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的弱阴离子交换树脂是DEAE琼脂糖FF树脂或一有相似性质的树脂。
18.如权利要求l至17中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括在疏水作用层析步骤之后进行的反相层析步骤(4)。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的反相层析用Source 30RPC作为树脂或一有相似性质的树脂。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的反相层析用醋酸铵(50mM，pH值为7.6或大约为7.6)与20％(v/v)的2-丙醇。
21.如权利要求18、19或20所述的方法，其特征在于，所述的方法包括在反相层析步骤之后的超滤步骤(5)。
22.一种人重组FSH的纯化方法，其特征在于，所述的方法包括使FSH经受以下步骤(0)超滤；(1)在Q琼脂糖凝胶FF上用50mM或大约50mM的硼酸盐，0.13M或大约0.13M的NaCl，pH值8.5或大约为8.5作为洗脱液进行阴离子交换层析；(2)将步骤(1)的洗出液在螯合琼脂糖凝胶FF上进行固定金属离子亲和层析步骤，以Cu++为金属离子，以0.75M或大约0.75M醋酸铵，pH值为9或大约为9作为洗脱液；(2a)将步骤(2)的洗出液在DEAE琼脂糖凝胶FF上进行阴离子交换层析步骤，以0.11M或大约0.11M醋酸铵，pH值为8.5或大约为8.5作为洗脱液；(3)将步骤(2a)的洗出液在苯基琼脂糖凝胶FF HS上进行疏水作用层析步骤，以50mM或大约50mM醋酸铵，0.25M或大约0.25M硫酸铵，pH值为8.25或大约为8.25作为洗脱液；(4)将步骤(3)的洗出液在Source 30RPC上进行反相层析步骤，用50mM或大约50mM醋酸铵，pH值为7.6或大约为7.6和20％(v/v)或大约20％(v/v)的2-丙醇；(5)将步骤(4)的洗出液进行超滤；以及(6)将步骤(5)的滞留物进行纳米级过滤。
23.一种纯化的重组人FSH或FSH的变异体，其特征在于，所述的纯化的重组人FSH或FSH的变异体通过权利要求1至22中的任一权利要求所述的方法得到。
24.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物包括如权利要求23所述的人FSH或FSH变异体。
全文摘要
本发明提供一种重组FSH的纯化方法。
文档编号C07K14/59GK1890265SQ200480036591
公开日2007年1月3日 申请日期2004年12月16日 优先权日2003年12月22日
发明者M·罗西 申请人:阿雷斯贸易股份有限公司