专利名称：：一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法及其专用芯片和试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因分析领域中一种鉴别基因突变类型的方法及其专用芯片与试剂盒。
背景技术：
：随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来，鉴定并描述的人类致病基因和药物相关基因越来越多，基因突变作为基因发生的可遗传性变异，往往可以导致基因的功能发生改变，因此通过对有显著功能意义的基因突变进行检测，可以推动临床疾病的预防、诊断和治疗，这己成为当今生命科学研究的热点之一，而大规模快速的基因突变检测方法也受到了人们的高度重视。目前国内外对基因突变进行检测的方法主要有以下几种直接测序法根据突变位点所在基因的序列进行PCR扩增，将产物直接进行测序，对突变位点的基因型进行直接解读，这是目前对基因突变进行检测的金标准，但是这种方法操作复杂，成本较高，需要用到专门的测序仪，因此仅用于科研，不适于在临床检测中广泛应用。聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析，即PCR-RFLP，原理为将待测的DNA片段PCR扩增后用限制性内切酶进行酶切，将酶切后的产物进行电泳，根据酶切片段的大小和数目来判断目的基因是否存在基因突变。这种方法应用较广，但标准化程度差，对混合基因型的检测能力低，检测基因突变时，对于l个碱基以上的突变，需要多个检测系统分别检出，另外还需要进行凝胶的溴乙锭染色，存在着较大的环境污染和对人体健康的损害。聚合酶链式反应-单链构想多态性分析，即PCR-SSCP法，原理是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依据其碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70%-95%，但当片段大于400bp时，检出率仅为50%左右，而且该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。与PCR-RFLP—样，该法由于需要制备聚丙烯酰胺凝胶，也存在较大的环境污染。等位基因特异性引物PCR，即PCR-SSP，该方法是利用与等位基因序列互补的引物，对待测样本DNA进行特异性PC財广增，等位基因特异性引物仅与其匹配的特异突变序列结合并特异性地扩增出等位基因特异性片段，用琼脂糖凝胶电泳对特异性PCR扩增产物进行检测，根据特异性PC財广增产物的出现与否，对待侧样本的基因型别进行判断。这种方法操作简单、耗时短，对设备要求不高，结果判断容易，但缺点是反应条件不易控制，无法实现高通量，而且同样存在环境的污染。以上的几种方法都仅适用于小样本量和少量基因突变位点的检测，要实现大样本高通量的基因检测，目前最理想的方法是基因芯片检测技术，与其他技术相比较，基因芯片具有体积小、重量轻、成本低，便于携带，防污染，分析过程高通量、高度自动化和速度快，所需样品和试剂少等诸多优点，近年来该种技术得到了人们的极大关注并取得了迅速发展，并有多个基于基因芯片技术进行的基因突变的检测的产品问世。目前用于突变检测的大多是序列特异性探针杂交法(SSOP)基因芯片技术，该种技术利用寡核苷酸基因芯片的高通量和高度并行性的特点，对发生突变的众多基因设计序列特异性的寡核苷酸探针，将这些探针固定于同一张基片上，将待测的包含突变位点的基因片段进行体外扩增后与芯片杂交，根据杂交的信号判断突变位点的基因型。这种方法的基本原理是与基因特定序列互补的一段序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)对基因序列的特异性识别。当探针的序列与基因序列完全匹配时所形成的杂交体热稳定性高于含有错配碱基的杂交体，据此通过控制杂交温度和其他杂交条件可以使完全匹配的杂交体与含有错配碱基的杂交体区分开来，从而达到基因分型的目的。上述芯片技术尽管从理论上可以利用含有错配碱基的探针和目标基因形成的杂合体稳定性差的现象对基因序列上的碱基变化进行检测，但是往往由于碱基错配形式不同、基因序列不同、基因高级结构的差异等因素造成实际情况比理论情况要复杂得多，为了提高探针对单个碱基变化的检测准确率，一般倾向于把探针设计的较短，但是为了保证探针对基因识别的特异性和维持较高的杂交信号强度又不能使探针过短，而且即使是相同长度的探针也会由于其GC含量不同、所检测的突变碱基在探针上的相对位置不同等原因使得这种基于探针杂交的过程变得十分复杂，短探针与靶序列的杂交特异性问题这时候就变得非常突出，具体的表现就是野生型探针和突变型探针在杂交时都会出现非特异性的杂交信号，无法做到检测信号的"全或无"，必须严格控制杂交条件并反复摸索才能够准确地区分基因型。目前也有一些方法可以用来提高探针检测基因序列变化，尤其是单个碱基变化的特异性，例如对核酸上的戊糖进行化学修饰以提高探针Tm值的方法(LNA法)、用肽核酸代替核酸作为探针的方法(PNA法)。另外，还有人用碱基类似物(如3硝基砒硌)对寡核苷酸探针中的某个碱基进行替换从而拉大完全匹配和含单碱基突变探针之间Tm值得差异性。这些方法都因为实际操作难度大、成本高等原因局限在实验室阶段，无法用于大范围推广使用。因此，目前迫切需要建立一种操作方便、价格便宜、实用性强的方法来提高探针杂交的特异性，使寡核苷酸芯片在基因序列分析中发挥更大的作用。
发明内容本发明的目的在于针对上述基因突变检测中存在的问题，提供一种利用基因芯片技术对基因突变，尤其是药物相关基因突变进行快速、敏感、高通量和特异性检测的方法及其专用芯片和试剂盒。一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法，包括如下步骤以待检测的来自于人体组织的基因组为模板，用针对突变位点设计的引物组和没有3'-5'端外切酶活性的DNA聚合酶进行多重等位基因特异性PCR扩增，然后将得到的PCR产物与相应的根据该突变位点设计的等位基因特异性探针进行杂交，根据杂交结果确定各基因位点的突变类型；其中所说的引物组包括以下5条引物野生型等位基因内引物Innerprimer-W、突变型等位基因内引物Innerprimer-M、野生型等位基因外引物Outerprimer-W、突变型等位基因外引物Outerprimer-M、特异性扩增辅助引物GC-primer;所述等位基因特异性内引物的结构为靠近其5'端的是一段长度为8-15nt的由G和C组成的与模板DNA不匹配的序列；靠近其3'端的是一段包括17-30nt的序列，且3'端最后一个碱基恰好位于待检测的一个基因突变位点上，与该位点的突变型或野生型碱基匹配，其余碱基与突变位点前的相应片段完全匹配；所述各个位点共用的特异性扩增辅助弓I物GC-primer是一段由G和C组成的序列，该序列与所述等位基因特异性内引物的靠近5'端部分完全相同；每个基因突变位点对应两组寡核苷酸探针，分别对应于野生型等位基因和突变型等位基因，每组探针又包括一条长度为14-25nt的等位基因特异性短探针和一条长度为50-70nt等位基因特异性长探针，所述的每个突变位点的野生型等位基因特异性探针和突变型等位基因特异性探针分别与前面所描述的经等位基因特异性扩增生成的包含该突变位点的野生型碱基和突变型碱基的核苷酸片段匹配；所述等位基因基因特异性短探针与扩增片段上包含该基因突变位点的一段序列匹配，所述等位基因基因特异性长探针与位于扩增片段上该基因突变位点下游但不包含该位点的一段序列匹配。本发明所提供的基因突变检测方法，是以待检测的来自于人体组织的基因组为模板，用针对特定突变位点设计的引物组和没有3'-5'端外切酶活性的DNA聚合酶进行多重等位基因特异性PCR扩增，然后将得到的PCR产物与基因芯片上的寡核苷酸探针(等位基因特异性探针)进行杂交，根据杂交结果确定各基因位点的突变类型。所述等位基因特异性探针，是指针对待测基因突变位点的特定基因型所设计的探针。针对每一位点设计的引物组包括一对位于不同DNA链上的等位基因特异性内引物(Innerprimer)和对应的两条外引物(Outerprimer)，以及各个突变位点共用的一条特异性扩增辅助引物(GC-primer)。所述等位基因特异性引物(包括内引物和外引物)，是指针对待测基因突变位点的特定基因型所设计的引物。具体来说，每个基因突变位点的引物组包括以下5条引物野生型等位基因内引物Innerprimer-W、突变型等位基因内引物Innerprimer-M、野生型等位基因外引物Outerprimer-W、突变型等位基因外引物Outerprimer-M、特异性扩增辅助引物GC-primer。所述等位基因特异性内引物的结构为靠近其5'端的是一段长度为8-15nt的由G和C组成的与模板DNA不匹配的序列；靠近其3'端的是一段包括17-30个碱基的序列，且3'端最后一个碱基恰好位于待检测的一个基因突变位点上，与该位点的突变型或野生型碱基匹配，其余碱基与突变位点前的相应片段完全匹配；优选在3'端倒数第2或第3位处引入一个人工错配的碱基。所述等位基因特异性外引物可根据相应的等位基因特异性内引物和待扩增的基因片段设计并合成，本领域的一般技术人员均可以掌握，详细操作步骤可参考《分子克隆实验指南》([美]J.萨姆布鲁克著，科学出版社)。所述各个位点共用的特异性扩增辅助引物(GC-primer)是一段由G和C组成的寡核苷酸序列，用于在反应体系中促进特异性扩增反应的进行，故名。GC-primer的序列与所述等位基因特异性内引物的靠近5'端部分完全相同。GC-primer的5'端标记有荧光分子或可通过化学发光或固体微粒进行标记检测的分子，这些分子包括地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等，这些标记及其标记方法以及各标记物的检测方法都已是本领域众所周知的常规技术，本发明优选对共用特异性扩增辅助引物的5'端进行Cy5标记。所述位于基因芯片上的等位基因特异性探针对各基因突变位点设计，每个基因突变位点对应两组探针，分别对应于野生型等位基因和突变型等位基因，每组探针又包括一条等位基因特异性短探针(长度为14-25nt)和一条等位基因特异性长探针(长度为50-70nt)。所述的每个突变位点的野生型等位基因特异性探针(包括野生型短探针SP-W和野生型长探针LP-W)和突变型等位基因特异性探针(包括突变型短探针SP-M和突变型长探针LP-M)分别与前面所描述的经等位基因特异性扩增生成的包含该突变位点的野生型碱基和突变型碱基的核苷酸片段匹配。即SP-W和LP-W与Innerprimer-W和Outerprimer-W扩增生成的片段P,P2匹配，SP-W对应于P^上包含野生型碱基的一段序列，LP-W对应于PtP2上该基因突变位点下游但不包含该位点的一段序列；SP-M和LP-M与Innerprimer-M和Outerprimer-M扩增生成的片段&4匹配，SP-M对应于&^上包含野生型碱基的一段序列，LP-M对应于P3P4上该基因突变位点下游但不包含该位点的一段序列。PA和P3P4分别来自于双链DNA模板的不同单链。本发明的技术路线参考图10。用上述引物组进行的等位基因特异性PCR扩增的原理如下1)野生型等位基因内引物和突变型等位基因内引物分别与模板DNA双链的两条单链互补，且3'端正好与SNP位点重合，而引物的3'端是否与模板匹配决定了引物的延伸反应是否可以进行下去；只有当野生型等位基因存在时(即基因型为野生型纯合子或突变杂合子)，野生型等位基因内引物(Innerprimer-W)和与之对应的野生型等位基因外引物(Outerprimer-W)才可以扩增出包括相应待检测基因突变位点的野生型碱基在内的核苷酸片段；只有当突变型等位基因存在时(即基因型为突变型纯合子或突变杂合子)，突变型等位基因内引物(Innerprimer-M)和与之对应的突变型等位基因外引物(Outerprimer-M)才可以扩增出包括相应待检测基因突变位点的突变型碱基在内的核苷酸片段。2)在引物的3'端倒数第2或第3位处引入一个人工错配的碱基，可以提高上述延伸反应的特异性。3)所述各个位点共用的特异性扩增辅助引物(GC-primer)的序列与内引物的5'端部分完全一致，在PCR反应的最初循环，该引物不起作用，一旦内引物中的任一条或两条同时与模板结合并延伸，与之相对应的外引物向其5'端方向延伸，就形成了一段可以与GC序列完全互补的序列，在以下的循环延伸反应中，将以此片段为模板，在GC-primer和外引物的作用下进行PCR扩增反应，这样可以使特异性延伸产物的量增加。4)对GC-primer进行5'端标记，可以使生成的等位基因特异性扩增产物的5'端也带有标记，可以被用来方便地对扩增产物进行检测，避免了对每个待检测基因突变位点的每条引物都进行标记的麻烦。本发明可以用来检测药物相关基因的常见有功能意义的SNP突变，药物相关基因是人体内编码与药物代谢和发挥药理学效应密切相关的药物代谢酶、药物转运体及药物作用耙点的基因，其基因突变可对人体的药物反应性产生显著影响，对其常见基因突变进行检测，并利用检测的结果调整用药方案，是当前药物治疗学领域的一大发展方向。根据本发明的实施例，所选择的药物相关基因突变位点如下表所示表1本发明涉及到的药物相关基因突变位点<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>⑧上表中相关药物的编号为①抗高血压药物②抗肿瘤药物③抗糖尿病药物调脂药物(D抗心率失常药⑥质子泵抑制剂⑦中枢神经系统药物/镇痛药⑧抗凝药⑨抗心绞痛上述各个突变位点的等位基因特异性内引物的序列(靠近3'端的序列)以及各个突变位点共用的特异性扩增辅助引物的序列如下表2根据本发明实施例所选取的涉及的药物相关基因突变的等位基因特异性内引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上表中，针对每一药物相关基因的突变位点设计了一条野生型等位基因内引物(innerP-W)序列和一条突变型等位基因内引物(innerP-M)序列，在实际使用中，可选择一个或多个突变位点的两个序列的3'端任意连续17-30个碱基(包括3'端的野生型或突变型碱基在内)作为内引物的序列。另外，为了提高等位基因特异性扩增的效率，可以在靠近内引物的3'端引入一个人工错配的碱基，一般是在3'端的倒数第2或第3位上引入，所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物，所述类似物包括尿嘧啶(U)、肽核酸(PNA)和锁定核酸(LNA)，这属于本领域技术人员熟知的方法。本发明所述的基因芯片包括固相支持物和有序固定在固相支持物上的若干种寡核苷酸探针(等位基因特异性探针)。所述的固相支持物可釆用基因芯片领域常用的各种材料，如但不限于经活性基团修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片、各种纤维膜、尼龙膜等，用于修饰的活性基团如但不限于醛基、氨基、巯基、羧基等，本发明优选醛基化修饰的玻片。本发明所涉及的用于检测表1中各突变位点的等位基因特异性短探针序列来自下述表3中17对单链核苷酸片段中的一对或任意多对，由所述17对单链核苷酸片段上的包括基因突变位点(方框内的碱基)在内的任意连续14-25个碱基组成，所述17对单链核苷酸片段的核苷酸序列分别是下表中的序列36至序列69。表3本发明涉及的药物相关基因突变的等位基因特异性短探针序列<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本发明所述基因芯片的等位基因特异性长探针根据每个基因突变位点的序列特点设计并优化，本发明优选的长探针序列为下述n对单链核苷酸片段中的一对或任意多对，所述17对单链核苷酸片段的核苷酸序列分别是序列表中的序列70至序列103。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在上述设计的各探针序列的基础上，为了控制杂交过程中各种因素对杂交信号值的干扰和对杂交过程进行评估，本领域技术人员还可通过本领域熟知的方法设计并合成芯片质控对照、阴性对照、阳性对照、空白对照等质控探针。在上述设计的各探针序列的基础上，本领域技术人员可通过本领域熟知的方法进行探针合成，并通过对探针3'端或5'端增加间隔臂(如聚胸腺苷酸、聚四乙二醇等)，来增加杂交容量；以及对其3'端或5'端进行化学集团修饰(比如氨基化修饰)，使探针能通过化学键结合到相应的固相支持物上(如醛基化玻片)；本发明优选对探针的3'端进行氨基修饰，其相较5'端修饰的探针具有更好的杂交效果。根据本发明的另一方面，提供一种用于检测基因突变的试剂盒，其至少包括本发明的上述引物(包括内引物、外引物和/或特异性扩增辅助引物，不同位点的上述引物可以分开放置，也可以组成引物混合物)和基因芯片(包括固相支持物和寡核苷酸探针，探针可以固定在固相支持物上，也可不固定在固相支持物上)，本发明的试剂盒还可以进一步包含下述试剂中的一种或几种从待检样本中提取DNA的样本处理试剂;PCR扩增试剂；杂交试剂；显色试剂。上述样本处理试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂以及显色试剂均可以使用本领域技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种试剂，这些试剂必要时可以包括在试剂盒中，也可以将其配方列明在试剂盒的说明书中由使用者按照说明书中的指示自行配制。本发明的试剂盒中还可以包括相应的阴性对照和/或阳性对照样本。本发明的引物(包括内引物、外引物和/或特异性扩增辅助引物)、芯片(包括固相支持物、短探针、长探针、各种指控探针)及其试剂盒(包括引物、芯片和/或其他试剂)可以针对一个基因突变进行设计，也可以组合用于检测多个基因突变。常见的组合包括-1、以SEQIDNO.1-16所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQIDNO.36-51所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQIDNO.70-85所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测常见药物代谢酶(CYP2C9、CYP2Q9、CYP2D6、CYP3A5、TPMT、ALDH2)的基因突变rsl057910、rs3758581、rsl7878459、rs4986893、rs776746、rsl065852、rsl142345和rs671，确定患者对相关药的代谢活性。2、以SEQIDNO.17-24所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQIDNO.52-59所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQIDNO.86-93所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测常见药物转运体(匿l、BCRP、SLC22A1、SLC22A6)的基因突变rsl045642、rs2231142、rs2282M3和rs4149056，确定患者对相关药的转运和清除能力。3、以SEQIDNO.25-34所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQID16NO.60-69所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQIDNO.94-103所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测常见药物作用革巴点(ADRBl、AGTRl、V丽C1)的基因突变rsl801252、rsl801253、rs5186、rs9934438和rs7294,确定患者对相关药的敏感性。较为优选的实施方案为，以SEQIDNO.1-34所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQIDNO.36-69所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQIDN0.70-103所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测上述各药物代谢酶、药物转运体和药物作用靶点的常见基因突变，确定患者对相关药物的体内转运与代谢清除情况以及机体对药物的敏感性。本发明的基因芯片可以根据点样区域的数目分为l人份、2人份和多人份不等，本发明根据实际应用的需要优选2人份的设计方案，即在基片上设置2个点样区域，分别点上所需的探针，一次可检测2份生物样品。本发明的优点包括1、可以全面、系统、高通量地检测基因突变，与PCR—RFLP和测序法相比较，本发明环境污染轻，操作简单快捷。2、与常用的SSOP芯片相比较，本发明通过等位基因特异性扩增和设置两对等位基因特异性探针(短探针和长探针)，极大的提高了探针杂交的特异性，可以克服SSOP芯片检测中不可避免的非特异性杂交现象，实现野生型探针与突变型探针检测的"全或无"，极大地提高了芯片检测的准确性和特异性。3、另外，本发明没有在每个等位基因特异性引物上设置标记，而是将标记统一设置在特异性扩增辅助引物上，一次标记就可以满足各种等位基因特异性扩增的需要，减少了芯片检测的成本。图1为实施例1双探针基因突变检测芯片平面图2为实施例2芯片扫描图3为实施例3常规SSOP芯片扫描图4为实施例3双探针基因检测芯片扫描图5实施例4芯片A扫描图6实施例4芯片B扫描图；图7:实施例5芯片C扫描图；图8:实施例5芯片D扫描图；图9:实施例5芯片E扫描图；图10:专利技术路线图ll:基因突变芯片检测系统的制备流程图。具体实施例方式下面，结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。实施例1基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变芯片检测系统的制备。本实施例中的探针和引物的设计与合成、芯片制备等均是本领域一般技术人员熟练掌握的技能，详细操作步骤可参阅《分子克隆试验指南》(([美]J.萨姆布鲁克著，科学出版社)1、制备流程见附图11。2、制备所需的主要原辅材料及仪器设备表6<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>3.1芯片检测位点的选取选取表1中的rsl057910、rs3758581、rsl7878459、rs4986893、rs776746、rsl065852、rsl142345、rs671、rsl045642、rs2231142、rs2282143、rs4149056、rs腿252、rs醒253、rs5186、rs9934438和rs7294这17种基因突变作为本实施例的目标检测位点。3.2寡核苷酸探针的设计与合成根据表3的SEQIDNO.36-69所示的序列，结合实验条件优化选取包括基因突变位点(方框内的碱基)在内的连续19个碱基(基因突变位点位于中间，前后各9个碱基)组成本实施例的等位基因特异性短探针。如根据SEQIDNO.39所示的序列AGGAAGAGATTGAACGTGTCglTGGCAGAAACCGGAGCCCC，取包括基因突变位点(方框内的碱基G)在内的连续19个碱基组成rs3758581的等位基因特异性短探针GAACGTGTC§TTGGCAGAA。本实施例的等位基因特异性长探针序列如序列SEQIDN0.70-103所示。上述等位基因特异性短探针和长探针在确定序列构成后委托上海Invitrogen公司合成。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>第一步处理基片——选用76mmX25咖Xlmm超平片，将超平片浸于新配的重铬酸钾洗液中，放置7天后，用去离子水清洗，晾干；配制氨基硅烷的乙醇溶液，浓度分别为2%，将玻片浸入上述溶液中分别作用15分钟，取出用去离子水洗净，晾干；将上述氨基化处理的超平片分别浸入5%的戊二醛PBS(0.2mol/lM，p朋.O)溶液中，分别作用30分钟，PBS溶液清洗晾干。第二步设置点样区域一一按图(1)所示的基因芯片平面结构图，在一块玻璃介质的基片上划分为两个基因探针点样区域，每个点样区域的面积为10mm*12mm，在每个点样区域内如表4所示呈阵列式分布以下基因探针，其中SP-W、LP-W、SP-M、LP-M分别代表每个基因突变位点的野生型等位基因短探针、野生型等位基因长探针、突变型等位基因短探针、突变型等位基因长探针。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>第三步点样与点样后处理^针溶液各取2ul，用点样仪按上述格式打印到处理过的基片上；室温干燥放置18小时；干燥后立即使用或贮存于4r备用。3.4引物的设计与合成根据表2中SEQIDNO.1-34所示的序列，结合实验条件优化选取每个位点的innerP-W和innerP-M两个序列的3'端连续17个碱基(包括3'端的野生型或突变型碱基在内)作为该位点野生型等位基因内引物和突变型等位基因内引物的序列，为提高等位基因特异性扩增的特异性，在每个序列的3'端倒数第3个碱基处引入一个人工错配的碱基。如根据SEQIDN0.4所示的序列5，-CTGCATGCAGGGGCTCCGGTTTCTGCCAAG-3，，取包括3'突变型碱基C在内的连续17个碱基组成rs3758581的突变型等位基因内引物(innerP-M)5，-CTCCGGTTTCTGCCAAg-3，。相应的野生型等位基因外引物和突变型等位基因外引物利用本领域技术人员熟知的设计方法确定其序列。特异性扩增辅助引物的序列如SEQIDN0:35所示。上述确定了序列的引物委托上海Invitrogen公司合成，所有等位基因特异性内引物的5'端均连接上了与特异性扩增辅助引物完全相同的一段GC序列，特异性扩增辅助引物的5'端用荧光分子Cy5进行标记。3.5基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变芯片检测系统的构成。检测系统主要由寡核苷酸芯片、杂交液、洗涤母液、各检测基因位点的PCR反应液(包括引物、dNTP、buffer等)、没有3'-5，端外切酶活性的DNA聚合酶和阳性参照DNA标本等组分构成，寡核苷酸芯片fC冷藏保存，其他组分于-2(TC冷冻保存，其中PCR反应液需避光。实施例2用实施例1的芯片检测系统检测已知基因型的临床样本的相关基因突变。1、临床样本的处理采集某已知基因型(用金标准测序法确定)的待检测个体的外周静脉血2ml，使用PromegaDNA抽提试剂盒抽提DNA，也可用自配的DNA抽提试剂进行抽提，两种方法均为本领域技术人员所公知。DNA浓度应大200ng/ul,用紫外分光光度计检测A260/A280比值，此比值应介于1.601.80之间。经测序检测，该样本的17个药物相关基因突变的基因型为rsl057910-WW、rs3758581-WW、rsl7878459-丽、rs4986893-WW、rs776746-應、rsl065852-丽、rsl142345-丽、rs671-丽、rsl045642-■、rs2231142-WW、rs2282143-丽、rs4149056-Wff、rsl801252-醒、rsl801253-WW、rs5186-WM、rs9934438-丽、rs7294-WW(WW代表野生纯合子，1VM代表突变杂合子，MM代表突变纯合子)。2、PCR扩增针对每个突变位点的PCR反应体系为模板DNA50ng;野生型等位基因外引物0.4拜ol/L;突变型等位基因外引物O.^mol/L;野生型等位基因内引物O.7pol/L;突变型等位基因内引物0.7pmol/L;特异性扩增辅助引物O.7pmol/L;HotstarTaqDNA聚合酶O.375U，2.5mmol/L的dNTP混合物1.2ul;IO倍浓度的PCRBufer1.5ul;灭菌蒸馏水(使最终体积为20ul)。PCR反应程序为95。C预变性6min，热循环40次(95。C，30S;56°C，30s;72°C，40s)，72。C延伸10min，4"C保存。本实施例共扩增对应17个基因检测位点的17管PCR产物。用PCR方法扩增染色体基因特定片段的方法已经是本领域的公知技术，其中的关键在于引物设计，利用本发明公布的引物序列，本领域的技术人员可根据经验或有关文献确定反应体系和扩增程序，独立完成该操作步骤。3、芯片杂交取经43。C预热的杂交液7.5uL，加入15管PCR产物各3iiL，混勾，全部吸取混合液转移到芯片的点样区域；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进43'C水浴保温2小时。本发明扩增产物与基因芯片之间的杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般技术人员依照经验可以确定有关缓冲液、样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。4、洗片打开杂交舱，取出芯片，用洗涤液漂洗30秒，再置于去离子水中于室温洗涤30秒，取出，在离心机上瞬时离心30秒，甩去芯片上残留液体。5、扫描将干燥后的芯片立即用GenePix4100A扫描仪扫描,PMT设置为600,激光波长为635nm;扫描图像用扫描仪自带的图像分析软件GenePix6.0对扫描结果进行定量分析,并保存分析结果。通过芯片扫描仪得到的扫描图谱为一矩阵图谱，探针分布如表4所示，当某一位点的野生型短探针和长探针同时出现信号时该位点为野生型，当该位点的突变型短探针和长探针同时出现信号时该位点为突变型，当四个探针同时出现信号时为杂合子。图像分析软件的定量分析结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>芯片扫描结果见图(2)6、分析确定基因型利用与芯片检测系统配套的结果分析软件进行结果分析与整理，由上述杂交图扫描结果可确定各位点的基因型如下:rsl057910-WW、rs3758581-W、rsl7878459-丽、rs4986893-WW、rs776746-醒、rsl065852-丽、rsll42345_WW、rs671-WM、rsl045642-WM、rs2231142-丽、rs2282143—丽、rs4149056-WW、rsl801252-醒、rsl801253-丽、rs5186_WM、rs9934438-W沐、rs7294-WW。与测序结果相对照，所有位点的检测结果均准确无误。实施例3本发明的基因芯片检测系统与常规SSOP基因芯片检测系统的比较。按实施例l所述的方法制备用于检测rsl057910(CYP2C9*3)、rs4986893(CYP2C19*3)和rsl065852(CYP2D6*10)的双探针基因芯片检测系统，探针排布阵列为<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>按发明者玮冀,周宏灏申请人:中南大学