专利名称：：从混合的胎儿-母体来源中特异性扩增胎儿dna序列的制作方法
技术领域：
：本发明提供从混合的胎儿-母体来源中选择性扩增胎儿DNA序列的方法。该方法利用差异性曱基化来允许从含有高比例非滋养层/胎儿DNA的DNA混合物中选择性扩增滋养层/胎儿特异的序列。本发明还提儉使用扩增的胎儿DNA序列进行非整倍性检测的方法。
背景技术：
：大量研究表明，新生儿中全染色体非整倍性的发生率为1至2%。Hsu,A.M.(编辑)GeneticDisordersandtheFetus,179-248页(1998)。这种染色体异常是出生前发病和死亡的重要原因及长期存活者严重发育迟緩的主要原因。考虑到常见三体性的母亲年龄依赖性和平均生育年龄的显著提高，显然筛选非整倍性的重要性将持续提高。非常需要用于在妊娠期间检测非整倍性的可靠、廉价且非侵入性的方法。用于非整倍性检测的现有选择不多。目前，通过绒毛膜绒毛取样("chorionicvillussampling,CVS")或羊膜穿刺进行的侵入性测试是所有35岁及以上妇女和其他已知非整倍性风险升高的妇女的一种选择。因此，大多数妇女因为她们不属于这些范畴而不予进行侵入性测试。因为大多数嬰儿为小于35岁的妇女所生，并且每250名35岁妇女中仅有约l名妇女通过羊膜腔穿刺发现具有三体性，因此母亲年龄作为筛选测试的功能很差。在过去的20年里，21三体("trisomy21，T21")母体血清筛选的效率已有了很大提高。使用两个妊娠时间点上的母体血清及超声的现有技术的筛选对T21的检测具有~95%的"灵敏度"和5%的假阳性率。参阅如WaldN.J.，等111:521-31.(2004)。然而，这类测试具有三个主要缺点。首先，它不提供诊断，而是提供唐氏综合征的概率。"阳性"结果定义为唐氏综合征的风险高于或等于35岁妇女。因此，具有"阳性"结果的大多数妇女仍然必须考虑到，实际发现唐氏综合征的几率仍然低于1%。其次，该测试仅限于21三体和18三体。第三个问题是仅有95%的灵敏度。筛选测试(如该测试)中95%的灵敏度从公共卫生观点出发是很有价值的，但是对于许多患者，5。/。遗漏T21的几率是不能接受的。显然，如果可用的话，那么阳性预测值和灵敏度高得多的非侵入性测试将对患者有用得多，并将立即取代现有的筛选方法。从约12年前开始，母体血中多种镨系胎儿细胞的证实引起了人们巨大的兴趣。人们开发了从母体循环中纯化此类细胞的技术，并展示了对许多疾病进行产前诊断的可行性。然而，这些方法还并不实际。这主要是因为胎儿细胞的贫乏以及纯化它们这一棘手的问题。Bianchi，D.W.，等，Br.J.Haematol.105:574-83(1999)。大量近期出版物已经证明，游离的胎儿DNA存在于从妊娠早期(thefirsttrimesterr)的前期开始并持续至分娩的基本上所有妊娠期的母体血浆中。Bischoff，F.Z"等，Hum.Reprod.Update11:59-67(2005)。大量研究已经证实，可以通过在来自母体血浆的DNA中扩增Y染色体特异性序列来确定胎儿性别，并且其它报道已显示，还可以确定胎儿Rh血型的基因型。母体血浆中胎儿DNA的绝对量不多，且取决于孕龄及回收技术。全部基于定量PCR的估计提出，根据孕龄和其它参数，每ml全血中可能有相当于50-200个基因组当量的胎儿DNA。Bischoff等2005HumReprodUpdate11:59-67。来自母体血浆的DNA的来源也不清楚。许多研究者推测它很可能来自滋养层，因为这是与母体循环接触最直接的组织。这种推测的直接证据来自单个出版物，其鉴定了Y染色体异常的胎盘镶嵌现象。FloriE，等,Casereport.Hum.Reprod.19:723-4(2004)。尽管早期成功地证明了胎儿DNA在母体血浆中的存在，但使用来自母体血浆的DNA还没有解决产前诊断的主要问题，如确定常见三体性的存在。这是因为母体血浆中胎儿DNA作为与母体DNA的混合物而存在并且母体成分通常丰度更高的事实。胎儿DNA与母体DNA的比例似乎在不同的样品和方法之间变化很大。最低约为10/o的DNA量，最高可以高得多。BenachiA,等,Clin.Chem.51:242-4(2005)。虽然PCR可用于扩增极少量的DNA,但是没有一般性方法来选择性扩增胎儿DNA。扩增胎儿和母亲共有序列的任何努力将仅能成功扩增母体序列。迄今为止，仅通过使用对母体组分中不存在的序列(如Y染色体)具有特异性的引物实现了对胎儿序列的选择性扩增。已经使用物理分离技术来提高血浆来源DNA中胎儿组分的比例。LiY，等Jama293:843-9(2005);LiY,等Prenat.Diagn.24:896-8(2004a);LiY，等，Clin.Chem.50:1002-11。尽管如此，这些技术不太可能获得纯度足以进行常规产前诊断的胎儿DNA。来自孕妇宫颈的样品已显示包含胎儿细胞，这代表了可用于非侵入性产前诊断的另一可能的胎儿DNA来源。关于该主题的文献集中在两个问题上1)从宫颈回收胎儿细胞的可靠性和改善它的方法和2)从大母体细胞背景中分离胎儿细胞的方法。尽管已经使用来自宫颈样品的胎儿细胞和DNA进行了多种产前诊断，但这两种问题仍然是该方法常规使用中的主要障碍。有报导的从母体宫颈样品中获得胎儿细胞的最高成功率是82%,这仅在使用盐水滴注法的半侵入性技术时实现。CioniR，等，Prenat.Diagn.25:198-202(2005)。形态学手段(TutschekB，等，Prenat.Diagn.15:951-60(1995);BussaniC,等，Mol.Diagn.8:259-63(2004))和免疫学手段(Katz-JaffeM.G.，等，Bjog112:595-600(2004))均已用于从母体细胞中分离胎儿细胞，并且两者均已显示可以提高胎儿细胞的比例。然而，这些方法获得的DNA很可能受母体DNA的高度污染。此外，未曾报道过大规模的或系统性的研究。显然，允许检测和分析处于与母体DNA的混合物中的滋养层DNA序列(因此检测和分析胎儿的DNA序列)的方法将极其有用。这样，来自母体血浆或来自宫颈的样品可以直接用于胎儿分析，而不需要对母体和胎儿的细胞或DNA进行广泛的物理分离。或者，用于富集胎儿DNA的物理方法可以与滋养层/胎儿特异性扩增组合，以增强两者的益处。因此，仍然需要提供对得自混合的胎儿/母体DNA来源的胎儿DNA进行选择性扩增的方法。本发明满足了这一需要。发明概述本发明提供从混合的胎儿和母体DNA样品中选择性扩增胎儿DNA的方法，所述方法包括以下步骤从混合的胎儿/母体DNA样品中分离DNA;用甲基化特异性酶消化所述DNA;将消化的DNA与接头连接；使消化的DNA进行接头介导的PCR扩增，以获得扩增的PCR产物；从扩增产物中除去接头和引物DNA;环化所扩增的PCR产物；使环化的PCR产物进行外切核酸酶消化，以将任何未环化的DNA降至单核普酸；以及使产物进行等温滚环扩增，以选择性扩增胎儿DNA，从而由胎儿DNA产生甲基化敏感性代表。可以使用任何甲基化特异性酶，并且优选HpyChlV-4、Clal、Acll和BstBI酶。在一些优选的实施方案中，接头介导的PCR扩增进行12个循环。此外，在一些优选的实施方案中，用Bal-31进行外切核酸酶消化。本发明还提供鉴定胎儿特异扩增子的方法，所述方法包括以下步骤使用上述选择性扩增胎儿DNA的方法从胎儿DNA和全血DNA中分别制备甲基化敏感性代表；标记胎儿DNA和全血DNA，以产生标记的胎儿DNA探针和标记的全血DNA探针；使标记的DNA探针与两个相同的寡核苷酸阵列杂交，其中所述核苷酸阵列对应于给定甲基化敏感性酶的预测限制性片段；将两个阵列相互比较，以定位仅与胎儿DNA探针杂交的寡核苷酸；以及将来自步骤d的杂交寡核苷酸鉴定为胎儿特异性扩增子。在另一些实施方案中，用两种不同的标记对胎儿DNA探针和全血DNA探针进行标记，这允许在一个阵列上进行标记探针的杂交。标记可以是荧光染料。在一些优选的实施方案中，用于选择性扩增的甲基化敏感性酶是HpyCh4陽IV。优选地，胎儿DNA在妊娠前期获得，并更优选地在妊娠的约56-84天获得。本发明还提供由上述方法产生的胎儿特异性扩增子的文库。本发明还提供包含胎儿特异性扩增子文库的阵列。本发明还提供确定胎儿和母体DNA的混合物中胎儿DNA预定基因座上的拷贝数与该预定基因座上正常拷贝数相比是减少还是增加的方法。所述方法包括使用上述胎儿DNA的选择性扩增对测试样品和对照样品中胎儿DNA的预定基因座进行选择性扩增。对照样品在胎儿DNA的该预定基因座上具有正常的拷贝数。接着，所述方法包括比较测试样品中扩增DNA的量和对照样品中扩增DNA的量；并将扩增DNA减少的量与减少的拷贝数相关联，或将扩增DNA增加的量与拷贝数的增加相关联。在另一个实施方案中，该比较包括将来自预定基因座的扩增DNA对在测试样品和对照样品中以相同拷贝数存在的对照基因座所扩增的DNA进4亍归一化。本发明还提供在测试样品中确定预定基因座上的拷贝数与正常拷贝数相比是减少还是增加的方法，所述方法包括以下步骤使用上述选择性扩增胎儿DNA的方法对测试样品中和对照样品中的胎儿DNA进行选择性扩增，其中所述对照样品在该预定基因座上具有正常的拷贝数；用标记对来自步驟a中测试样品的DNA和对照样品的DNA进行标记，以产生标记的测试DNA探针和标记的对照DNA探针；使标记的测试DNA探针和标记的对照DNA探针与上述胎儿特异性扩增子的阵列杂交；比较测试DNA探针和对照DNA探针间的杂交量以确定信号强度；并将信号强度与测试样品中预定基因座上拷贝数的增加或减少相关联。在另一个实施方案中，用两种不同的探针标记测试样品DNA和对照样品DNA，这允许在一个阵列上进行杂交。图1描述了几种酶消化的血液DNA和滋养层/胎儿DNA的乙锭染色琼脂糖凝胶电泳。"B"和"T"分别表示血液样品和滋养层/胎儿样品。水平白线表示约1500bp的分子量。图2提供接头介导扩增的代表性实例。上图显示的是从四种不同母体血清样品中纯化的DNA的接头介导PCR。显示了24个循环后的产物。下图显示从母体血清中纯化的DNA的接头介导PCR。显示了20个循环后的产物。泳道1和2在没有甲醛的情况下收集，泳道3和4收集到含有甲醛的管中。图3描述了显示Acll消化的滋养层/胎儿DNA及血液DNA的扩增代表的凝胶。泳道如下1)标记；2)滋养层/胎儿；和3)血液。泳道4和5与2和3相同，只是在接头连接步骤中没有使用连接酶。白色条带表示切下用于克隆的部分。图4显示使用特异性Acll扩增子的引物的PCR结果。使用特异性Acll引物的PCR在12个相同制备的滋养层/胎儿和血液DNA代表上进行。显示了4组引物的结果。鉴定了总共10组此类滋养层/胎儿"特异性"引物组。"T"和"B，，表示模板分别来自滋养层/胎儿和血液。图5显示使用滋养层/胎儿特异性引物组对经Bal-31处理的等温扩增滋养层/胎儿和血液DNA代表所获得的PCR产物。每一对("T"和"B")是一组引物对滋养层/胎儿和血液代表的结果。上图显示所有6份滋养层/胎儿样品在22个PCR循环后均有可见产物，血液样品则没有可见产物。下图显示35个循环后，引物1和2具有来自血液代表的可见产物。图6显示在滋养层/胎儿特异性扩增子中含有信息性SNP的PCR产物的序列。图A来自输入的血液DNA。图B来自输入的滋养层/胎儿DNA。图C来自两种输入DNA的20:1混合物。图D来自混合DNA样品的曱基化敏感性扩增代表。这表明，存在于滋养层/胎儿DNA中的杂合SNP被顺利扩增，尽管在起始混合物中仅以5%存在并因此检测不到。图7显示两种起始DNA的PCR产物以及扩增自20:1混合物的PCR产物。使用在滋养层/胎儿特异性Acll扩增子上扩增CA重复多态性的引物来证实在两种DNA的混合物中的选择性扩增。图A是具有基因型198/202的输入全血DNA。图B是具有基因型196/196的输入滋养层/胎儿DNA。图C是具有基因型198/202的20:1混合物。图D是20:1混合物的甲基化敏感性扩增，其显示尽管有95。/。的全血DNA污染，但还是获得了滋养层/胎儿基因型。图8显示来自Lucito等GenomeRes13:2291-305(2003)描述的微阵列的数据。每一点代表点在玻璃阵列上并进行比较杂交的10,000个寡聚物的强度的logw平均比值。代表具有内部HindIII位点的BglII片段的所有地址均在最左侧。具有内部HindIII位点的片段的平均比值通常远高于l:l(10°)。发明详述本发明提供从混合的胎儿-母体来源中特异性扩增胎儿DNA序列的方法。通常，所述方法包括以下步骤从混合的胎儿-母体来源中分离DNA;使分离的DNA进行接头介导的PCR;环化扩增的PCR产物；外切核酸酶消化；以及最终进行等温滚环扩增。DNA可以从混合的胎儿-母体DNA来源中获得。應乂厶-母沐"假^源侵入性方法如绒毛膜绒毛取样("CVS")和羊膜穿刺可以提供用于产前诊断的纯胎儿DNA。虽然这些方法是常规使用的，但是它们也伴随有风险。另一方面，存在获得胎儿DNA的几种非侵入性途径回收存在于母体血浆中的无细胞DNA以及从母体宫颈回收脱落的胎儿细胞。尽管如此，将胎儿DNA用于常规产前诊断的努力受限于胎儿DNA存在于与母体DNA的混合物中这一事实。本发明的方法使得能够使用胎儿-母体DNA混合物，因为它利用胎儿和母体DNA间DNA曱基化上的差异来提供从混合的胎儿/母体DNA样品中对胎儿特异性序列的扩增。通过利用这些甲基化差异，本发明提供从胎儿和母体DNA的混合物中选择性扩增胎儿序列的方法。该方法因此开启了在来自母体血浆或来自宫颈拭子的DNA中对诸如常见染色体异常的事件进行产前检测的可能性。如上文所讨论的，本发明依赖于胎儿和母体DNA间甲基化的差异。DNA甲基化是通过改变基因表达来影响细胞功能的后生遗传学事件，指曱基由DNA甲基转移酶(DNMT)催化共价添加到CpG二核普酸中胞嘧啶的5号碳上。DNA甲基化分析的方法可以粗略地分为两种类型整体的和基因特异性的甲基化分析。哺乳动物DNA的甲基化状态在胎儿发育过程中发生显著变化。认为在受孕时，母本和父本基因组均被广泛甲基化。在前几次细胞分裂过程中，这种甲基化被大量"抹去"，其后在植入时，发生从头甲基化，并且再次存在大量曱基化。BirdA，Genes.Dev.16:6-21(2002)。在所有被研究的成人组织中，高比例(高达85%)的CpG二核苷酸被甲基化。GruenbaumY，等，FEBSLett124:67-71(1981)。对哪些序列发生甲基化的了解目前十分粗浅，很大程度上基于1980年代进行的研究，所述研究依赖于简单的技术，如比较DNA的曱基化和非曱基化敏感性消化。BirdAP(1980)NucleicAcidsRes.8:1499-504(1980)。目前人们对甲基化及其在基因表达调控中的作用有巨大兴趣。基因组DNA甲基化方面的所有现有文献均基于来自胎儿或成人来源(如肝和全血)的样品。迄今为止，在胚外组织如滋养层/胎儿中对甲基化还未曾有过系统的研究。在对诸如Prader-Willi综合征和脆性X综合征的病症进行产前诊断的过程中，已经注意到与来自血、肝或皮肤的DNA相比，滋养层/胎儿DNA是相对低甲基化的。IidaT.，Hum.Reprod.9:1471-3(1994)。当利用甲基化敏感性限制性内切酶进行Southern印迹时该差异最明显。当用具有四碱基识别序列的曱基化敏感性限制性内切酶(例如HpaII)消化大多数哺乳动物DNA时，4艮惊人地发现多数DNA保持高分子量。片段的平均分子量高于15kb，然而HpaII的预计频率所预测的平均片段大小要小得多。通过观察此类消化(见图1)，人们可以猜测至少80%的HpaII位点没有切开。虽然在图中观察不到，但是如果用更高百分比的琼脂糖跑胶，很明显地有片段的双峰分布，一组很小而另一组4艮大。这些观察结果基本上再现了1983.CooperD.N.，等,NucleicAcidsRes.11:647-58(1983)中报道的所i胃"HpaII小片段，旦palllinyfragment"或称为"HTF岛"的发现。如果用Mspl(与HpaII具相同的识别序列，但不是甲基化敏感性的)消化相同的DNA,则片段的平均分子量与预计大小接近得多。然而，使用从妊娠早期滋养层/胎儿中制备DNA的相同实验得到十分不同的结果。HpaII消化的滋养层/胎儿DNA的平均分子量明显减小，尽管仍然不等于通过MspI消化获得的分子量。这明确表明，从滋养层/胎儿中制备的DNA为相对低曱基化(较少地被甲基化)，并导致了重要预测-低甲基化区域在整个基因组中比CpG或"HTF"岛的分布更广泛。精确测定滋养层/胎儿DNA相对于全血DNA低甲基化的程度是困难的，但是使用HpyChIV-4酶(与图1中相似)对滋养层/胎儿和全血DNA消化物进行的i度测定法(densitometry)表明，对于500-l，OOObp的片段窗，得到的弥散条带的密度对于滋养层/胎儿样品一直为2-3倍。这提示在该大小范围内，HpyCh4-IV消化的滋养层/胎儿DNA中所包含的片段是全血DNA的2到3倍。滋养层/胎儿和全血来源的DNA之间甲基化差异的孕龄依赖性尚未充分研究。在9至20周孕龄范围内的一系列10份样品中，在用HpaII和HpyCH4-IV进行的消化中未检测到差异。然而，Prader-Willi和脆性X基因座的甲基化敏感性DNA印迹分析表明，到妊娠中期的中段，相比于妊娠早期存在的甲基化，可能会有更多的滋养层/胎儿DNA曱基化。因此优选地，从妊娠期10-13周获得混合的DNA样品(通过LMP)。这样，本发明的方法提供利用上述胎儿DNA和母体DNA间甲基化的差异而从混合的胎儿和母体DNA样品中选择性扩增胎儿DNA的方法。如先前指出，通常所述方法包括以下步骤从混合的胎儿-母体来源中分离DNA;使分离的DNA进行接头介导的PCR;将扩增的PCR产物环化；外切核酸酶消化；以及最后进行等温滚环扩增。本发明的方法包括使分离的DNA进行接头介导的PCR。凝兴介,^户C及通常，接头介导的PCR从用限制性内切酶消化DNA和将双链接头与消化末端连接开始。然后用对应于接头的引物进行PCR，扩增高达约1.5kb的片段。见R.D.，等，NucleicAcidsRes.17:9027-37(1989)和Lisitsyn,N.A.，等，ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol.59:585-7(1994)。使用该技术，已经可能从单个细胞中扩增DNA，并随后通过使用扩增产物进行比较杂交来检测非整倍性。Klein,C.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:4494-9(1999)。在另一项研究中，通过4吏用扩增代表作为BAC微阵列的杂交探针而将其用于检测单基因组拷贝数变化。Guillaud誦Bataille，M.,等，NucleicAcidsRes.32:ell2(2004)。在该方法中，限制性内切酶的消化频率决定了所产生扩增产物的复杂度。通过选择切割不频繁的酶，可以将扩增代表的复杂度降低至起始基因组DNA的一部分，使得随后的杂交步骤更容易实施。这在希望在两种复杂基因组来源间进行比较杂交的情况下特别有用。一个重要的实例是称作"ROMA"(RepresentationalOligonucleotideMicroarrayAnalysis,代表性寡核苷酸微阵列分析)的技术，它已用于揭示人类中高度的基因组拷贝数变化。Lucito，R.，等，GenomeRes.13:2291-305(2003);Sebat，J"等，Science305:525-8(2004);Jobanputra,V"等，GenetMed7:111-8(2005)。实施例1显示对从孕妇血浆中分离的DNA成功使用接头介导的扩增。扩增前，使用CpG甲基化敏感性酶HpyCh4-IV来消化纯化的DNA。消化后，将接头退火并连接到消化的DNA上，最后使用接头对的上链(topstrand)才艮据已公开的方案进行PCR。见实施例1和Guillaud-Bataille，M"等,NucleicAcidsRes.32:ell2(2004)。值得注意的是，已经确定，母体血液收集方法中应该优选不涉及曱醛。实施例2显示对滋养层/胎儿DNA进行成功的接头介导的甲基化特异性扩增。使用CpG甲基化敏感性酶Acll消化滋养层/胎儿DNA及来自全血的DNA样品。与实施例l类似，酶消化后，将接头退火并连接到消化的DNA上，最后使用接头对的上链根据与实施例1中所述相同的PCR方案进行PCR。值得注意的是，滋养层/胎儿DNA始终比全血产生更多和表观不同的PCR产物。然而，已经确定，尽管事实是使用CpG甲基化敏感性酶，但仍然会扩增非滋养层/胎儿DNA(即来自全血的DNA)。因此，本发明人确定，仅有接头介导的PCR扩增对于特异性扩增滋养层/胎儿DNA是不够的。因此，在本发明的接头介导的PCR步骤中，获得DNA的混合样品并用CpG曱基化敏感性酶消化，以形成具有已消化末端的已消化DNA。甲基化敏感性酶为本领域已知，包括但不仅限于HpyChIV-4、Clal、Acll和BstBI。通过在连接接头之前使用CpG甲基化敏感性限制性内切酶切割DNA，仅由未甲基化位点限定的片段可被扩增。在来自两种不同来源DNA(—种的甲基化低于另一种)的混合物的情况下，用曱基化敏感性酶消化以及随后的接头连接和扩增允许对差异性甲基化位点所限定的片段进行选择性扩增。该想法已经与"代表性差异分析"结合，用于探测正常与癌组织间的曱基化差异。参阅Ushijima,T.，等，ProcNatl.Acad.Sci.USA94:2284-9(1997)和Kaneda，A.,等,Acad.Sci.983:131-41(2003)。可以通过此方法实现的差异性扩增程度(部分)取决于所存在的甲基化差异程度。例如，如果给定位点在一种DNA中100%甲基化而在另一种中0%甲基化，则预期发生高度差异性扩增。对许多基因组位点的曱基化程度目前知之甚少。测定曱基化状态的工具(即Southern印迹和亚硫酸氢盐测序)通常显示特定位点是完全曱基化或完全未甲基化的，提示给定位点的甲基化状态是受严格调节和维持的。某一位点上的两个等位基因在显示印记(imprinting)和剂量补偿的基因组区域中被精确地差异甲基化，这一事实进一步确证了这种想法。然而，已广泛研究的特定位点的数目有限。检测方法(Southern印迹和亚硫酸盐测序)也不能区分甲基化程度的微小差异。然而，使用本发明的方法，确定具有高特异性的滋养层/胎儿序列差异性扩增。如上文所指出，哺乳动物基因组的甲基化是高度非随机的。富含GC区和CpG或"HTF"岛相对低曱基化，而富含AT的序列相对高甲基化。例如，稀有的切割富含GC的酶NotI多于90%的位点位于低甲基化的GpG岛中，导致该酶的消化比最初预测的更为频繁。见Fazzari，M丄，GreallyJM，Nat.Rev.Genet.5:446-55.(2004)。由于本发明利用甲基化差异来差异性扩增滋养层/胎儿特异性序列，并且CpG島看来很有可能在滋养层/胎儿和其它DNA中都是低甲基化的，因此本方法着眼于非GC富含DNA中的CpG甲基化。为此，包含甲基化敏感性CpG而其他部分由AT组成的限制性内切酶是优选的。四种酶属于该范畴。一种是四碱基酶HpyChlV-4，在ACGT处进行切割。其余三种酶是六碱基酶分别具有^列ATCGTA、AACGTT和TTCGAA的Clal、Acll和BstBI。对随机选择的基因组1千万碱基的非正式分析表明，这些酶的切割位点几乎完全不存在于CpG岛中。将Notl位点的限制性酶切图与Acll、Clal和BstBI进行比较。分析显示，这些富含AT的位点不聚集在CpG乌，相反，它们基本上从来不在CpG岛中出现。令人惊奇的是，Acll、BstBI和ClaI的识别位点也很稀少。似乎人类基因组中仅包含~150,000个AclI位点，而不是基因组序列在A、C、T和G频率方面是平衡的这一推测下所预测的750,000个。这一与预期相比Acll实际位点数~80%的减少是由于CpG二核苷酸相对缺乏。因为接头介导的PCR仅能扩增达约1，500bp的片段，因此我们检索了400到1500bp间的所有预测Acll片段，发现人类基因组中的总数仅为~15,000个。如果假设全血DNA中高达90%的预测位点被甲基化封闭(基于CpG曱基化在富含AT序列中增加这一事实的保守假设)，那么在该大小范围内预计片段的真实数量可能是1,000-2,000个。总的来说，这~2,000个片段将代表全部基因组序列的低于0.1%。对滋养层/胎儿DNA的相同计算(假设仅有~80%的位点被甲基化)预测了约2,000-4,000个可扩增的Adl片段。这一计算得出了重要的预测，即相比于类似制备的全血代表，预计滋养层/胎儿DNA甲基化敏感性代表的全部扩增片段中约一半是"特异性的"或高度富集的。如上述用曱基化特异性酶消化从混合样品中获得的DNA后，然后将所述DNA连接到接头上。优选地，所述接头具有内建的限制性位点，所述位点其后将用于提供环化步骤所需的相容性粘末端。可以使用在消化后产生粘末端的任何限制性酶位点。例如，Mlul提供粘末端。连接接头后，使用与该接头内位点结合的引物对得到的DNA进行扩增。然后进行PCR扩增。循环数可以不同，但优选地，循环数将产生选定大小的消化片段代表。在一些优选的实施方案中，进行5到15个循环的扩增。在一些更优选的实施方案中，进行8-14个循环的扩增。在一些最优选的实施方案中，进行12个循环的扩增。除了接头介导的PCR扩增以外，本发明的方法还包括使扩增的PCR产物环化；外切核酸酶消化；以及最后的等温滚环扩增(如上所述)，因为本发明人确定，接头介导的PCR不足以特异性扩增胎儿DNA。实施例2显示扩增了一些非胎儿DNA序列。炎^"增辨PC及进行扩增循环后，然后用切下接头的酶消化扩增产物。例如，如果接头具有内建的Mlul位点，那么将对产物进行Mlul酶消化。消化以切割接头之后，去除低分子量DNA(接头和引物DNA)。可使用去除低分子量DNA的任何适当的方法，如琼脂糖凝胶纯化或柱纯化。在一些优选的实施方案中，使用柱纯化。然后稀释纯化的DNA，产生非常稀的溶液。然后用T4DNA连接酶过夜处理该DNA，以通过使由之前酶消化所产生的粘末端发生连接而进行环化。通过消化和在非常稀的溶液(例如0.5ml1X连接緩沖液)中进行连接，非常有利于使具有相容粘末端的分子发生分子内自身连接(环化)。已经解链并部分重退火12次(在PCR扩增过程中)的原始起始DNA的消化和环化效率很低。此外，缺少合适末端的非特异性扩增的产物也将不太可能形成共价闭环。鞋核凝雜郝将DNA沉淀(使用本领域公知的方法)并重悬在适当緩冲液(如水)中之后，通过用攻击单链和双链DNA末端的外切核酸酶(例如核酸酶Bal-31)进行充分消化来处理连接混合物。通过连接产生的环状分子对消化具有抵抗力，但是充分消化会将任何线性分子降至单核苷酸。使用该消化来清除起始基因组DNA及非特异性扩增产物。或者，除了单个外切核酸酶(如Bal-31)以外，还可以使用外切核酸酶的混合物。例如，一种酶攻击单链DNA(绿豆外切核酸酶)而另一种酶攻击双链DNA(1外切核酸酶)，并且其中两种酶均无内切核酸酶活性，也不在缺口处切割双链DNA。术语"充分消化"指所使用的酶量多至足以不成为限制，并且进行消化的时间长至足以不成为限制。例如，在一个实施方案中，在消化混合物中使用2单位的Bal-31核酸酶，并允许进行45分钟。该单位在功能上定义为10分钟内在40ng/ul溶液中消化线性DNA的400个碱基所需的酶量。爭温漠环^"增接着使用核酸酶处理的连接物作为等温滚环扩增的模板。等温滚环扩增为本领域已知，通常是使用耐外切核酸酶的随机引物和具有高持续合成能力的DNA聚合酶进行的扩增环状DNA的扩增。可以使用任何等温滚环扩增方法。根据制造商的说明书使用可从Amersham获得的公知试剂盒。使用本发明的方法，本发明人能够证实，混合DNA样品中滋养层/胎儿组分(因此胎儿DNA)的特异性扩增从胎儿DNA中产生了甲基化敏感性代表。见实施例4。本发明还提供鉴定胎儿特异性扩增子的方法。详细说明见实施例5。该方法包括使用上述选择性扩增胎儿DNA的方法从胎儿DNA和全血DNA中分别制备甲基化敏感性代表。胎儿特异性扩增子指使用本文所述方法将从滋养层/胎儿DNA而不是其它DNA中扩增的扩增子。滋养层/胎儿DNA是与成人DNA相比低曱基化的DNA。对甲基化敏感的限制性内切酶将切割低甲基化的胎儿基因座，但不切割曱基化的母体基因座。用第一荧光染料标记来自胎儿DNA的甲基化敏感性代表，并用不同于第一荧光染料的第二荧光染料标记全血DNA，以产生标记的胎儿DNA探针和标记的全血DNA探针。使标记的探针与对应于给定甲基化敏感性酶的预计限制性片段的寡核苷酸阵列杂交。或者，如果使用两个分开的相同阵列，则不需要用不同的荧光染料来标记探针。研究阵列以定位仅与胎儿DNA探针杂交的寡核苷酸。将这些寡核苷酸鉴定为胎儿特异性扩增子。在一些优选的实施方案中，用于胎儿特异性DNA扩增的甲基化敏感性酶是HpyCh4-IV。优选地，从妊娠前三个月中约第56-84天获得胎儿DNA,因为怀疑胎儿DA和母体DNA间的甲基化差异在妊娠早期更显著。本发明还提供通过上述方法产生的胎儿特异性扩增子。本发明还提供阵列，其包含使用本发明方法鉴定的胎儿特异性扩增子文库。本发明还提供用于确定胎儿和母体DNA混合物中胎儿DNA预定基因座上的拷贝数与预定基因座上的正常拷贝数相比是减少还是增加的方法。详细讨论见实施例6。该方法包括使用上述选择性扩增胎儿DNA的方法在测试样品中和对照样品中选择性扩增胎儿DNA的预定基因座。所述对照样品在胎儿DNA的预定基因座上具有正常的拷贝数。将测试样品中给定基因座上扩增DNA的相对量与对照样品中相同基因座上扩增DNA的相对量进行比较。扩增DNA量的减少与拷贝数的减少相关，DNA量的增加与拷贝数的增加相关。在一些优选的实施方案中，该比较包括将来自预定基因座的扩增DNA对在测试样品和对照样品中以相同拷贝数存在的对照基因座所扩增的DNA进行归一化。本发明还提供在测试样品中确定预定基因座的拷贝数与正常拷贝数相比是减少还是增加的另一方法。详细讨论见实施例7。该方法包括使用上述选择性胎儿DNA扩增方法在测试样品和对照样品中选择性扩增胎儿DNA。所述对照样品在预定基因座上具有正常的拷贝数。标记来自步骤a的测试样品及对照样品的DNA，以提供标记探针。进行标记以提供检测杂交的手段。例如，如果将使用一个阵列，则用第一荧光染料标记来自测试样品的DNA并用不同的第二荧光染料标记来自对照样品的DNA。或者，如果使用两个单独的相同阵列，一个用于测试DNA探针且一个用于测试样品DNA探针，就不需要两种不同的标记。标记DNA探针后，它们与如通过本发明方法描述并产生的胎儿特异性扩增子杂交。测定测试DNA探针与对照DNA探针间的杂交量，来确定信号强度。与对照DNA相比，来自测试DNA的强信号与拷贝数的增加相关。与对照DNA相比，来自测试DNA的弱信号与拷贝数的减少相关。实施例实施例1:接头(linker)-衔接子(adapter)PCR从血浆DNA中进行扩增使用接头介导的PCR来从孕妇血浆中扩增DNA。使用标准方案(Johnson,K丄.，等，Clin.Chem.50:516-21(2004))从10ml抗凝全血(母体血浆)样品中纯化DNA。将样品离心两次以除去细胞。使所得血浆穿过DNA结合膜。从膜上移出DNA并用HpyCh4-IV(在ACGT处切割)消化所得DNA。将接头退火并连接，根据已公开的方案(Guillaud-Bataille,M.,等，NucleicAcids.Res.32:ell2(2004))使用接头对的上链进行PCR。将接头稍加修饰，以使其与用HpyCh4-IV消化的DNA连接时产生Mhil位点。所述接头如下CTAGGAGCTGGCAGATCGTACATTGACGGCATGTAACTGCGC图2显示此类扩增的代表性实例，并显示PCR产物易于检测。为证明扩增是特异性的且是接头介导的，使用标准TA克隆方案克隆PCR产物。挑取十个随机克隆并测序，在10例中有9例的序列显示，接头衔接子的每个末端均与正确的HypCH4-N位点连接。该实验提供了接头连接物PCR可用于从血浆来源DNA中扩增的有力证据。图2下图的检验显示，由此方案产生的接头介导PCR产物根据在母体血采集过程中是否使用甲醛而截然不同的。仅显示了两个实例，但该结果在12个独立采集的样品中是一致的。在甲醛存在下采集血液时所见的梯状带很容易使人想到细胞凋亡梯状带，提示曱醛有利于细胞凋亡片段的扩增。可能将蛋白质固定至DNA会产生用限制性内切酶无法消化的DNA,或者梯状带可能只是代表PCR产物复杂度的显著降低。因此，母体血釆集优选不涉及甲醛。这种看法与最近的出版物相一致，其反驳了甲醛提高胎儿DNA比例的观点。Chinnapapagari,S.K.，等,Clin.Chem.51:652-5(2005)。实施例2:证实滋养层/胎儿DNA的甲基化特异性扩增为了显示滋养层/胎儿DNA与全血DNA之间的差异甲基化，通过使用稀有切割富含AT的酶得到高度降低的复杂度是有益的。因此，使用AclI制备滋养层/胎儿DNA和全血DNA样品中的扩增代表。滋养层/胎儿DNA样品来自选择性终止的妊娠前三个月的56至80天，从正常成年志愿者制备所有全血DNA。所有扩增均根据已公开方案进行。见Guillaud-Bataille，M.，等，NucleicAcids.Res.32:ell2(2004)。简言之，用推荐緩冲液中过量的Acll消化0.5ug基因组DNA。25ng该DNA用于连接至接头/衔接子对。连接后，将2.5ng连接的DNA用作PCR模板。14个循环后，将1/10体积的产物用作第二轮PCR模板，使用相同引物再进行10个循环。此时，将产物展示于微型胶上(见图3)。与差异曱基化的预测一致，来自滋养PCR产物。将泳动于~500至l，OOObp之间的条带从胶上切下，用Mlul消化来除去接头/衔接子并连接至Mlul消化的克隆载体上。将接头/衔接子设计成使得与Acll突出端的连接产生Mlul位点。将这些连接物转化至细菌中，以产生来自滋养层/胎儿起始DNA和全血起始DNA的扩增Acll片段的微型文库。在克隆时，滋养层/胎儿代表始终产生至少两倍的集落，使得与最优全血文库约3,000个重组体相比，最优滋养层/胎儿微型文库包含约8,000个重组体。从滋养层/胎儿文库挑取三十五个随机克隆并将其插入片段测序。用UCSC浏览器进行的分析显示，除四条序列外所有序列均对应于预计的长度少于1kb的Acll片段，说明消化、接头连接和扩增步骤均如预计发生。应当指出，该克隆方法强烈选择排除非预期扩增产物，因为Mlul位点仅在将接头连接至Acll突出端时产生。当尝试利用TA克隆方法克隆PCR产物时，克隆效率低下，且很大一部分克隆反映了非特异扩增产物。因此可以推断，由接头介导的扩增所产生的相当一部分DNA量是非特异性的。设计总计30组特异性PCR引物对，对扩增Acll片段的亚区段进行扩增。然后使用全血DNA和滋养层/胎儿DNA的扩增Acll代表作为模板进行PCR。对于这些实验，将上述"第二轮"代表稀释1至10倍并用作每组特异引物组的模板，并在一组标准条件下进行20个循环的扩增。通过从6个滋养层/胎儿和6个全血代表的组中进行扩增来进一步检测从滋养层/胎儿代表中扩增而不从全血代表中扩增的引物组(见图4)。其中，10组被证明为滋养层/胎儿"特异性"，其含义为所有6个滋养层/胎儿代表均产生明显可见的产物，而相同条件下6个全血代表均未产生产物。这对应于有10/30或33%的概率使得随机选择的扩增Acll限制性片段仅在起始DNA来自滋养层/胎儿时存在。这与对滋养层/胎儿DNA的整体低甲基化程度的估计(上文)是一致的。在其余20组引物中，10组从滋养层/胎儿和血液代表中同样地扩增，另外10组给出不一致的结果。当用于从某些Acll代表中扩增时扩增了预计的产物，而在其它一些情况下则没有。这些结果提示l)在相关Acll位点上有甲基化的极端变异；2)常见SNP改变了某些Acll位点；或者3)SNP的存在影响了PCR效率。事实上，鉴定了SNP改变AclI位点的几个实例以及SNP影响PCR效率的实例。这种类型的序列变异是预料之中的，且不改变一大部分随机挑选的Acll扩增子具有相对的滋养层/胎儿特异性的结论。更受关注的是观察到某些引物组从滋养层/胎儿代表中扩增到强条带，而从全血代表中扩增到弱得多的条带。见图4中从上方起第3图的弱条带。此外，当PCR循环数从20增加至30时，几乎所有引物组均从全血代表中扩增到可见条带(未显示)。因为本发明的目的是特异性扩增与其他DNA混合的滋养层/胎儿DNA，所以非滋养层/胎儿DNA的"渗漏"扩增会产生问题。在狭窄的线性范围内，人们可以预计，3-4个PCR循环对应于10倍的扩增，检测阈值上3-4个循环的差异对应于模板量上一倍对数倍数的差异。当滋养层/胎儿DNA代表混合物中1%的DNA时，为了检测滋养层/胎儿DNA,6-8个PCR循环的差异性扩增是必需的。在10组滋养层/胎儿"特异性"引物组中，仅1或2组达到此严格标准。考虑了从全血代表中微弱扩增的三种可能原因。首先，仍存在于扩增代表中的少量起始基因组DNA可提供足够的模板来获得微量产物。经计算，在2.5ng起始基因组DNA中仅几皮克存在于稀释的代表中，使得其不太可能是20个PCR循环后微弱扩增条带的来源。然而，这可假定解释30个循环之后的扩增。其次，许多CpG位点上曱基化可能是不完全的。高度但不完全甲基化的位点会产生代表，其中相应限制片段以低但可检测到的水平存在。显然，这种解释在极端情况下可能有效。此时许多位点可能为99%甲基化而其它位点为99.9%甲基化。全血扩增子中微弱扩增的第三个解释是上述代表形成过程中的非特异性扩增。变性、重退火和与含大量重复序列的复杂基因组DNA进行引物延伸的过程当然会产生大量非预期产物。为确定这三种可能中哪一种是全血DNA"渗漏"扩增的原因，设计了代表性扩增的替代方案。实施例3:核酸酶消化后环状分子的等温扩增为克服实施例2中讨论的渗漏扩增问题，本发明人试图开发一种方便的扩增方法，它像克隆一样将强烈地选择真正的限制性片段且去除非特异性扩增产物。为此，用AclI消化基因组DNA并如上文所述制备接头连接物。用接头引物扩增12个循环后，用Mlul(其可切下接头)消化产物，通过柱纯化去除低分子量(接头和引物)DNA，在1X连接緩冲液中稀释至0.5ml(以产生非常稀的溶液)并用T4DNA连接酶处理过夜。其中的原理如下。PCR的最初12个循环产生Acll片段选定大小的代表以及不想要的非特异性产物。通过消化和连接非常稀的溶液，非常有利于具有相容粘末端的分子进行分子内自身连接(环化)。已解链并部分重退火12次的最初起始DNA进行消化及环化的效率极低。缺少合适末端的非特异性扩增产物也不太可能形成共价闭合的环。沉淀后，用核酸酶Bal-31通过充分消化来处理连接混合物，Bal-31是攻击单链和双链DNA末端的外切核酸酶。通过连接形成的环状分子对消化有抗性，但充分消化将把线性分子降至单核苷酸。预计这会去除起始基因组DNA及非特异性扩增产物。然后将核酸酶处理的连接物作为模板，使用商品化试剂盒(Amersham)按制造商的说明进行等温滚环扩增。这导致约10，000倍的扩增，其不涉及解链和重退夂。Dean，F.B.，等,GenomeRes.11:1095-9(2001)。在该方法最后，将所得DNA稀释并作为模板，用上述滋养层/胎儿"特异性"引物对进行PCR。该分析(最初30组中)产生共5组引物组，使用所述引物组在22个循环时可从滋养层/胎儿代表中明显检测到PCR产物，而在多达35个循环时在全血代表中也不产生可见产物。成功及失败的实例均示于图5。PCR检测阈值上13个循环的差异对应于起始模板至少1000倍的差异，预计这些扩增子在滋养层/胎儿组分仅为1%的DNA混合物中也应该易于检测到。本发明人推断，常规的接头介导扩增中非特异性扩增是"渗漏"或背景的主要来源，核酸酶/等温扩增方案显著地改善了这一情况。此外，许多基因组位点上也很可能存在不完全曱基化，这降低了强曱基化特异性扩增子的总数。实施例4:扩增混合的滋养层/胎儿及全血样品为了测试是否有可能特异性扩增混合DNA样品中的滋养层/胎儿组分，鉴定了包含改变BanII位点的常见单核苷酸多态性("SNP")的滋养层/胎儿特异性Acll扩增子。将上文所用六份滋养层/胎儿测试DNA和六份全血测试DNA对该SNP进行基因分型，发现在该基因座具有独特基因型的全血/滋养层/胎儿对之后，制备基因组DNA的10:1和20:1混合物。这些混合物中DNA的绝对量为25ng,意味着在20:1混合物中滋养层/胎儿组分仅为~100Pg，因此少于10ml血浆样品中所存在的胎儿组分。如上述制备甲基化敏感性代表，并然后将稀释的代表用作模板进行PCR。通过限制酶切消化及直接测序来分析产物(图6)。在该测定的灵敏度范围内，没有全血组分扩增的迹象。为进一步证实选择性扩增DNA混合物中滋养层/胎儿组分的能力，本发明人使用简单序列重复("simplesequencerepeat,SSR")多态性。除了比SNP信息量更大以外(杂合性远高于50°/。)，通过用自动测序仪测量相对峰高或面积，SSR还提供容易地评估在相同DNA样品中等位基因扩增的相对程度的可能性。为寻找含有潜在多态SSR的Acll扩增子，用Mlul消化来自滋养层/胎儿微型文库(上文)的质粒DNA并将新接头连接至片段末端。使用由(CA)H)组成的引物以及对应接头"下"链的引物来进行PCR。预计该方法扩增Acll片段中含有CA重复的部分。克隆PCR产物并挑取随机集落进行测序。在15条这样的序列中，全部都对应于预计的小于1Kb长的Acll片段，五条含有长度足以包含潜在多态性的CA重复。合成CA重复侧翼的特异性引物并用于对扩增代表进行PCR，五对中有三对显示为滋养层/胎儿特异性的。十二份测试DNA中的十份在这些CA长度之一上显示具有杂合变异，选择具有不同基因型的一对DNA(滋养层/胎儿和全血)用于产生分别由10:1和20:1的全血DNA和滋养层/胎儿DNA组成的测试混合物。然后用混合基因组DNA制备甲基化敏感性代表，然后将这些代表的稀释物作为模板，用多态性的引物进行PCR。图7显示两种起始DNA中每种DNA的PCR产物以及从20:1混合物中扩增的PCR产物。显然，这种甲基化敏感性扩增子从滋养层/胎儿DNA中的扩增比从全血中的扩增至少高效20倍。这些实验结果证明，用本发明的方法，滋养层/胎儿DNA的偏好性扩增是可能的。实施例5:用于大规模鉴定滋养层/胎儿特异性扩增子的微阵列分析开发滋养层/胎儿特异性扩增子文库是通往下述非整倍性测试的第一步。定制寡核苷酸微阵列的比较杂交目前已经是常规且商品化的技术，广泛用于评估基因组拷贝数的差异。同一技术提供了用于大规模鉴定滋养层/胎儿特异性扩增子的理想方法。为实现此目的，将分别制备自滋养层/胎儿DNA和全血DNA的甲基化敏感性代表用不同的荧光染料进行标记，并与寡核苷酸阵列(其对应于给定甲基化敏感性酶的预计限制性片段)进行比较杂交。与用于拷贝数变化的微阵列杂交不同(其中杂交水平上的差异非常微小)，鉴定仅与滋养层/胎儿探针杂交的寡核苷酸(阵列地址)，其反映在来自血液的DNA中相应限制性位点的消化为0或接近于0。通过使用来自多种不同滋养层/胎儿样品的探针进行这样的微阵列分析，鉴定了始终显示高度差异扩增的那些扩增子，用于提供定位于靶染色体上的大量滋养层/胎儿特异扩增子的目录。限制性内切酶的选择在目的为证实滋养层/胎儿特异扩增子存在的上述研究中，有意使用了导致扩增代表的复杂度显著降低的稀有切割酶。为了将来产前诊断的目的，对靶染色体13、18、21、X和Y中的每条染色体获得几百个滋养层/胎儿特异扩增子，并且，由f血浆来源DNA的平均分子量低，因此着眼于短区段上。显然，诸如Acll的酶所产生的片段对于此目的而言太少，因此使用用于微阵列分析的切割更频繁的酶。酶HpyCh4-IV对产生微阵列实验所用代表而言是理想的。该酶是识别序列(其为ACGT)符合在除中心CpG之外的位置上具有A或T这一标准的唯一市售酶。在A、C、G和T比例均衡的基因组中，HpyCh4-IV位点应比Acll位点多16倍，相应地，这对于21号染色体将预计有2400个长度为100至1500bp的片段。实际上，预计21号染色体上大小为100-1500的HpyCh4-IV片段真实数目为17,152个，这反映出与富含AT序列相关的CpG二核普酸的分布极不均匀。如果假定滋养层/胎儿DNA上80%的位点被甲基化封闭，则可估计21号染色体上乾标大小范围内片段的真实数目为2-3000。如果15°/。为滋养层/胎儿特异性，则预计有300-450个此类扩增子。阵列构建目前的技术允许生产含380，000种不同寡聚物的阵列，足以在单次实验中评估整个基因组中所有HpyCh4-IV片段的一半以上。然而，对10份样品对进行这样的分析将需要最少20个这样的阵列，因此将非常昂贵。作为节约费用的替代方案，在同一"芯片"上合成这样的阵列形式，其中提供4个相同的阵列，每个由98，000种寡聚物组成。单个该类型的"芯片"允许4次杂交，足以进行2次颜色互换的一式二份杂交。98,000种寡聚物提供的空间足以一式二份地用每种寡聚物检索4条相关染色体(13、18、21和X)中每条上的12，000个片段。12,000足以代表位于21号染色体上的大部分100-1500bp片段，相应地，预计每条染色体产生几百个滋养层/胎儿特异性扩增子。由于所有Y区段均为胎儿特异性，故阵列中仅呈现1000个Y区段。预计产生~200个Y染色体扩增子，这应该足够了。寡核苷酸制备包含21号、18号、13号、X和Y染色体上长度为100至1,500bp的所有~17,000个预计HpyCh4-IV片段的序列的数据库。然后将这些文件用于探针设计和阵列合成。由于血浆DNA具有低分子量，因此阵列中将呈现最大的可能短片段数。因为小于400bp的片段中约50。/。将不具有用于寡核苷酸设计的合适序列，因此这将保留约2，500个呈现于阵列中。所有阵列还包含一系列阴性对照寡核苷酸。滋养层/胎儿样品如上文讨论的，由于以下两点考虑而使用了妊娠前三个月的滋养层/胎儿DNA:1)滋养层/胎儿DNA与其它DNA之间甲基化的差异在妊娠早期更为明显；和2)妊娠前三个月的诊断方法是理想的。使用同一逻辑，使用从来源于56-84天妊娠的滋养层/胎儿中扩增的代表进行微阵列杂交。可以从选择性终止妊娠中收集这些样品，并通过常规的蛋白酶-K消化和其后的苯酚/氯仿提取来制备DNA。非滋养层/胎儿样品合并10份随机选取的女性样品，而不是试图选择合适的个体全血DNA样品。通过合并血液来源的DNA,产生了具有平均甲基化镨的单个代表。推测污染宫颈所得样品的母体DNA来源于宫颈上皮，因此与来自皮肤成纤维细胞的DNA相似。还没有比较血液来源DNA和皮肤来源DNA中甲基化的系统研究，但没有理由相信它们在这方面存在差异。过去进行了将含有甲基化敏感消化物的Southern印迹与超过20种不同探针杂交的基因作图实验，没有发现血液DNA与成纤维细胞DNA间的差异。探针合成上述核酸酶/滚环扩增方案用于制备滋养层/胎儿DNA和非滋养层/胎儿DNA的甲基化敏感性代表。用过量的HpyCh4-IV消化0.5ug每种基因组DNA。将25ng消化产物与接头对连接，并将1/10的连接物用于进行12个循环的PCR。在使用Acll消化物的以上实例中，接头与片段末端的同型连接产生Mlul位点(ACGCGT)，使用在A后面切割产生CGT的HpyCh4-IV时获得了相同的结果。12个PCR循环后，将所得产物用Mlul消化并如上进行环化。连接后，用核酸酶Bal-31消化剩余的线性DNA，并在用SephadexG50柱进行緩沖液交换后使用市售试剂盒(AmershamBioscience)进行等温滚环扩增。此时，在微型胶上检测DNA，以确定是否存在合适产物。使用该方案的DNA产量一般为3到5ug，但由于仅有一部分环化PCR产物用于扩增，因此它可容易地扩大至更大的量。在经荧光术定量并在微型胶上电泳MluI消化产物来确定质量后，将DNA提供给阵列制造商，如NimbleGen，用于探针标记和阵列杂交。微阵列数据的解释处理原始数据是重要的第一步。评估每一阵列地址的信号强度(相对于对照寡聚物)。将证实为不可靠的点排除于分析之外。对于每一具有足够信号的阵列地址，确定两种信号(Cy3和Cy5)的强度比值。由于对数转换的比例比简单比例具有更好的统计学特性，因此所有比值均进行对数转换(以2为底)。通过从阵列的每一个体值中减去整个阵列log2中位数来对阵列数据进行归一化。由于每一寡聚物均以一式两份存在，因此将一式二份地址的归一化比值进行平均，并将这些均值与同一一式二份地址上相应的颜色互换平均比值进行平均。因此，每一区段的最终值是基于四次杂交及其相应的10g2平均值。用现有软件包可容易地实现该分析。对在滋养层/胎儿代表中存在但在全血代表中不存在或几乎不存在的扩增子进行定位与在典型基因组比较实验(其中寻找基因组连续的阵列地址上杂交比例的微小差异)中的定位十分不同。来自Lucito等,GenomeRes.13;2291-305(2003)的数据提供了数据将可能如何出现的例子。8。这些作者进行了与含10,000条对应于BglII片段的寡核苷酸玻片阵列的比较杂交。一个杂交探针由基因组DNA的"完整"BglII代表组成，另一个由相似的代表组成，只是DNA还用HindIII进行了消化，这在很大程度上去除了所有含内在HindIII位点的片段。这产生与本发明相似的情形，其中一种代表包含另一代表中基本不存在的要素。如图中所示，logw平均比值信号从O变化至远超过l，反映许多区段强度上>10倍的差异。本发明阵列的结果将与此相似，但是由于探针扩增方法比这些作者使用的方法产生更少的非特异扩增，因此可能会观察到，1og^平均比值大于1的地址的比例更高。认为具有10倍或更大平均比值的地址是"滋养层/胎儿特异性"的。显然，具有最高平均比值的地址是最理想的。对每一杂交的分析产生信号满足此标准的探针地址列表，IO次计划杂交的配对比较获得在样品中一致最后地址列表，提供了五条相关染色体上滋养层/胎儿特异性HpyCh4-IV扩增子的期望目录。实施例6:从母体血浆DNA和宫颈DNA中扩增胎儿特异的多态性扩增胎儿多态性也是非侵入性非整倍性检测的一种可能途径。已显示STR多态性的QF-PCR在传统产前诊断中对非整倍性的快速诊断是非常成功(Nicolini等,Hum.Reprod.Update10:541-48(2004))的，并且其可适应于使用曱基化敏感性代表。因此，鉴定了位于实施例5中所定义曱基化特异性扩增子上的有用多态性，并检测了宫颈DNA和血浆DNA样品中这些多态性的胎儿等位基因。发现有用的多态性28就遗传作图的目的而言，SNP已成为最有用和最丰富的多态性类型。尽管公众域数据库中有数百万SNP,且有大量用于SNP的测定方法，但它们在非整倍性检测中的用途存在比STR多态性更大的挑战。它们不仅多态性更低，而且使用它们进行非整倍性测试的方法(Pont-Kingdon，G.等，Clin.Chem49:1087-94(2003))依赖于等位基因的等同扩增，这在曱基化敏感性代表的情况下可能是不现实的。鉴于这一点，鉴定了位于甲基化特异性扩增子上的有用STR。为了证明对位于曱基化特异性扩增子上的STR进行定位的可行性，在21号染色体上检索含有简单序列潜在多态性的HpyCh4-IV片段。在~17,000个预计的片段中，近400个含有可能具有多态性的STR。见表l。表l:潜在的21号染色体多态性<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>上文实施例5中描述的阵列包含对应尽于可能多的这些STR的寡聚物，从而提高了在甲基化特异性扩增子中发现潜在多态性位点的机率。考虑到约15%的片段很可能为高度甲基化特异性，在21号染色体上鉴定了高达60个潜在多态性的滋养层/胎儿特异扩增子。因为它们通常产生更易解释的PCR产物，所以使用了三核苷酸和四核苷酸的重复。设计了靶定多态性侧翼的引物对。用荧光染料标记两种引物之一，用于在自动测序仪上进行简单的片段长度分析，并对IO份随机基因组DNA样品进行PCR。用此方法显示了具有合理杂合性的标记物，并进一步测试有前途的候选标记物。扩增混合DNA样品的测试将现有的滋养层/胎儿和全血DNA样品就上文鉴定的多态性进行基因分型，并制备具有不同基因型的混合样品对。数据表明，在滋养层/胎儿组分占总起始DNA5%的混合物中检测滋养层/胎儿基因型是可行的，所以我们先测试20:1的混合物，再用50:1和100:1的比例进行测试分析。测试胎儿特异性扩增将鉴定到的在上文测试中运行良好的多态性用于测试能否从母体样品中扩增胎儿等位基因。为此，从每种母体血浆样品和/或宫颈灌洗样品中获得母体和胎儿DNA样品。对于妊娠中的血浆样品，从CVS样品中获得胎儿DNA，对于灌洗样品，则从终止样品中获得。对于有母血样品但无直接的胎儿样品的情况，母体样品的可用性将允许鉴定胎儿特异性等位基因。使用荧光PCR将母本和胎儿(或父本)样品就这些多态性进行基因分型。在已获得的5-10个基因座中，很可能有一个或两个基因座将对于几乎所有妊娠都具有信息性。选择预计允许进行胎儿等位基因明确鉴定的样品。鉴定到合适的样品之后，如上所述制备混合胎儿/母体样品(宫颈的或血浆的)的甲基化敏感性代表。因为血浆DNA的大小选择似乎显著富集胎儿DNA(Li等Clin.Chem.50:1002-11(2004))，如下进行大小选择。经最初消化、接头连接和12个循环扩增后，将PCR产物上样到2%琼脂糖微型胶中。切下含有100至400片段的胶条，用于后续的Mlul消化、环化和等温扩增步骤。该方案具有与对DNA直接进行大小选择相同的优点。对于宫颈灌洗液，制备(根据以上方案获得的)得自灌洗样品的全细胞沉淀的样品，并用于甲基化敏感性扩增。将扩增产物用作模板来扩增信息性多态性，片段分析揭示是否可扩增胎儿特异性等位基因。检测非整倍性在开始可用时即获得来自具有高嫌疑21三体的妊娠的样品。如上述从这些样品中制备甲基化敏感性扩增的代表。使用如上文讨论用于大小选择的相同方法。就滋养层/胎儿特异性21号染色体标记物的模式确定了真实胎儿基因型后(使用来自CVS或终止期的DNA)，在扩增代表上进行同一组PCR。实施例7:甲基化特异性代表用于微阵列比较基因组杂交("comparativegenomehybridization,CGH")的用途总则寡核苷酸阵列的比较杂交能检测微小的基因组缺失和重复(Sebat等2004;Jobanputra等2005;Selzer等2005)。利用该技术检测在细胞遗传学上可见的缺失和全染色体非整倍性是相对简单的。从历史上看，该:技术成功的关键因素是这一事实，即扩增代表降低了探针的复杂度，使得事实上与靶标寡核苷酸同源的比例高得多。最近，探针标记技术的改进已使得在寡核普酸微阵列上直接使用标记的全基因组探针成为可能。若干研究小组已报道了该技术用于检测小的单个拷贝数变化的用途，证明高度复杂的探针通常是成功的(Brennan等2004;Selzer等2005;Hinds等2006)。因此，甲基化特异性代表与对应于滋养层/胎儿特异性扩增子的寡核苷酸阵列的比较杂交可用于检测胎儿的非整倍性。在该方案中，从来自上述孕妇血浆或宫颈样品的DNA样品中制备甲基化敏感性代表。接着将来自两个不同个体(一个是正常对照，另一个核型未知)的扩增代表用作实施例5中所定义滋养层/胎儿特异性寡核苷酸靶标组的比较杂交探针。如果两种妊娠均具有正常核型(并且是相同性别)，那么预计在该阵列中对全部5条染色体均显示相似的平衡杂交信号。如果两种妊娠中一种具有全染色体非整倍性(例如21三体)，那么与其它4条染色体相比，预计代表该染色体的寡聚物组显示出两种荧光染料信号的整体相对不平衡性。胎儿性别将由来自性染色体探针组的信号的平均比值来反映。阵列中任何指定地址上信号不平衡的程度不需要很大，因为总共考虑来自代表该染色体的所有~100个地址的数据。决定该方案成功的主要参数是杂交探针中滋养层/胎儿特异性扩增子得到代表的程度。显然，如果以纯的胎儿DNA开始，那么利用该技术进行非整倍性的检测将是轻而易举的。同样，如果以胎儿和母体DNA的等同混合物开始，则滋养层/胎儿序列的甲基化敏感性代表将远超过50%的探针量，预计非整倍性的检测将像以纯的胎儿DNA开始一样顺利进行。该方案成功的容易程度显然随滋养层/胎儿DNA的比例减少而降低。鉴于这一点，下面考虑并讨论了这样的情况，其中起始DNA的1%来自滋养层/胎儿，99%来自母体。对此99:1混合物进行的甲基化敏感性扩增将产生两个主要结果。首先，总体序列复杂度将降低~98%(见下文)；其次，将存在滋养层/胎儿特异性片段。就DNA的量而言，滋养层/胎儿来源的組分(特异性和非特异性)将仍然仅占全部的约1,5-2%。就滋养层/胎儿DNA低甲基化的程度而言，其扩增效率和比例提高了，但是这一效率是微小的，因为数据表明，滋养层/胎儿代表中不超过30%的片段是滋养层/胎儿特异性的。仅代表探针混合物中2。/。DNA总量的杂交探针能提供可靠的信号吗？这取决于探针混合物的总体复杂度。为了计算通过我们的曱基化敏感性方法所产生探针的近似复杂度，认为由~49MbDNA组成的21号染色体包含17,000个大小为100-1500bp的HpyCh4-IV片段。甲基化将阻断这些片段中80-卯％的扩增，使得扩增片段的总数为1,700-3,400。由于这些片段的平均大小为~500bp，因此总体扩增复杂度为约0.85-1.7xl06,或总起始序列的约1.5-3%.与基因组DNA相比，这对应于复杂度约97-98%的降低。预计从包含1%滋养层/胎儿DNA的DNA样品中产生的杂交探针中仅含有~2%的滋养层/胎儿組分，但是，因为总体复杂度降低了98%,所以滋养层/胎儿特异性探针的有效浓度与全基因组探针中任何给定区段的浓度相似。因此，预计来自DNA甲信号，所述DNA至少1。/。来自滋养层/胎儿DNA。显然，更高的滋养层/胎儿DNA起始比例将成比例地提供更强的信号。实验设计阵列实施例5讨论了来自5条相关染色体的滋养层/胎儿特异扩增子的寡核苷酸探针。如上文所述，估计此类扩增子的数量将为每条染色体约200或总计约IOOO个。可以使用任何阵列。例如，可以^使用将常规合成的寡聚物固定在载玻片上的阵列。已经描述了在载玻片上产生寡核苷酸阵列的许多方法。(Guo等NucleicAcidsRes22:5456-65(1994);Zammatteo等AnalBiochem280:143-50(2000);Kimura等NucleicAcidsRes32:e68(2004))。获得了对应于~1000个如实施例5测定的预计滋养层/胎儿特异性序列的寡核苷酸序列以及其中~500个常规合成的寡聚物(每条染色体~100个)。根据现有方案产生这些寡聚物的阵列。所有寡聚物均以一式两份点样，并且点样具有相似预计Tm的非同源寡聚物作为阴性对照。作为阳性杂交对照，还包括了与滋养层/胎儿和外周血来源探针(来自实施例5)同样持续杂交的每条染色体~10个扩增子。将在下述测试杂交中不能很好发挥功能的这些寡聚物从阵列中去除，并用可以更好发挥功能的其它寡聚物代替。用于阵列评估的杂交探针首先确定是否可以通过如上文所设想的比较杂交来获得可靠的滋养层/胎儿特异性杂交信号。首先用这些阵列进行的杂交尝试利用细胞遗传学上正常的滋养层/胎儿和全血DNA的"人工"混合物，而不是实际母体样品。首先，从3组单独的滋养层/胎儿/血液DNA对中制备3种这样的混合物(A、B和C),并且在所有3种都将使用l:l比例的两种DNA。在3种中的每一种中，全血DNA来自女性，而两种滋养层/胎儿样品来自男性，第三种来自女性。然后根据如上相同的方案制备甲基化特异性代表。线性化并确定平均大小和浓度后，探针标记将遵循现有方案。(Ushijima等ProcNatlAcadSciUSA94:2284-9(1997);Breiman等CancerRes64:4744-8(2004))。这些的关键是在Klenow延伸过程中使用直接标记的随机引物及标记的dNTP。全部3种混合物(A、B和C)将在单独的反应中用Cy》和Cy5均进行标记(共6种探针)，使得每组混合物可以与其自身及其它混合物进行比较杂交。从1:1混合物制备的探针应该导致非常强的杂交信号，并且当滋养层/胎儿DNA的比例降低时，信号强度将相应地降低。对来自3种滋养层/胎儿/全血混合物的6种可能对(AA、AB、AC、BB、BC和CC)进行比较杂交，产生了关于该技术的可靠性和重复性的重要数据。数据分析像实施例5中那样，通过测定相对于阳性和阴性杂交对照的信号强度以及复制一致性来评估原始阵列数据，排除不可靠的点。对于每一杂交，测定与每一阵列地址相关的平均信号比值。将比值进行1og2转化，并通过从阵列的每一个体值中减去整个阵列的中位数log比值来进行归一化。每一平均比值是基于四次杂交，因为以一式两份点样放置每一寡聚物，并且每一杂交均颜色互换地进行两次。对于所有这些比较，三条常染色体的归一化log比值集中在0左右，因为它们都是细胞遗传学上正常的。应用标准的方差分析技术(analysisofvariance,"ANOVA")来获得对利用细胞遗传学上正常的样品进行的杂交之间可见的变异程度。来自该分析的性染色体信号比值应该是明显的。检测了男性对男性、女性对男性和女性对女性的所有三种可能性。如在所有这些情况下，当XX与XY比较杂交时，应该有~2:1的X来源信号是一种颜色，并且很明显有另一种颜色的不同比例Y信号。在1:1比例的滋养层/胎儿DNA和全血DNA导致可靠杂交后，使用相同的DNA(但全血:滋养层/胎儿DNA的比例为10:1)进行同一组对照杂交。类似地，使用50:1混合物进行试验。该试验对测定胎儿DNA(其为必须通过该技术成功分析的样品)的初始比例而言是很重要的。如果全血DNA与滋养层/胎儿DNA的比例为50:1在这种情况下是可用的，那么应该有可能使用母体血浆和/或宫颈样品作为扩增代表的起始材料。非整倍性检测来自上面实验的数据允许使用甲基化特异性扩增来检测非整倍性。为此，制备了比例为10:1和50:1的正常全血DNA与21三体滋养层/胎儿DNA的"人工"混合物。这些混合物用于产生具有Cy3和Cy5的甲基化特异性杂交探针，并且这些混合物与它们自身及上述3种细胞遗传学上正常的混合物进行比较杂交。在21三体混合物与其自身的比较杂交中，21号染色体的平均比值与其它2条常染色体的平均比值相似，因为每一探针具有3个拷贝的21号染色体。当21三体混合物与正常混合物进行比较杂交时，21号染色体的平均比值显著不同于其它常染色体的平均比值，反映一种样品中有3个拷贝的21号染色体，而另一样品中有2个拷贝。为了使该分析定型，使用ANOVA比较所有3条常染色体的平均1og2比值。这提供了测试全部染色体的平均log比值都相同这一整体零假设(globalnullhypothesis)的能力，拒绝该零假设将暗示至少一条染色体具有不平衡性。通过在来自个体染色体与来自其它染色体的数据的10g2平均比值间进行配对比较，有可能确定哪条染色体提供不平衡信号。因为将检测3种额外的假设，因此应用Bonferroni校正。因此，将在0.05水平上检测该整体零假设，如果被拒绝，则将在0.015水平上检测染色体特异性配对假说。每条染色体具有约100个阵列地址，检测非整倍性的能力很强。理论上，期望检测对应平均比值为1.5(在1og2尺度上为0.58)的任何拷贝数增加。然而经验显示，由于数据中的噪音，3:2的拷贝数(如在三体性中)增加可对应于低至1.15的实测比值(在log2尺度上为0.2)。功效分析表明，对于给定的配对比较，如果推测log2平均信号比值的标准差为0.1到0.2(典型值)并推测有0.01的1类错误率，则将具有高于~99.99%的功效来检测0.2的拷贝数增加(1og2尺度上)。即使具有0.4的标准差(这将代表噪音很高、质量很低的杂交)，检测非整倍性的功效也为97%。测试实际的母本样品来自所有上述杂交的数据允许测定获得可靠杂交所必需的胎儿DNA比例并因此测定三体性，上述杂交比较已知正常及已知为三体性的DNA混合物。由于上文提到的所有原因，相信即使低比例的胎儿DNA(2-5%)也会成功。因此，如实施例6中，血浆和宫颈灌洗来源的DNA均用于进行分析，因为每一类型的样品具有自己的优势和缺点。如实施例6中一样从妊娠期(母体血液样品)及选择性终止病例中进行样品收集。同样，扩增代表的制备也是相同的。事实上，相同的扩增代表可以用于实施例6及本实施例中。使用样品对进行比较杂交，所述样品对通过常规细胞遗传分析或通过QF-PCR确定具有正常的胎儿核型。在实践中，在血浆DNA组及宫颈灌洗组中均使用四种这样的妊娠样品及两种非妊娠对照，共产生12份样品。配对比较对每组进行15次分析。实际杂交数为30，因为每一杂交均将染料互换进行。如上述对来自这些杂交的数据进行分析，这提供了几条重要的信息可靠地获得高于背景的信号的能力；信号强度的预计正常变异范围；以及对于细胞遗传学上正常的样品而言染色体间log平均比值的比较是否正确地集中在0附近。可以从母体样品的甲基化敏感性扩增代表中获得可靠的胎儿杂交信号，然后将其用于检测非整倍性。如上讨论，该尝试以21三体开始，因为这是最相关且最易得到的。从宫颈和血浆样品中制备探针，所述宫颈和血浆样品得自已证实具有21三体妊娠的患者。将它们彼此之间进行比较杂交并与从正常病例中制备的探针进行比较杂交。完全像在上述实验中那样进行统计学分析。因为获得了可靠的杂交，因此检测非整倍性的能力非常高。除了产前诊断的可能性以外，本发明的方法可用于进一步了解生物学。例如，实施例5中讨论的微阵列分析类型可用于检测滋养层/胎儿甲基化的孕龄依赖性。初步观察提示，随着，的进程曱基化具有广泛变化，但是不知道这种变化在胎盘基因表达或功能中可能具有怎样的作用。同样，对胎盘曱基化在疾病中的作用还没有研究。除了本申请中所设想的这一功利目的以外，开发综合评估滋养层/胎儿与来自其它来源的体细胞DNA之间甲基化差异的方法可能具有许多重要的生物学应用。例如，可以寻找疾病状态如先兆子痫、子宫内胎儿生长限制(intrauterinefetalgrowthrestriction),葡萄胎:fe^和其它疾病中滋养层/胎儿甲基化的总体变化。最失败、子宫内生长限制、先兆子痫和其它疾病中对胎盘甲基化ii行系统性评估。权利要求1.用于从混合的胎儿和母体DNA样品中选择性扩增胎儿DNA的方法，其包括a)从混合的胎儿/母体DNA样品中分离DNA；b)用甲基化特异性酶消化所述DNA；c)将消化的DNA与接头连接；d)使消化的DNA进行接头介导的PCR扩增，以获得扩增的PCR产物；e)从扩增产物中去除接头和引物DNA；f)使所扩增的PCR产物环化；g)使环化的PCR产物进行外切核酸酶消化，以将任何未环化的DNA降至单核苷酸；和h)使来自步骤g的产物进行等温滚环扩增，以选择性扩增胎儿DNA，从而产生来自胎儿DNA的甲基化敏感性代表。2.权利要求1的方法，其中所述甲基化特异性酶是HpyChlV-4、Clal、AclI或BstBI。3.权利要求l的方法，其中所述接头介导的PCR扩增进行12个循环。4.权利要求1的方法，其中外切核酸酶消化利用Bal-31来进行。5.用于鉴定胎儿特异性扩增子的方法，其包括a)使用权利要求1的方法从胎儿DNA和全血DNA中分别制备甲基化敏感性代表；b)标记胎儿DNA和全血DNA，以产生标记的胎儿DNA探针和标记的全血DNA探针；c)将标记的DNA探针与两个相同的寡核普酸阵列进行杂交，其中所述核苷酸阵列对应于给定甲基化敏感性酶的预计限制性片段；d)将两个阵列相互比较，以定位仅与胎儿DNA探针杂交的寡核苷酸；e)将来自步骤d的杂交寡核苷酸鉴定为胎儿特异性扩增子。6.权利要求5的方法，其中所述胎儿DNA探针和所述全血DNA探针用两种不同的标记进行标记，并且其中标记的探针与一个阵列杂交。7.权利要求5的方法，其中用于步骤a的甲基化敏感性酶是HpyCh4-IV。8.权利要求5的方法，其中所述胎儿DNA在妊娠早期获得。9.权利要求8的方法，其中所述胎儿DNA在妊娠的约56-84天获得。10.通过权利要求5的方法产生的胎儿特异性扩增子文库。11.包含权利要求10所述胎儿特异性扩增子文库的阵列。12.用于确定胎儿和母体DNA的混合物中胎儿DNA预定基因座上的拷贝数与该预定基因座上正常拷贝数相比是减少还是增加的方法，其包括a)使用权利要求l的方法在测试样品和对照样品中选择性扩增胎儿DNA的预定基因座，其中所述对照样品在胎儿DNA的该预定基因座上具有正常的拷贝数；b)将测试样品中扩增DNA的量与对照样品中扩增DNA的量进行比较；和c)将扩增DNA量的减少与拷贝数的减少相关联，或将扩增DNA量的增加与拷贝数的增加相关联。13.权利要求12的方法，其中所述比较包括将来自预定基因座的扩增DNA对在测试样品和对照样品中以相同拷贝数存在的对照基因座所扩增的DNA进行归一化。14.用于确定测试样品中预定基因座上的拷贝数与正常拷贝数相比是减少还是增加的方法，所述方法包括a)使用权利要求l的方法在测试样品和对照样品中选择性扩增胎儿DNA，其中所述对照样品在预定基因座上具有正常的拷贝数；b)用标记对来自步骤a的测试样品DNA和对照样品DNA进行标记，以产生标记的测试DNA探针和标记的对照DNA探针；c)将标记的测试DNA和标记的对照DNA探针与权利要求11的胎3儿特异性扩增子阵列进行杂交；d)比较测试DNA探针和对照DNA探针间的杂交量，以测定信号强度；e)将信号强度与测试样品中该预定基因座上拷贝数的增加或减少相关联。15.权利要求14的方法，其中用两种不同的探针对所述测试样品DNA和所述对照样品DNA进行标记，并且其中对一个阵列进行所述杂交。全文摘要本发明提供从混合的胎儿-母体来源中选择性扩增胎儿DNA序列的方法。该方法利用差异性甲基化来允许从包含高比例非滋养层/胎儿DNA的DNA混合物中选择性扩增滋养层/胎儿特异性序列。本发明还提供使用扩增的胎儿DNA序列进行非整倍性检测的方法。文档编号C12N15/87GK101421410SQ200780013508公开日2009年4月29日申请日期2007年3月6日优先权日2006年3月6日发明者史蒂芬·布朗申请人:纽约市哥伦比亚大学托管会