专利名称：用于治疗过敏的属于欧蓍草(Parietaria judaica)脂质转移家族的低变应原的嵌合蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗过^t，尤其是花粉过每丈，更尤其是由脂质 转移家族的变应原引起的过敏，更为具体的是在墙草属(尸"m^OT'")的花粉 中发现的变应原。
背景技术：
I型过敏在工业化国家中是重要的健康问题。这一类型的过敏是由于
对空气中载有的抗原形成了 IgE抗体而导致。这些IgE抗体与肥大细胞和 嗜碱性粒细胞相互作用，释放出生物介体例如组胺，并在约20°/。的人群中 导致过敏性鼻炎，结膜炎和支气管哞喘[(l) Miyamoto, T. (1992)。 Increased prevalence of pollen allergy in Japan. In Advances in Allergology and Clinical Immunology. P. Godard, J. Bousquet, and F.B. Michel, eds. (Cornforth, UK: The Parthenon Publishing Group), pp. 343-347]。
特异性免疫疗法(SIT)是一种对由特定抗原引发的过敏性反应的有 效治疗方法，它基本上是由通过定期给药来调节患者体内的免疫应答， 增加产生过敏的蛋白质(变应原提取物)的浓度组成。以高剂量注射的 变应原会诱导由抗原-递呈细胞合成大量的IL-i2，例如树枝状细胞，这种 细胞优先促进T细胞的发育，而这些T细胞是与TH1或TH0协同的处女 型細胞(iiTh)。 这使得从与TH2细胞相关的过敏应答类型的免疫应答向 Th1/Th0型的应答偏离，从而导致生成高水平的IFN-y [(2) Akdis, C.A. and Blaser, K. (2000)。 Mechanisms of allergen-specific immunotherapy. Allergy 55, 522-530]。 在产生免疫抑制因子细胞因子IL-10和TGF-p的调节T细 胞(TRl)的影响之下，通过诱导TH2记忆细胞的耐受(无反应性或克隆缺失)而使免疫偏离得以加强[(3) Akdis, C.A., Joss， A., Akdis, M., and Blaser, K. (2001) 。 Mechanism of IL-10 induced cell inactivation in allergic inflammation and normal response to allergens. Int. Arch Allergy Immunol.
180-182]。 Th2细胞的活化和增殖的减少伴随b细胞导致的il-4以 及IgE的减少。Th2细胞的活性和浸润进鼻和支气管粘液的减少引起 IL-5合成的减少，从而减少了嗜伊红粒细胞的浸润，这导致了炎性介体如 MBP和ECP蛋白的释放的更大的减少。优势表型抗原ThO的T细胞的新 的特异性克隆产生了 THl和Th2型细胞因子的混合物，其促进B细胞产 生大量的特异性IgG抗原抗体。另一方面，高水平的IL-10诱导了大量特 异性IgG4抗原抗体的合成。这两种类型的特异性抗体可用作封闭抗体来 提供IgE抗体与它们的受体在肥大细胞中的交叉，从而抑制组胺的脱粒和 释放[(4) Moverate, R. (2003)。 Immunological mechanisms of specific immunotherapy with pollen vaccines: implications for diagnostics and the development of improved vaccination strategies. Expert Rev. Vacc. 2, 85-97; (5) Wachholz, P.A., Soni, N.K., Till, S., and Durham, S.R. (2003). Inhibition of allergen-IgE binding to B cells by IgG antibodies after grass pollen immunotherapy. J. Allergy Clin. Immunol. "2; 915-922]。 它们还通过含抗 原的细胞来阻止IgE-介导的抗原的聚积，而这抑制了对抗原的免疫反应。
从天然源分离出的变态反应原提取物为蛋白质和其他分子的复杂混 合物。它们的组成，进而变应原性取决于使用的材料，并随环境条件， 花粉的成熟状态以及真菌类中螨类等的生长条件。 一些提取物中甚至可 含有浓度不足的主要变应原，且甚至可被一些对患者不过敏的不期望的 成分污染，或者两种情况。目前的免疫疗法完全使用全变态反应原提取 物，而这导致了许多问题，如
-由于疫苗与效应物分子的IgE的反应所致的严重的不良反应。
-免疫疗法后在疫苗中出现对其他变应原的新的致敏作用。
-难以标准化变态反应原提取物。
所有的这些意味着免疫疗法不是期望的安全有效的治疗方法。对过 敏的发病机理以及特异性免疫疗法的机理的更好的认识使得能够更进一步地解决上述提及的问题。对IgE-介导的抗原在特异性变态反应原应答
Th2中的影响的认识增加了人们对产生不结合到IgE上的变应原的尝试。 目前的特异性疗法的主要目标是对变态反应原进行改性，旨在使IgE表位 失活，从而减少甚至消除对IgE的结合以及随之引起的不良反应[(6) Valenta, R. and Linhart, B. (2005)。 Molecular design of allergy vaccines. Curr.Opin. Immunol. 77, 1-10]。这样，改性的变态反应原将通过吞喧/胞饮 作用-介导的抗原收集机制而被引向T细胞，从而防止了 IgE交叉和IgE-依 赖的抗原的递呈。这诱导了通过T细胞的Th0或Th1细胞因子的产生的 平衡，通过B细胞的IgE的产生减少而IgG的产生增加了；所有的这些将 导致在无过敏性反应的危险之下诱导出Th2型T细胞耐受性。在获得变 态反应原和变态反应原衍生物的重組方法中的进展使得研发新的用于治 疗过敏的疫苗的能力大大增加。由于可能对IgE表位的重要氨基酸进行突 变或缺失，以及对其进行分级分离和低聚作用，获得低变应原疫苗是可能 的。这些分子具有较低的结合至IgE的能力但保持了它们对T细胞的反 应性，可以较大剂量使用，能够用较少次数注射获得更快更安全的免疫疗 法。此外，重组的变应原可在发酵罐中使用微生物表达体系来大规模生 产，且其纯化比它们的天然等同物更为有效和廉价。低变应原的衍生物 在免疫疗法中的使用先前已用Bet v 1的三聚体片段[(7) Mederberger, V., Horak, F., Vrtala, S., Spitzauer, S., Krauth, M.T., Valent, P., Reisinger,丄， Pelzmann, M., Hayek, B., Kronqvist, M., GafVelin, G., Gr6nlund, H., Purohit, A., Suck, R., Fiebig, H., Cromwell, O., Pauli, G., van Hage-Hamsten, M., and Valenta, R. (2004) 。Vaccination with genetically engineered allergensprevents progression of allergic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S, A.而, 14677-14682]、蜂毒蛋白(Api m 1, 2, 3)的多变应原的杂合体[(8) Schmid-Grendelmeier, P., Karamloo, F., Miiller, U., Housley-Marcovic, Z., Soldatova, L., Zumkehr, J., Kemeny, D.M., Kiindig, T., Reimers, A., von Beust, B.R., Salagianni, M., Akdis, M., Kussebi, F., Spangfort, M.D., Blaser, K., and Akdis, C.A. (2005). Prevention of allergy by a recombinant multi-allergen vaccine with reduced IgE binding and preserved T cell epitopes. Eur. J. Immunol. 35, 3268-3276]和以消除其三级结构的Parj 2和Parj 1的突变融
合体进行了描述。
一些作者提到，变应原疫苗不应用低变应原制备，这是由于对IgE 的结合可助于专门的抗原递呈细胞的变应原的捕获和递呈，如表达具有高 亲和力和低亲和力的IgE的表面受体的树突状细胞和活化的B淋巴细胞。
的交叉也可导致T细胞对变应原应答的减少[(9) Allam, J.P., Novak, N., Fuchs, C., Asen, S., Berge, S., Appel, T., et al. (2003) Characterization of dendritic cells from human oral mucosa: a new Langerhans' cell type with high constitutive FcsRI expression. J. Allergy Clin. Immunol, "2,141-8. (10) von Bubnoff, D., Matz, H., Frahnert, C., Rao, M丄.，Hanau, D., de la Salle, H., Bieber, T. (2003) Fc汰I induces the triptophan degradation pathway involved in regulating T cell responses.丄Immunol. 769, 1810-1816]。许多研究者仍在 不引入缺失时制备这种类型的疫苗[(ll) Batard, T., Didierlaurent, A., Chabre, H., Mothes, N., Bussieres, L., Bohle, B., <2/. (2005) Characterization of wild-type recombinant Bet v la as a candidate vaccine against birch pollen allergy. Int. Arch. Allergy Immunol.风239-249. (12) Jutel, M,, Jaeger, L., Suck, R., Meyer, H., Fiebig, H., Cromwell, O. (2005) Allergen-specific immunotherapy with recombinant grass pollen allergens. J. Allergy Clin. Immunol. 608-13. (13) Niederberger, V., Horak, F" Vrtala, S., Spitzauer, S"Krauth, M.T., Valent, P., d a/. (2004) Vaccination with genetically engineered allergens prevents progression of allergic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 川7, 14677-82. (14) Cromwell, O., Fiebig, H., Suck, R., Kahlert, H., Nandy, A., Kettner, J., d a/. (2006) Strategies for recombinant allergen vaccines and fruitful results from first clinical studies. Immunol. Allergy Clin. N. Am. 2<5, 261-81]。
墙草属(尸^veton")是荨麻目荨麻科家族的双子叶杂草属，。墙草 属中的4艮多种广泛和大量的分布在地中海海岸[(15) Colombo, P., Duro, G., Costa, M.A., Izzo, V., Mirisola, M., Locorotondo, G., Cocchiara, R., and Geraci, D. (1998)。 An update on allergens. Parietaria pollen allergens. Allergy 53, 917-921]。最常见的种为欧蓍草(P. )w必,ca y>和药用墙草(尸. o^^^c/wo/^ J, ^f旦其4也的种i3. /w57Yaw/c<3、尸.附ow/7Yfl"/ca和i5. crehca可在于 一些地区有一些存在。然而，地中海区域并不是唯一可发现墙草属花粉 的地方，因为有这种花粉存在于英格兰南部，奥地利，中欧和东欧的温 带区域，澳大利亚和加利福尼亚的描述[(16) Colombo, P., Bonura, A., Costa, M., Izzo, V., Passantino, R., Licorotondo, G., Amoroso, S., and Gerasi, D. (2003)。 The allergens of P腦'eto由.Int. Arch. Allergy Immunol. 730, 173-179; (17) Carreira, J. and Polo, F. (1995). The allergens of ewrapaea and /^n'efan'a 5pp. and their relevance in the Mediterranean Area. Allergy Clin. Immunol. News 7, 79-84].墙草属的一个显著特征是持续长达数月的授粉 期，从而导致在对墙草属过敏的患者中出现几乎常年性的症状，这些症 状范围为从较轻的鼻结膜炎到严重的哮喘。应当注意的是，由于在墙草 属的不同种之间表现出显著的交叉反应性，正常的对墙草属的轻微的单 特异性致敏作用包括对该属中各种不同种的致敏作用。
已有对两种最常见的种欧蓍草(P.7w^,caJ和药用墙草(i5 p炉c,'"afoj
的变应原馏分纯化和表征的各种论文。这些馏分的分子量在10-14 kDa的 范围，并实际上涉及它们的提取物的全部变应原力。The allergens of Par/etona. Int. Arch. Allergy Immunol. 730, 173-179; (18) Ayuso, R., Carreira,J., Lombardero, M., Duffort, O., Peris, A., Basomba, A., and Polo, F. (1993). Isolation by mAb based affinity chromatography of two Par j isoallergens. Comparison of their physicochemical, immunochemical and allergenic properties. Mol. Immunol. 30, 1347-1354; (19) Polo, F., Ayuso, R., and Carreira, J. (1990). HPLC purification of the main allergen of ywt/a/ca pollen. Mol. Immunol. 27, 151-157; (20) Polo, F., Ayuso, R., and Carreira, J. (1991). Studies on the relationship between structure and IgE-binding ability of乂wtia^a allergen I. Mol. Immunol. 28, 169-175].重组DNA技术的发展使得能够对墙草属花粉变应原的分子表征 得以完成欧蓍草花粉的两种主要变应原Parj 1和Par j 2已^皮克隆和测 序[(21) Duro, G., Colombo, P., Costa, M.A., Izzo, V., Porcasi, R., DiFiore, R., Locorotondo, G., Mirisola, M.G., Cocchiara, R., and Geraci, D. (1996). cDNA cloning, sequence analysis and allergological characterization of Par j 2.0101, a new major allergen of theyw^te'o pollen. FEBS Lett. 399, 295-298; (22) Costa, M.A., Colombo, P., Izzo, V., Kennedy, H., Venturella, S., Cocchiara, R., Mistrello, G., Falagiani, P., and Geraci, D. (1994). cDNA cloning expression and primary structure of Par j. I, a major allergen of i^hetor/a 7'W6iteca pollen. FEBS Lett. 347, 182-186; (23) Amoresano, A., Pucci, P., Duro, G., Colombo, P., Costa, M.A,, Izzo, V., Lambda, D., and Geraci, D. (2003). Assignment of disulphide bridges in Par j 2.0101, a major allergen ofj'"(ia/ca pollen. Biol. Chem. 384, 1165-1172]。 两种变
应原均属于非特异性脂质转移蛋白(ns-LTP)家族，并在它们的末端区域具有信号肽，加工后产生分子量分别为14,726和11,344 Da的蛋白质并具 有约45%的相同残基。已描述了在两种抗原中可能的可能位于结构相关区 i或内的IgE-结合线性表位[(24) Asturias, J.A., G6mez-Bay6n, N., Eseverri， J丄.，and Martinez, A. (2003). Par j 1 and Par j 2, the major allergens from 尸arz'e^3/7'a _/M(ifif/ca pollen, have similar immunoglobulin E epitopes. Clinical and Experimental Allergy 518-524]。这些区域是为能获得最佳低变应原
分子来治疗对欧蓍草花粉过敏而被作用的靶。
ns-LTP因能够离体完成膜间交换和/或传递极性脂质而著称。[(25) van Ree, R. (2002). Clinical importance of non-specific lipid transfer proteins as food allergens. Biochem. Soc. Trans 30, 910-913]。在植物中已表征了两个主 要的家族，它们是分子量约为9 kDa的LTP1和分子量约为7 kDa的LTP2。 属于LTP家族的变应原已在除食物外的植物中被鉴定，在这些植物中对它 们已进行了广泛的研究。因此，来自巴西橡胶树(heveabrasiliensis)乳胶的 Hevb]2为9.3kDa的碱性蛋白质，其显示出与蔷薇科果实中的变应原LTP 约65%的序列同 一性[(26) Beezhold, D.H., Hickey, V.L., Kostyal, D.A.， and et al. (2003). Lipid transfer protein from /fevea 6ms77z'e薦^ (Hev b 12), a cross-reactive latex protein. Ann Allergy Asthma Immunol 439-445] 。 jt匕夕卜，一 些花粉变应原被描述为LTP，例如北艾蒿(爿We附"',a vw/gw"')的Art v 3 [(27) Diaz-Perales, A., Lombardero, M., Sanchez-Monge, R., and et al. (2000). Lipid-transfer proteins as potential plant panallergens: cross-reactivity among proteins of y4w，/s/" pollen, nut and fruits, with different
IgE-binding capacities. Clin Exp Allergy 1403-1410]以及油橄榄(6>/ea 的Ole e 7 [(28) Tejera, M.L., Villalba, M., Batanero, E., and Rodriguez, R. (1999). Identification, isolation, and characterization of Ole e 7, a new allergen of olive tree pollen. J. Allergy Clin. Immunol. 797-802; (29) Rodriguez, R., Villalba, M., Batanero, E., and et al. (2002)。 Allergenic diversity of the olive pollen. Allergy 6-16],其为9-10 kDa且与食物的变应原的LTP具有30-55%的序列同一性。欧蓍草的主要变应原Par j 1和Parj 2， 一方面相互之间具有约45%的序列同 一性的，另 一方面具有比LTP家族中 的正常值高的分子量，分别为14.7和11.3 kDa [(16) Colombo, P., Bonura, A., Costa, M., Izzo, V., Passantino, R., Licorotondo, G., Amoroso, S., and Gerasi, D. (2003). The allergens of P譜'eto"'", Int. Arch. Allergy Immunol. 173-179]。然而，尽管两变应原具有与LTP类似的结构，它们却在共有的 序列区域具有与食物LTP的中等水平的同 一性(在Par j 1和桃LTP之间为 28% )。
WO2005/085278公开了含欧蓍草的两种主要变态反应原的融合蛋白 的构建物，其中融合蛋白的三维结构通过取代每种抗原的一级序列中的一 些半胱氨酸残基(更具体的是涉及形成二硫键中的半胱氨酸)被破坏，从 而使变应原的序列维持在几乎相同的长度。根据后来的实验，这将得到 比天然变应原的变应原性低1000倍的蛋白质。
本发明的发明者们已发现，不仅通过破坏变态反应原的三维结构，而 且通过使一些IgE-结合位点(已知为B表位)发生缺失可惊人的大大减少 变应原性，最令人吃惊的是，这不会导致免疫原性的降低。
本发明首次公开了通过将含少量IgE-结合表位的欧蓍草的两种变应原 的片段(Parj 1和Parj 2)结合获得的不同的嵌合蛋白质，以及获得它们的 不同的方法和中间体。不仅本发明的嵌合蛋白质的三维结构被打断，而 且一些B表位被缺失。根据本发明的嵌合蛋白质可称为低变应原的嵌合 蛋白质，其变应原性降低了 99.99%,这是由于它们具有更低的结合IgE抗 体的能力，这一结论基于p离体的ELISA，使用对欧蓍草过敏的患者的 血清混合物进行ELISA抑制和免疫检测测试；z"在对欧蓍草过敏的患者体 内进行皮肤反应性的活体内测试；以及,")使用对欧蓍草过敏的患者的单 一血清进行离体EAST抑制测试。根据本发明的嵌合蛋白质在另一方面保 持了它们的免疫原的能力，这通过对13名对欧蓍草过萄t的患者的外周血单核细胞(CMSP)的淋巴细胞增殖测试得以证实。
变应原提取物为蛋白质和非蛋白质分子的复杂混合物。用于检测对 提取物中的组份特异的IgE水平的技术，其使用的增多使得能够证实过敏 患者通常对多种组份产生反应。仅对单一 变态反应原反应的过敏患者的 例子非常稀少。由于变应原提取物在免疫疗法中存在显著的问题， 一种 解决方法是尽可能地将多种治疗性能组合在单个分子中。
发明内容
本发明人成功地将两种变应原结合在一个分子中，这不仅从工业化 生产和治疗上受益，并且在不改变免疫原性之下还显示出明显降低的变 应原性。
出于这些原因，本发明涉及嵌合蛋白质(后面称作Q1,Q2，和Q3)， 其由变应原Parj 1和Parj2的片段组成，由于它们失去了一些IgE-结合B 表位，因而它们的过敏应答性被降低，但未失去免疫原的能力。这样， 所得的嵌合多肽就具有比两个单独的蛋白质的总和低的分子量。
本发明还涉及包含对前述嵌合多肽进行编码的DNA的核苷酸序列， 表达体系包含具有表达和控制所需的序列的所述序列，以及由所述表达 体系转化的受体细胞。
本发明还涉及该嵌合多肽的临床应用，用于治疗过敏的特异性免疫 疗法，以及含有该嵌合多肽的可能的组合物，及其不同的施用方法。
允许用于免疫治疗的本发明的嵌合蛋白质的低变应原的性能已经被
广泛证实。由发明者们进行的免疫学实验表明，嵌合体Q2在不识别对欧
蓍草过^t的患者血清中的1gE,这在图lO和ll中示出。如图12所示，Q2
具有的IgE结合能力低于两种天然蛋白质混合物10,000倍。
这一低变应原性数据限制在通过在30名患者的皮肤点刺测试的活体 实验进行。嵌合体Q1的变应原性比由两种分离的天然蛋白质获得的变应 原性低3.5倍(图13)。在另一方面，由Parjl和Par j 2片段形成的Q2, 其不含有任何描述的B表位，变应原性比两种分离的天然蛋白质获得的变应原性j氐的112倍。
嵌合体Q2的低变应原性(IgE-结合能力)通过测量该分子与30名对
欧蓍草过敏的患者的血清的反应性而得以确证。这种在变应原性上的降
低出乎意料地伴随着嵌合体Q2的免疫原能力的保持，这与单个天然蛋白 质的总和的免疫原能力没有区别(图16)。
免疫原性的保持将使得该嵌合体用作完全提取物的替代品，但其安全 性却高的多(较低的变应原性)。
菌抹的保藏
根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约，对应于本 发明的樣i生物的菌4朱保藏于巴伦西亚大学(University of Valencia) (Universidad de Valencia, Edificio de Investigaci6n, Campus de Burjasot, 46100 BURJASOT, Valencia)的西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，并具 有以下参考
大肠杆菌C&c/ ^7c/2/"co/,), CECT7141,,保藏于2006年3月7曰。
图1是Q1的构建图。
图2示出了 Q1的氨基酸和核苷酸序列。对应于载体pQE-32的亲和 性尾部的残基用下划线表示。通过EcoRI (EF)部分引入的残基用阴影表
示。半胱氨酸残基用双下划线表示。
图3示出了 Par j 1和Par j 2的IgE表位(方框)和T表位(下划线) 的对比，指出了位于粗方框内的Q2缺失的表位。对相同的残基()和 类似的残基(.)进行了标记。
图4是Q2的构建图。
图5示出了 Q2的氨基酸和核苷酸序列。对应于载体pQE-32的亲和 性尾部的残基用下划线表示。通过EcoRI (EF) Pstl (LQ)和EcorRV (Dl)
部分引入的残基用阴影表示。半胱氨酸残基用双下划线表示。
图6示出了 Par j 1和Par j 2的IgE表位(方框)和T表位(下划线) 的对比，表明了位于双线方框内的Q3缺失的表位。对相同的残基()和类似的残基(.)进行了标记。
图7是Q3的构建图。
图8示出了 Q3的氨基酸和核苷酸序列。对应于载体pQE-32的亲和 性尾部的残基用下划线表示。通过EcoRI (EF) Pstl (LQ)和EcorRV (Dl)， Bg111 (RS)，以及Kpnl (GT)部分引入的残基用阴影表示。半胱氨酸残基 用双下划线表示。
图9示出了在电泳后用考马斯蓝对聚酰胺凝:胶进行染色的结果。Ql (带1), Q2 (带2), Q3 (带3)。
图10示出了对纯化的蛋白质nParj l-nParj2, Q1,Q2，和Q3的圓二色
性分析结果。
图11示出了用对欧蓍草过敏的患者的血清混合物的TgE抗体进行的免 疫才全测，包括nPar j 1-nPar j 2 (泳道1), rPar j 1 (泳道2)， rPar j 2 (泳道3), Ql (泳道4), Q2 (泳道5), Q3 (泳道6)。
图12示出了使用15种对欧蓍草过敏的患者的血清(稀释1/10)进行 的lgE抗体对Ql，Q2，和Q3的结合。示出了三次实验的值和它们的偏差。
图13示出了 ELISA抑制测试结果，用固相中的欧蓍草提取物以及nPar j l-Parj2, Q1,Q2，和Q3作为抑制剂，用对欧蓍草过l文的患者的血清混合 物。每个值均对应于三次实验的平均值，标准偏差小于10%。
图14示出了用欧蓍草提取物，nParj l-Parj 2以及Ql (50 pg/ml),和 Q3 (250吗/ml)进行的皮肤测试结果。示出的数值是斑点的面积，单位为 mm」。
图15示出了用欧蓍草提取物，nParj l-Parj 2以及Ql (50 ^g/ml),和 Q3 (250 ng/ml)进行的特异性IgE的确定。
图16示出了用于研究在对欧蓍草过敏的患者中的T淋巴细胞增殖的 的最佳浓度的确定。刺激指数(正)。
图17示出了用欧蓍草提取物和0，5吗/ml三种嵌合蛋白质以及Par j 1 和Parj 2的天然的和重组的形式获得的T淋巴细胞的增殖。显示的数值是 刺激指数(％)的数值。无显著性差异(ns)。
具体实施方式
根据本发明的 一个方面，提供了 一种具有低变应原性的嵌合蛋白质
或肽，其通过缺失任何B表位或IgE-结合表位或通过合成出无^f壬何B表位 或IgE-结合表位得到而得到。缺失优选针对Par j 1和Par j 2的28 - 53处 的B表位进行。
这里使用的术语"低变应原性"及其类似变体为相对的术语，涉及与 野生型免疫原的相同能力相比，本发明的蛋白质或肽的活体内和离体刺激 过敏应答的能力的降低。
优选的嵌合蛋白质包含示于SEQ ID No.:2， 4或6中的氨基酸序列， 最优选的嵌合蛋白质包含示于SEQ ID No.:4中的氨基酸序列。
嵌合蛋白质可选地或可额外包含与示于SEQ ID No.:2, 4或6中的氨 基酸序列同源的序列。优选的同源的序列与示于SEQ ID No.:2， 4或6中 的氨基酸序列，最优选为与示于SEQ ID No.:4中的氨基酸序列具有至少 为70%，更优选为至少80%，更优选为至少90%,最优选为100%的同源 性。
另一种优选的实施方式包括与示于SEQ ID No.:2, 4或6中的氨基酸 序列中具有至少为70%,优选为至少80%,更优选为至少90%，最优选为 100%的同源性的氨基酸序列的嵌合蛋白质或肽。
嵌合蛋白质也可包含有助于其纯化的肽序列。这种肽是本技术领域 公知的，例如聚组氨酸尾。
构成嵌合蛋白质的片段可由合格培训的人员按照已知的方案通过聚 合酶链式反应(PCR)扩增合成。所述片段，在被合适的限制性酶消化后， 可通过连接至表达载体而进行整合。该表达载体(如商用载体pQE32) 可具有将嵌合蛋白质与辅助纯化的序列如位于末端氨基酸端的一 系列组 氨酸进行融合的能力。在构建嵌合蛋白质期间，由不同的限制性酶识别 的序列形成的接头将不同的DNA片段结合在一起，而在天然变态反应原 的原始序列中不存在的残基将出现在最终的嵌合分子中。这些不干涉正 确读取蛋白质的新的残基在图2, 5,和8中的序列中被标记，并在相关的 实施例中进行了适当的描述。类似地，嵌合体在氨基端的区域具有14个 原始序列未出现的残基，它们对应于富含组氨酸的区域，其允许通过与结 合至固体支持物的二价金属相互作用而可实现快速纯化。根据本发明的第二个方面，提供了对本发明的蛋白质或肽进行编码的 多核苷酸。
优选地，多核苷酸含有示于SEQ ID No.:l, 3或5中的核苷酸序列， 最优选地，多核苷酸含有示于SEQIDNo.:3中的核苷酸序列。
多核普酸可可选地或附加地包含与示于SEQ ID No.:l, 3或5中的多 核苷酸序列同源的序列。优选的同源的序列具有的与示于SEQ ID No.:l, 3 或5中的氨基酸序列至少为70%，更优选为至少80%，更优选为至少 90% ，最优选为95%的同源性。
另一种优选的实施方式包括与示于SEQ ID No.:l, 3或5中的核苷酸 序列具有至少为70%，优选为至少80%,更优选为至少90%,最优选为 100%的同源性的核苷酸序列的多核苦酸。
多核苷酸可进一步包含一对信号肽进行编码的序列。信号肽为一种
引发蛋白质跨内质网膜传输的氨基酸序列。适合的信号肽为本领域技术 人员所知。
本发明还包括由本发明的多核苷酸序列编码的肽。
根据本发明的其他方面，提供了一种表达系统，其包含本发明的多核 苷酸序列，以及被所述表达系统转化宿主细胞，其能够表达本发明的蛋白 质或肽。
本发明还包括制备本发明的肽或蛋白质的方法，所述方法包括以下步
骤
(i) 制能够在宿主细胞中表达对本发明的蛋白质或肽进行编 码的核普酸序列的可复制的表达系统；
(ii) 用所述表达系统转化宿主细胞；
(iii) 在允许表达所述蛋白质或肽的条件下培养所述转化的宿主 细月包；以及
(iv) 任选地，回收所述的蛋白质或肽。
本发明还包括能够产生本发明的蛋白质或肽的转基因动物，例如在它 们的奶中或蛋中产生。
根据本发明的另一个方面，提供了本发明的蛋白质或肽在治疗免疫疾 病，特别是超敏性疾病如过敏中的应用。根据本发明的再一个方面，提供了本发明的蛋白质或肽在制备治疗免 疫疾病，特别是超敏性疾病如过敏的药物中的应用。优选的药物为疫苗。
优选地，超敏性疾病为对墙草属花粉的过敏，更优选的是对欧蓍草花 粉的过敏。
这里使用的术语治疗以及其变体如"治疗，，或"治疗的"是指可使人 类或非人类动物受益的疗法。治疗可以是针对现存症状的，或可以是预 防疾病的(预防性治疗)。治疗可包括治愈，缓和或预防疾病的效果。优 选地，治疗为预防治疗。
根据本发明的又一个方面，提供了一种药物组合物，其包含有效量的 本发明的蛋白质或肽以及药学上可接受的赋形剂。优选的药物组合物为 疫苗组合物。
根据本发明的又一方面，提供了一种治疗免疫疾病，特别是超敏性疾 病如过敏的方法，所述方法包括向有需要的研究对象施用有效量的本发明 的蛋白质或肽。
根据本发明的另 一 个方面，提供了本发明的蛋白质或肽在治疗免疫疾 病，特别是超敏性疾病如过敏中的应用。
对个体患者的合适的施用和剂量形式的选择对本领域技术人员而言 是显而易见的。
本发明覆盖了本发明的嵌合体，优选为嵌合体Q2，或尤其衍生的合成 的肽在哺乳动物中进行脱敏治疗中的应用。脱敏的方法涉及通过肠胃外 途径(皮下的，静脉内的，或肌肉的)，或口腔，鼻或直肠途径重复施用 所述的变态反应原。这些(多)肽可单独施用或与其他稀释剂组合，所 依据的是当前的法规和盖伦制剂使用规程。
在发明中描述的嵌合体蛋白Q2和Q3是低变应原的因为它们对欧蓍 草过敏的患者的血清的反应性比全提取物或组合的天然蛋白质低，如图 10， 11, 12和14所示，且这种低变应原性在活体内的皮肤测试中也有发 现(图13 )。
嵌合分子Ql和Q2也具有与组合的天然蛋白质类似的免疫原能力(图16 )。
这两种特性(低变应原性和免疫原性)使得嵌合体Q2成为对欧蓍 草花粉过敏进行预防和治愈的优异的候选对象，这些过^:表现为如鼻炎， 结膜炎，嗜喘，荨麻渗，血管性水肿，湿渗，皮炎，或者甚至为过敏性休克。
对本发明的嵌合蛋白质的免疫学特性的描述将在后面给出。图10示 出的免疫检测，表明在患过敏症的患者中，嵌合体Q2和Q3 (泳道5和泳 道6)具有比两种天然蛋白质(泳道1 ),分离的重组蛋白质(泳道2和泳道 3 )或显示为两种完全且含有所有B表位的蛋白质的重组融合嵌合体(带4 ) 大大降低的IgE-接合能力。应当指明的是，包括在残基29和52之间的B 表位(嵌合体Q2)缺失贡献变应原性的降低。当对15种不同血清与嵌合 蛋白质的反应性进行调查时获得了类似的结果(图11 )。 嵌合蛋白质Q2 和Q3具有比Q1中观察到的在两种完整变态反应原(Parj l-Parj2)的结 合性低得多的反应性。该变应原性的降低通过ELISA抑制采用来自对欧蓍 草过敏患者的血清混合物来进行定量(图12 )。需要比两种天然蛋白质混 合物多10,000倍的蛋白质Q2来达到60%提取物的抑制。因此，可以推 断，其比天然蛋白质的变应原性低10,000倍，且比嵌合蛋白质Q1的变应 原性低约20倍。
对嵌合体的低变应原性的更为直接的测量可通过直接对30名对欧 蓍草花粉过敏的患者的皮肤反应性测量来获得。图13中给出的数据表明， 嵌合体Q2在皮肤反应性上有显著降低。对各分布的描述进行的比较表明， 嵌合体Q2具有的平均斑点大小比两种天然蛋白质中观察到的小112倍，
这意味着致敏性活性降低了超过99%。
IgE与嵌合蛋白质Q2的低结合能力也通过进一步的30名对欧蓍草花 粉过^i:患者的单血清的EAST测量得以证实(图14 )。
在所有的患者中， 与天然蛋白质的混合物相比，嵌合体Q2中的IgE-结合均大大降低。
这种在IgE-结合能力上的大大降低以及因此由于B表位缺失而诱发不 良反应的能力却伴随着免疫原能力的维持。蛋白质Q2表现出的淋巴增殖指数与天然提取物以及两种纯天然蛋白质组合的混合物引起的淋巴增殖
指数类似，这在图16中示出。所有的这些都显示出用片段Parj 1和Parj2 构建的嵌合蛋白质Q2含有更少的IgE表位，但仍保持了足够以激发保护 性免疫应答的T表位。
将对本发明有更好的理解。这些实施例仅为示例性的，并不对本发明构 成限制。
实施例1: 01.02,和03融合体的构建
嵌合蛋白质是通过聚合酶的链式扩增反应(PCR)，使用含有对Par j 1.0103和Par j 2.0101编码的序列的质粒作为基质以及在每个例子中的具体 引发剂构建的，其中Par j 1.0103和Par j 2.0101描述于GonzMez-Rioja等 人的"Expression and purification of the recombinant allergens Par j 1 and Par j 2" XXIII Congreso EAACI, Abstracts Book (2004), 181-182中。引发剂各种 不同限制性内切核酸酶(下划线)的切断位点的杂交区，以及一些锚定核 苷酸組成。PCR-引起的扩增反应在50 pi的反应体积内具有以下组分扩 增緩冲液xlO, 5 pi; 200 ^M的dNTPs;100皮摩尔的各种引发寡核苷酸 2.5单位的聚合酶Taq (Pfx DNA聚合酶，Invitrogen); 1 ng DNA基质和使体 积达到50 pl的无菌蒸馏水.扩增反应在RoboCycler热循环仪(Stratagene) 中进行，反应进行具体条件将在每个情况中在下面描述。将反应产物在 琼脂糖凝胶(2%)中进行电泳，用Geneclean (Biol01)按厂商描述的方法从 凝胶中分离出目的带。分离出的片段用合适的限制性酶进行消化，并连 接到用相同的酶消化过的pBluescript载体上。连接混合物;故用于对大肠 杆菌DH5oc的感受态细胞(来自Invitrogen, Paisley, UK)进行转化。使所得菌落进行生长以分离出它们的质粒DNA,其用适合的酶来消化以释放出 目的片段。选择阳性克隆对之进行测序。插入到pBluescript中的DNA 的测序是通过使用荧光二脱氧核苷酸的改进Sanger's法[(30) Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of五sc/^hc/7/a co// with plasmids.丄Mol. Biol. /6<5, 557-580],在热循环仪中用PRISM Ready Reaction DiDeoxy Termination Cycle Sequencing Kit. (Perkin Elmer)4安厂商i兌明进行的。 A)嵌合蛋白质Ql
在此例中，两种蛋白质(Parj 1和Parj2)的完全序列被融合，以获 得具有去稳定的三级结构但保持了其完整的连续IgE表位的蛋白质。为 了获得称为Ql的构建物，使用克隆进载体KS-Bluescript中的Par j 1和 Par j 2的cDNA作为基质。为了融合两个序列，需要具有接头，在五coRI 耙的情况，为在Par j 1序列的C-末端和在Par j 2序列的N-末端，来完成 片段的随后连接。所述靶被添加到相应的合成寡核苷酸(F1R1和 F1F2)，并整合到PCR过程中扩增的片段中。
使用的合成寡核苷酸
片段1: F1F1, CG GGATCC TGCAAGAAACCTGCGG CSamHI)和 F1R1, CG GAATTC GGCTTTTTCCGGTGCGG (EcoRI)。 条件94。C, 4 min (1次循环)；94。C, 30 s — 53°C, 30 s — 72°C, 90 s (5次循环)；94°C, 30 s — 60oC, 30 s - 72。C, 90 s (35次循环)；72°C, 10 min (1次循环)。
片段2: F1F2, CG GAATTC GAGGAGGCTTGCGGGA (五o RI)和 F1R2, CG AAGCTT CTAATAGTAACCTCTGA (//z力dl11)。 条件94°C, 4 min (1次循环)；94°C, 30 s — 51°C, 30 s — 72。C, 90 s (5次循环)；94°C, 30 s —59°C, 30 s — 72°C, 90 s (35次循环)；72°C, 10 min (1次循环)。
产生了分别对应于Par j 1和Par j 2的两种PCR产物。对它们中的 第一种(Par j 1)，合成的寡核苷酸F1F1和F1R1分别用于N和C末端， 获得了大约420个碱基对(pb)的大小。经扩增的片段克隆在 pKS-Bluescript载体中，且证实了它的序列。对与Par j 2相对应的第二种 片段，采用相同的程序，分别使用寡核香酸F1F2和F1R3作为N和C末端。这种情况下，获得了大约为300 pb的片段，将其克隆在
pKS-Bluescript载体中，且证实了它的序列。通过EcoRI耙经连接将该 第二个片段接合到第一个片段上，Parjl在N-末端，Parj2在C-末端，所 得片段随后亚克隆在商用表达载体pQE-32 (Qiagen)中，该pQE-32在N-末端含有额外的相当于亲和尾的13个氨基酸序列(图2)。 所述序列编 码具有256个氨基酸且表观分子量为28070 Da的多肽。
A)嵌合蛋白质Q2
当获得该嵌合体时，两种蛋白质的片段都被结合但不包括任何描述 的连续的IgE表位[(18) Asturias, J.A, G6mez-Bay6n, N., Eseverri, J丄.，and Martinez, A. (2003). Par j 1 and Par j 2, the major allergens from P腦'eton'a _/w<ia/ca pollen, have similar immunoglobulin E epitopes. Clinical and Experimental Allergy 33, 518-524].设计出了包括以下片段的一些合成寡核 苷酸Par j 1 (残基1 - 28和53 - 139的片段)和Par j 2 (残基1 - 28和 53 - 103的片段)(图3和图4)。
这样，就消除了含IgE表位的序列部分。
四种片段(每种变态反应原各两种)被扩增用于该构建物，且克隆在 pKS Bluescript载体中的Par j 1和Par j 2的cDNA被用作基质。新的蛋白 质的构建机制是使用限制性酶(在此种情况为iV/，五coi /和五coWK)来进 行不同扩增片段的连续接合。
使用的合成寡核苷酸
片段1: F1F1, CG GGATCC TGCAAGAAACCTGCGG (Bawffl)和 F2R1, CG CTGCAG CCCCTTTGACGGCTCTT 0^1)。 条件min (1次 循环)；94°C, 30 s — 54°C, 30 s - 72°C, 90 s (35次循环)；72°C, 10 min (1次 循环)。
片段2: F2F2, CG CTGCAG ATCCAGACCGCCATGAA 和 F2R2, CG GAATTC GGCTTTTTCCGGTGCGGG —RI)。
片,爻3: F2F3, CG GAATTC GAGGAGGCTTGCGGGAA (五coRJ)和 F2R3, CG GATATC CTCCTTCGACGGCTCCTT (五coRV)。
片段4: F2F4， CG GATATC ATAGTGCGCGCCACGAA (TcoRV、和 F1R2, CG AAGCTT CTAATAGTAACCTCTGA (//,"dm)。
三种片段的条件是94。C,4min(1次循环)；94。C, 30 s - 54°C, 30 s - 72°C, 90 s (5次循 环)；94°C, 30 s — 62。C, 30 s — 72°C, 90 s (35次循环)；72°C, 10 min (1次循 环)。
这些中的的第一个，其对应于Par j 1 (片段l)，合成寡核苷酸FIFI 和F2R1被分别用作N和C末端，获得了大约为90个威基对大小的片段 并克隆在pKS-Bluescript载体中。对与Par j 1相对应的第二个片段，釆 用相同的步骤分别使用寡核苦酸F2F2和F2F2作为N和C末端。在这种 情况下，获得了大约为260 pb的片段并克隆在pKS-Bluescript载体中。该 最后一个片段由Pstl携带的靶的接头通过连接而结合到第一个片段上，且 它的序列得到了证实。
就由Parj2(片段3和4)扩增出的两种片段而言，采用片段1和2中描述 的程序。分别用于N和C末端的寡核苷酸F2F3/F2R3和F2F4/F1R4被用于 它们的扩增，片段3和4的PCR产物的大小约为90和150 pb。片段4由 五coRV携带的靶的接头通过连接而结合到片段3上，且它的序列得到了验 证。
在最后一步中，产生的两个新片段(各自用于一种变态反应原)由 五coRI携带的靶的接头通过连接而结合到一起，Parj l在N-末端而Parj 2在 C-末端。所述片段随后亚克隆在商业表达载体pQE-32中，该pQE-32在N-末端含有对应于亲和尾的额外13个氨基酸的序列(图5)。 所述序列对具 有212个氨基酸且表观分子量为23336 Da的多肽进行编码。
B)嵌合蛋白质Q3
最后的这个构建物除了在这种情况以及试图消除任何可能存在的IgE 表位之外，基本上与Q2相同，存在于序列Par j 1 (残基71-80 )和Par j 1 (残 基72-81 )(图6和图7 )中的另外的额外的8个氨基酸序列被消除。
使用的合成寡核苦酸
片段1: F1F1, CG GGATCC TGCAAGAAACCTGCGG (8amHI)和 F3R1, CG AGATCT GACCTCGCTGACGAG (Sg/H)。
片段2: F3F2, CG AGATCT AGCAAGCTCCCGCCC (Bg/II)和 F3R2, CG GGTACC GGGGACCTCGGCGAC (A>/I)。
2种片段的条件是940C, 4 min (1次循环)；940C, 30 s - 54°C， 30 s - 720C, 90 s (5次循 环)；94°C, 30 s _ 63°C, 30 s — 72°C, 90 s (35次循环)；72°C, 10 min (1次循 环)。
片段3: F3F3, CG CTCCCGCCCATCACC (^ "I)和F3R3，
TTTAAAAAGGCCGTAATATCC。 条件94。C, 4 min (1次循环)；940C, 30 s — 56°C, 30 s — 72°C, 90 s (35次循环)；72°C, 10 min (1次循环)。
在本例中，构建物Q2-pQE-32被用作基质，对片段1， 2和3分别获 得了大小约150, 370和290 pb的产物。使用的寡核苷酸是，对片段l为 F3F1和F3R1，对片段2为F3F2和F3R2，以及对片段3为F3F3和F3R3。 再次重复先前所述的序列连接步骤。使用的新的限制性酶是Sg/n和 《p"I。 在第三种即最后一种片段中，由于它很小只有66pb,因此决定对 载体pQE-32-Q2序列的 一部分进行扩增以获得较大的片段，从而能够更方 便地进行后续的纯化过程。在各步骤中，通过PCR获得的片段克隆在载 体pKS-Bluescript中并且验证了它的序列。通过脯氨酸(P )在第 一种片 段产生了对应于第一个谷酰胺氨基酸(Q)的自发突变。
最后，所得片段在商业表达载体pQE-32中进行亚克隆，该pQE-32在 N-末端含有额外的对应于亲和尾的13个氣基酸的序列(图8)所述序列对 具有200个氨基酸且表观分子量为21938 Da的多肽进行编码。
实施例2: 嵌合蛋白质Ql， Q2，和03的表达和纯化 从LB平板(分别补充了 100和25 pg/ml的氨比西林和卡那霉素)上 分离菌落开始，产生了 50ml的相同培养基的预接种体，并在搅拌下(260 rpm )于37 。C隔夜培养。用所述预接种体对1升到相同培养基进行接种， 从0.2的光学密度(600 nm )开始。混合物在37°C下搅拌培养1小时30 分钟，然后用IPTG (1 mM的终浓度)在相同的培养条件下对其进行诱导3 小时。
在Q2的情况下，细胞在4 。C, 10,000 rpm的条件下离心15分钟，再 重新悬浮于50 ml的裂解緩冲液(磷酸盐20 mM, pH 7.4; 50 mM咪唑；0.5 MNaCl)中。37。C搅拌下用溶菌酶(终浓度0.1 mg/ml)处理重新悬浮的 物质30分钟。然后进行超声处理(20秒5脉冲)，并将混合物在4 。C，15000 rpm下离心15分钟。上清液通过0.45 pm (Millex HV, Millipore)过 滤，并注入(2.5 ml/min)适用于AKTA Prime system (GE-Healthcare)的5 ml Hi-Trap螯合HP柱(GE-Hea他care)。 该柱用镍进行螯合，并事先用10 体积的裂解緩冲液进行了平衡。用15体积的裂解緩冲液洗涤柱后，用洗 脱緩冲液(磷酸盐20 mM pH 7.4; 0.5 M咪唑)对结合到柱上的蛋白质洗脱 至100%。 洗脱物经过5 ml Hi-Trap脱盐柱(GE-Healthcare)以除去盐并改 变20 mM pH 7磷酸盐緩沖液样品。将蛋白质保存在-40 °C。
在Ql和Q3的情况下，需要额外的纯化步骤。在细胞的诱导之后， 将之在4 °C， 10,000 rpm下离心15分钟，并重新悬浮于补充了尿素的50 ml的裂解缓冲液中，并采用在前面段落中描述的步骤。在第二步纯化步 骤中，将获得的洗脱物注入(l ml/min)事先用PBS平衡了的Hi-Load 16/60 Superdex-200柱(GE-Healthcare);在前面段落中描述的緩冲液中进行蛋白 质的洗脱。将蛋白质保存在-40。C。
在含SDS的聚酰胺凝胶(SDS-PAGE)中进行电泳。基本上按照 Laemmli 4苗述的方法[(31) Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277, 680-685],采用MINI-PROTEAN电泳装置(Bio-Rad)进行。测量为10 x 10 cm的且具有12.5%的聚丙烯酰胺浓度的凝胶，在tris-甘氨酸緩冲液中，进 行200伏特电流45分钟的电泳。用作参照物的蛋白质是用于低分子量的 来自Bio-Rad的试剂盒的参照物。分子量的计算和凝胶的光密度分析使 用图像分析仪(Diversity, BioRad)进行。
杂化蛋白质Ql表达为32 kDa的His-标签的融合蛋白质(图9 ),其产 生了终浓度2 mg/L的细菌培养物。Q2和Q3蛋白质表达为28 kDa的 His-标签的融合蛋白质，终产量分别为5mg/L和7mg/L的细菌培养物(图 9)。
实施例3:纯化的杂化分子的圓二色性分析 用配备了20。C恒温槽的Jasco PTC-423S温度控制器的Jasco J-810旋 光分光计记录pH 7.0和20。C时的Far-UV (190-250 nm) CD图谱。在0.2 cm槽中的20 mM磷酸钠緩沖液中的蛋白质的浓度为0.035 mg/ml，累计进行40 次扫描。所有的图谱均减去适当的背景，并转化为平均残基椭圓率。
用天然墙草属变态反应原混合物(Parj 1和Parj2)和杂化蛋白质通 过CD图谙分析二级结构元素(图10)。它们当中的杂化蛋白质的图语几 乎完全相同，但与天然的变态反应原的CD图谱完全不同。NPA图谱在 208 nm出现最小值，在222 nm出现清晰的肩峰，并在190 nm出现最大值， 而杂化蛋白质的图谱向几乎达到完全非折叠状态的无规巻曲构象移动。
实施例4:免疫学试验，以显示嵌合蛋白质对对欧蓍草过敏的患者的 血清混合物具有低的IgE-固定反应活性 (A) 免疫检测
对融合体1， 2和3的IgE-接合活性的首次评价是通过免疫转移法釆 用对欧蓍草过敏的患者的血清混合物进行的。蛋白质提取物和纯化的蛋白
质被载入聚丙烯酰胺凝胶后，按照Towbin等人的方法进行电转移[(32) Towbin, H., Staehelin, I., and Gordon,丄(1979).Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:Procedure and some 叩plications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354]。为此，由SDS誦PAGE 分离的蛋白质被电刺穿到PVDF Hybond-P膜(GE-Healthcare)。 膜在环境 温度下阻断1小时后，立即将它们用第一抗体在4。C隔夜温育，并且在用 相同洗涤缓冲液洗涤数次后，将膜在环境温度下用过氧化物酶偶联第二抗 体温育l小时。采用ECL化学发光法(GE-Healthcare),按照厂商描述，将 膜暴露于胶片(Hyperfilm.ECL, GE-Healthcare)， 检测到了带。
免疫检测试验显示在三种融合体之间不同的IgE-接合能力；仅在Ql 的情况下出现对IgE抗体的识别(图11 )。 在Q2的情况下，对IgE抗体 的识别出现急剧的下降，而在Q3的情况下，对IgE抗体的识别为O。
B)直接ELISA
IgE对三种融合体的反应性用ELISA法用来自对欧蓍草过敏的患者的 单个血清分析。在环境温度下用在PBS緩沖液(磷酸盐10 mM pH 7.2; 137mMNaC12.7mMKCl)中的每杯l 欧蓍草提取蛋白质或0.1 纯蛋白质隔夜温育聚苯乙烯盘(Greiner)。 它们用200 pl/杯的补充了 1 % BSA-0.05 % Tween 20的PBS进行封闭，并且保存在37°C 1小时。加入100 pl/杯的来自过敏患者的血清(稀释1/10)，并在37°C温育90分钟。经3 次用200 pl/杯的PBS-T (PBS + 0.05 % Tween 20)洗涤后，加入100 pl/杯的 对偶联过氧化物酶的人类IgE免疫球蛋白(Dako)的抗血清(稀释1:1000)， 并在37°C温育90分钟。经3次用PBS-T洗涤后，加入按厂商说明配制的 200 nl/杯的邻苯二胺(Sigma-Fast Tablet Sets, Sigma)溶液，并将盘保存在黑 暗中30分钟。用50 pl/杯的3 M H2SO4终止反应，并在ELISAEasy Reader EAR-400 AT (SLT-Lab Instmments)酶表仪中测量492 nm处的吸收。
仅在Q1的情况中显示出对IgE的反应性，而在Q2和Q3两种情况下均 显示基本上没有对IgE抗体的识别(图12)。
C) ELISA抑制
对于ELISA抑制实验，将对欧蓍草过敏的患者的血清混合物在抑制 蛋白质的给定浓度下(1-1000 ng/ml)在4°C隔夜预温育。后面的进行步 骤与ELISA直接测试中描述的相同。
在用欧蓍草过敏的患者的血清混合物进行的ELISA抑制实验中，Ql 表现出的对欧蓍草花粉的IgE-结合活性的抑制程度约为50%,这比nPar j 1-Parj 2的抑制程度(92%)低一些，从而有必要加入多500倍的蛋白质(图 13)。 嵌合体Q2和Q3达到约为60%的最大抑制程度，但要达到相同程 度的抑制，它们需要的蛋白质浓度比nPar j 1-Par j 2需要的要高出10,000 倍，这说明了这些嵌合体的变应原性降低了约99.99%。
实施例5:显示嵌合蛋白质Ql, Q2,和Q3的低皮肤反应性的活体内实
验
进行活体内皮肤反应(点刺)实验来评价嵌合体1， 2和3的低变应 原性，只在确定候选低变应原分子，以能够研发满意的针对对欧蓍草花粉 过敏的免疫疗法。
使用欧蓍草提取物，在大肠杆菌中表达的nPar j 1-Par j 2, rPar j 1和 rParj2,以及嵌合体l， 2和3进行皮肤试^^。纯化的蛋白质在含有0.5 %苯酚和50%甘油的盐水中稀释。在天然Par j, Par j 2, Ql的情况下使用的 浓度为0.5, 5,和50吗/ml;而在Q2或Q3的情况下使用的浓度为5, 50和 250 ng/ml。 分别4吏用0.9% NaCl和盐酸组胺(10 mg/ml)作为阴性和阳性 对照。
在实验中，将每种待检测的变态反应原液滴沉积在前臂的手掌区，然
后用柳叶刀通过液滴穿刺。每个测试进行两次，分别沿浓度增加和减小
的相反方向进行。15分钟后，用尖端细的黑色记号笔勾画出斑点的轮廓。
将低变应原的胶带置于斑点上，并轻微按压使墨水痕迹印到带上；并将之
转移到斑点记录斧反上。斑点面积通过用Summasketch凄t字化图形输入板
扫描记录以及计算机辅助的设计程序(Autocad v. 11)而测定。
所得的结果通过进行统计分析将结果描绘在方块图中并用Wilcoxon 检验相关变量进行说明(图14)。 这些图解表明对应皮肤反应的值的分布 (以斑点面积mm2测定)与关于提取物(平均值为65.25 mm2 -置信区 间95%:54.98-75.53 )和nParj l-Par j 2 (平均值为106.80 mm2 —置信区间 95%:91.90-121.70)的三种嵌合体的情况显著不同(P<0.001)。 嵌合体2 和3的值几乎为0: Q2 (平均值为0.95 mm2 -置信区间95%:0-2.89)以及 Q3 (平均值为0.15 mm2 -置信区间95%:0-0.47)。
实施例6:显示嵌合蛋白质Ql, 02，和Q3低的IgE抗体结合能力的
实验
作为对活体内实验的补充，使用EAST-直接法通过确定特异的IgE来 再次进行离体实验。
根据Ceska等人的方法[(33) Ceska, M. and Lundkvist, U. (1972).Anew and simple radioimmunoassay method for the determination of IgE.Immunochemistry 9, 1021-1030]，通过将天然的和重组的蛋白质(50 pg/ml)以及欧蓍草提取物(2 mg/ml)偶联至用溴化氰活化过的盘来确定特 异的IgE。 随后加入50 pi患者的血清，并在环境温度下温育1小时。洗 涤后，将盘在37°C下用接合到碱性磷酸酯酶上的人抗IgE抗体温育30分钟，然后按照厂商(Hycor Biomedical Inc.)用提供的IgE特异性Hytec试剂 盒EIA进行定量。
获得的结果再次验证了在活体内实验中的结果；在三种嵌合体中，Ql 保持了它相对于nParj l-Parj 2的免疫能力，而Q2和Q3在所述能力上产 生了显著下降(PO.OOl)(图15)。
实施例7: 诱导的淋巴增殖实验，以显示嵌合蛋白质Q1， Q2和Q3 的免疫能力
在免疫疗法中使用低变应原分子的一个基本要求是保持它的抗原性 (T表位)。因此，为验证除了不结合IgE抗体外，我们的蛋白质是否保 持抗原性，在由在实验中使用的各种蛋白质刺激的单核外周血细胞(CMSP) 上进行了淋巴增殖试验。试验通过比色法进行，其原理是用活细胞的线粒 体脱氢酶对四唑盐WST-1进行消化而形成通过比色法测量的曱臜化合物。
通过重力梯度离心使用淋巴细胞分离溶液(Lymphoprep, Nycomed)对 来自13名对欧蓍草过敏的患者的CMSP进行分离。然后将CMSP以lx106 活细胞/ml重新悬浮于培养基中(无血清的培养基AIM V, Gibco),并用 0.25%的PBS中的台盼蓝(Sigma Chemical Co.)测定它们的生存力。制 备出的生存力大于90%的CMSP按照厂商的描述(细胞增殖试剂WST-1, Roche Diagnostics )被立即用于离体增殖测试。它们被沉积在平底的微盘 (Nunclon, NUNC)中，200 ^最终体积的培养基中有2xl05 CMSP，并在37°C 和5% C02湿润的空气中用纯化至终浓度为0.0005-0.005-0.05-0.5-5 |ug/ml 的欧蓍草提取物和各种蛋白质进行测量，取三次测量值。在所有的情况 下均包括了未受刺激的培养物的三组对照。3天后，将20pl的细胞增殖 试剂WST-1加入到所有的杯中，并温育4小时。由新陈代谢活跃的细胞产 生的曱臜化合物通过在450 nm的吸收进行定量。用于实验中的重组蛋白 质为三种嵌合体以及在大肠杆菌中表达的rParj 1和rPar j 2。
在第一步中，对免疫性蛋白质进行扫描以确定用于后面实验部分的 最佳浓度。在所有情况下均发现表现出最大增殖(IE %)的蛋白质浓度为0.5pg/ml(图16)。
用13名对欧蓍草过敏的患者进行的增殖结果通过方块图统计分析以 及用于两组成对样品的非参数检验来确定。统计分析表明，用作对照的 欧蓍草提取物具有与nPar j 1-Par j 2 (P^.142)相差不大的抗原刺激能力， 并且Q1和Q2表现出的数值分布与提取物(分别为？=0.152和P=0.294) 和nPar j 1-Par j 2 (分别为P=0.484和P=0.182)无显著不同(图17)。 然而 Q3对提取物(P^.002)和nPar j 1-Par j 2 (P^.004)几乎没有刺激能力。另 一方面，需要指出的是rPar j 2和rPar j 1对提取物(分别为P= 0.142和 P=0.003)和nPar j 1-Par j 2 (分别为P=0.041和P,02)的较强的抗原能 力。
所得结果说明Q2仍保留了所述性能，而Q3则完全丧失。由以上所 述的为获得不同低变应原的分子来治疗对欧蓍草过敏的步骤可以总结 出，Q2应当为候选低变应原的分子，其产生满意的对欧蓍草过敏免疫治疗 效果。
施用方法
乳动物中的脱敏治疗。脱敏的方法涉及通过肠胃外途径(皮下的，静脉内 的，或肌肉的)，或口腔，舌下，鼻或直肠途径重复施用所述的变态反应 原。这些(多)肽可单独施用或与其他药学上可接受的稀释剂和赋形剂 组合，根据当前的法规和盖伦制剂使用规程。
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权利要求
1. 嵌合蛋白质，其特征在于它包含衍生自一种非特异性的1类脂质携带蛋白质的氨基酸序列，该嵌合蛋白质的氨基酸序列缺少一个或多个结合至IgE抗体的表位，其中IgE抗体对应于衍生出该嵌合蛋白质的氨基酸序列。
2. 权利要求1的嵌合蛋白质，其特征在于它包含氨基酸序列，所述氨 基酸序列衍生于对应于称为Parj 1和Parj 2的欧蓍草花粉的主要变态反 应原。
3. 权利要求1或2的嵌合蛋白质，其特征在于所述嵌合蛋白质氨基酸 序列包含Par j 1或Par j 2的28-53位置。
4. 权利要求3的嵌合蛋白质，其特征在于该嵌合蛋白质包含衍生自 缺少位于Parj 1和Parj 2的第28-53位的氛基酸序列的Parj 1和Parj 2。
5. 嵌合蛋白质，其特征在于它包含与SEQIDNo.:2、 SEQIDNo.:4或 SEQ ID No.:6的同源性至少为70%的氨基酸序列。
6. 权利要求5的嵌合蛋白质，其特征在于它包含与SEQ ID No.:4的 同源性至少为70%的氨基酸序列。
7. 嵌合蛋白质，其特征在于它包含氨基酸序列SEQIDNo.:2、 SEQ ID No.:4或SEQ ID No.:6。
8. 权利要求7的嵌合蛋白质，其特征在于它包含氨基酸序列SEQ ID No. :4。
9. 用于治疗免疫学病症的嵌合蛋白质。
10. 权利要求9的嵌合蛋白质，用于治疗过敏。
11. 多核苷酸，包含编码权利要求1-10中任一项的蛋白质的核苦酸序列。
12. 多核苷酸，包含与序列SEQ ID No.:l、 SEQ ID No.:3或SEQ ID No.:5的核苷酸序列同源性至少为70%的核苷酸。
13. 多核苷酸，包含与序列SEQ ID No.:3的核苦酸序列同源性至少为 70%的核苷酸。
14. 多核苷酸，包含核苷酸序列SEQ ID No.:l、 SEQ ID No.:3或SEQ IDNo.:5。
15. 权利要求14的多核苷酸，包含核苷酸序列SEQIDNo.:3。
16. 在转化的宿主生物内的微生物表达载体，其为自我复制的，并被 用于表达权利要求11-15中的多核苷酸。
17. 宿主生物，其用权利要求16中的微生物表达载体进行转化。
18. 4又利要求17的生物，该生物为原核生物。
19. 权利要求18的生物，该原核生物属于大肠杆菌(Ec^)属。
20. 权利要求17的生物，该生物为真核生物。
21. 产生含权利要求1-10中任一项的嵌合蛋白质的多肽的方法，其特 征在于该方法包括培养含有微生物表达载体的宿主生物，其中的微生物 表达载体在上述生物中进行自复制，并被用于表达权利要求1-10中任一 项的嵌合蛋白质。
22. 纯化权利要求1-10中任一项的嵌合蛋白质的方法，该方法包括从 培养物、细胞或两者分离嵌合蛋白质。
23. 权利要求1-10中任一项的蛋白质在治疗免疫病症中的应用。
24. 权利要求1-10中任一项的蛋白质在制备治疗免疫病症的药物中的应用。
25. 权利要求23或24所述的应用，其中免疫病症为过敏。
26. 权利要求25所述的应用，其中过敏为对欧蓍草(尸anetoha^^a/o ) 花粉的过敏。
27. 药物组合物，含有有效量的权利要求1-10中任一项的蛋白质和药 学上可接受的赋形剂。
28. 权利要求27所述的药物组合物，其中组合物为疫苗组合物。
29. 治疗免疫病症的方法，所述方法包括将权利要求27或28的药物 组合物向需要的研究对象施用。
全文摘要
用于治疗过敏的属于欧蓍草(Parietaria judaica)脂质转移家族的低变应原的嵌合蛋白质。本发明涉及对欧蓍草的不同变态反应原的嵌合多肽进行编码的重组DNA分子，其可用于预防和治疗过敏，尤其是花粉过敏。具体来说，描述了由具有低变应原特性的变态反应原Par j 1和Par j 2的片段构成的嵌合多肽。还描述了在异源表达系统中生产这些重组多肽的方法。还描述了对这些嵌合蛋白质进行纯化的有效方法。
文档编号C12N15/29GK101421296SQ200780013384
公开日2009年4月29日 申请日期2007年4月11日 优先权日2006年4月12日
发明者罗伯托·冈萨雷斯·里奥哈, 胡安-安德烈斯·阿斯图里亚斯-奥特加, 阿尔贝托·马丁尼兹-葛雷特 申请人:拜尔工业制药有限公司