专利名称：补体调控基因中预测年龄相关性黄斑变性的变体的制作方法
技术领域：
本申请涉及预测年龄相关性黄斑变性的个体遗传易感性的方法。
对政府资助的致谢
本发明受美国政府资助、依据国立卫生研究院授权号EY 13435 (RA) 和EY 11515 (GSH),并在来自国立癌症研究所、国立卫生研究院的联邦 基金(合约号NO1-CO-124000 )协助下部分由美国政府机构完成。美国 政府拥有本发明的某些权利。
背景技术：
年龄相关性黄斑变性(AMD)是影响黄斑的退化性眼疾病，所述黄斑 为提供精确视觉的中央视网膜的光感受器富集区。AMD导致通常仅维持 周边视觉完整的中央视觉突然恶化。AMD M达国家中不可逆失明的最 常见形式。该疾病通常表现为一只眼睛的中央视觉下降，随后在数月或数 年内另一只眼睛的中央视觉类似地丧失。该疾病的临床病征包括黄斑中存 在沉积物(玻璃疣)。
尽管是主要的公共卫生负担，但对AMD病原学和发病机理的了解仍 很少。许多研究已指出在AMD的病理生物学中具有炎症(Anderson等 (2002) Am. J. Ophthalmol. 134:411-31; Hageman等(2001 ) Prog. Retin.Eye Res. 20:705-32; Mullins等(2000) Faseb J. 14:835-46; Johnson等 (2001 ) Exp. Eye Res. 73:887-96; Crabb等(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 美国99: 14682-7; Bok， D. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci.美国102:7053-4)。 补体途径的功能异常可诱导对黄斑细胞的重大旁观损伤，导致萎缩、变性 和脉络膜新生血管膜的复杂化，与在其他补体介导的疾病过程中发生的损 伤类似(Hageman等(2005) Proc. Natl. Acad. Sci.美国102:7227-32; Morgan和Walport (1991 ) Immunol. Today 12:301- 6; Ki画hita (1991) Immunol. Today 12:291-5; Holers和Thurman (2004) Mol. Immunol. 41:147-52)。该疾病可能具有强大的遗传贡献。例如，FBLN6、 ABCA4和 APOE基因的变体已显示为危险因子。近来，发现补体因子H基因(CFH) 的变体与发生AMD的危险增加相关，所述补体因子H基因编码补体旁路 的主要抑制因子(Haines等(2005) Science 308:419-21; Klein等(2005) Science 308:385-9; Edwards等(2005) Science 308:421-4; Hageman等 (2005) Proc. Natl. Acad. Sci.美国102:7227-32)。
由于该疾病的患病率和可得到的有限治疗，需要鉴定发生AMD危险 的受试者的方法。
概述
已鉴定了对年龄相关性黄斑变性(AMD )呈保护性的多态性和基因型。 提供方法用于鉴定发生AMD危险增加的受试者。这些方法包括但不局限 于，分析受试者的因子B (BF)和/或补体组分2 (C2)基因，并确定所述 受试者是否具有至少一种保护性多态性。此类保护性多态性的实例包拟a ) BF (rs641153)中的R32Q; (b) BF (rs4151667)中的L9H; (c) C2 (rs547154)中的IVS10;和(d) C2 (rs9332739)中的E318D。或者， 可以通过在受试者中检测蛋白质变体来实施方法。如果受试者不具有至少 一种保护性多态性，所述受试者发生AMD的危险增加。在该方面的一个 实施方案中，对受试者CFH基因进行进一步的分析。在一些实施方案中， 可以在CFH基因座处分析受试者的基因型来确定所述受试者是否具有至少一种保护性基因型。在一个实施方案中，可以在BF或C2基因座处和 CFH基因座处分析受试者的基因型来确定所述受试者是否具有至少一种 保护性基因型。如此后公开的，在若干实例中，知道受试者的多态性是纯 合的还是杂合的将是有益的。
保护性基因型的实例包括U) BF (rs641153)中杂合的R32Q多态 性；(b) BF (rs4151667)中杂合的L9H多态性；(e ) C2 ( rs547154 )中 杂合的IVS 10多态性；(d) C2 ( rs9332739 )中杂合的E318D多态性；(e ) CFH中纯合的delTT多态性；(f) BF ( rsl048709 )中纯合的R150R多态 性；和(g)CFH中纯合的Y402。如果受试者不具有至少一种保护性基因 型，所述受试者发生AMD的危险增加。
本发明提供评估人受试者中黄斑变性或其他补体介导疾病发生或可能 i^艮的危险的方法。本方法的基础是某些遗传特征与补体相关疾病(在该 情况下是年龄相关性黄斑变性)的危险或保护性表型的遗传联合研究得到 的发现。本发明的方法包括步骤从人受试者中获得生物学样品，并通过 本领域已知的任何有效技术分析样品以确定所述受试者是否携带一种或多 种
BF基因rs641153处的A或G，其翻译成人BF蛋白质第32位的R
或Q;
BF基因rs4151667处的A或T,其翻译成人BF蛋白质第9位的L或
H;
C2基因rs547154处的G或T,其位于内含子10内； C2基因rs9332379处的C或G，其翻译成人C2蛋白质第318位的E 或D;
BF基因rsl048709处的A或G，其翻译成第150位的R; CFH基因中的ddTT;和
CFH基因rsl06U70处的C或T,其翻译成人CFH蛋白质第402位 的Y或H。
在某些实施方案中，分析样品以确定受试者是否携带一种或多种BF基因rs641153处的A或G，其翻译成人BF蛋白质笫32位的R
或Q;
BF基因rs4151667处的A或T，其翻译成人BF蛋白质第9位的L或
H;
C2基因rs547154处的G或T，其位于内含子10内；和 C2基因rs9332379处的C或G，其翻译成人C2蛋白质第318位的E 或D。
在一些实施方案中，样品是易得到的体液，如血液或血液成分，或尿。 当在DNA或mRNA水平上完成评估时，需要微孔材料以能够从受试者细 胞中检测基因型。
在一些实施方案中，受试者可能已诊断为患有包括AMD、早期AMD、 脉络膜新生血管形成(CNV)或地图样萎缩(GA)的疾病。在一个实施 方案中，受试者具有所述疾病的症状，例如早期黄斑变性症状如玻璃疾的 发生。 一些受试者可能呈现玻璃疣的发生。受试者可能无黄斑变性或其他 补体相关疾病的症状，在该情况下，分析基本上提供筛选方法，其通常可 以在全体群体或在认为处于危险增加的某一部分群体上(如具有补体相关 疾病家族史的个体)完成。然而，其他受试者可能处于获得AMD高危险 中。在一个实施方案中，受试者具有Y402H SNP。
因此，在另一方面，本发明提供用于评估人受试者中黄斑变性或其他 补体介导疾病发生或可能i^艮的危险的试剂盒。试剂盒包括用于在来自受 试者的样品中检测的试剂集合，所述受试者具有一种或多种，优选两种或 多种上面列出的多态性或等位变体。它可能包含设计为使用本领域已知的 任何方法检测变体的寡核苷酸，通常为标记的寡核苷酸。试剂盒可能包括， 例如当靶标是多态性或特异结合蛋白质(例如，单克隆抗体，其特异性识 别并结合目的蛋白质的等位变体，作为从样品中获得相关遗传/蛋白质组学 信息的基础)时，用于扩增目的多核普酸序列的PCR引物。在优选的实 施方案中，试剂盒包含固定在固体支持物上的寡核苷酸。
根据方式，试剂盒(用于鉴定发生年龄相关性黄斑变性(AMD)的危险增加的受试者)中的组分将包括用于检测受试者中至少一种保护性多态 性的一种或多种试剂。此类试剂允许检测至少一种保护性多态性，所述保
护性多态性包括(a) BF ( rs641153 )中的R32Q; (b) BF ( rs4151667 ) 中的L9H; ( c) C2 ( rs547154)中的IVS 10;和(d) C2 ( rs9332739)中 的E318D。此类试剂盒中的试剂可包括检测保护性多态性的一种或多种寡 核苷酸。试剂盒的其他組分可包括用于扩增耙序列的一种或多种试剂，其 中所述耙序列包含一种或多种保护性多态性。在一些版本的试剂盒中，一 种或多种寡核苷酸固定在固体支持物上。
在相关方面，本发明提供用于鉴定发生AMD的危险增加的受试者的 微阵列。在其他方面，本发明提供包含寡核苷酸探针的微阵列，所述寡核 苷酸探针能够在严格条件下与一个或多个具有保护性多态性的核酸分子杂 交。此类保护性多态性的实例包括(a ) BF ( rs64U53 )中的R32Q; ( b ) BF (rs4151667)中的L9H; (c) C2 ( rs547154 )中的IVS 10;和(d) C2 (rs9332739)中的E318D。此类微阵列还可包含能够在严格条件下与 一个或多个具有保护性多态性的其他核酸分子杂交的寡核苷酸探针，所述 多态性包括，例如(a ) CFH中的delTT多态性；(b) BF中的R150R多 态性；和(c ) CFH中的Y402H多态性。
公开的上述内容，以及其他特征和优点将通过以下几个实施方案的详 细描述变得更明显。 序列
4吏用核苷酸威基的标准字母缩写和如在37 C.F.R. 1.822中定义的氨基 酸三字母密码表示所附序列表中列出的核 列和M^列。显示了每 一核,列的仅一条链，但应当明白通过参考所示链也包括互补链。此处 引用的所有序列数据库登录号应理解为意指在指定日期通过可得到的所述 登录号鉴定的序列版本。在所附序列表中
SEQ ID NO: 1基于具有refSNP ID:rs641153的SNP,于2006年1月 30日(2006年1月5日校订)通过NCBI可得到所述refSNPID:rs641153。 该SNP在核苷酸第22位具有A或G,在BF基因中产生R32Q变体(在氨基酸第32位谷氨酰胺取代精氨酸)。R32Q提供的序列为 CCACTCCATGGTCTTTGGCCCRGCCCCAGGGATCCTGCTCTCT ， 其中R-A或G (SEQIDNO:l)。
SEQ ID NO: 2显示具有refSNP ID:rs4151667的SNP，于2006年1 月30日(2006年1月5日校订)通过NCBI可得到所述refSNP ID:rs4151667。该SNP在核苷酸第26位具有A或T，在BF基因中产生 L9H变体(在氨基酸第9位组氨酸取代亮氨酸)。rs4151667提供的序列为 ATGGGGAGCAATCTCAGCCCCCAACRCTGCCTGATGCCCTTTATC TTGGGC，其中R-A或T (SEQIDNO: 2)。
SEQ ID NO:3基于具有refSNP ID:rs547154的SNP，于2006年1月 30日(2006年1月5日校订)通过NCBI可得到所述refSNP ID:rs547154。 该SNP在C2基因的内含子10中核普酸第23位具有G或T。 rs547154提 供的序列为 GAGGAGCCCGCCAGAGGCCCGTRTTGGGAACCT GGACACAGTGCCC，其中R为G或T。 ( SEQ ID NO:3 )。
SEQ ID NO:4显示具有refSNP ID:rs9332739的SNP，于2006年1月 30日(2006年1月5日校订)通过NCBI可得到所述refSNP ID:rs9332739。 该SNP在核苷酸第26位具有C或G，在C2基因中产生E318D变体(在 氨基酸第318位天冬氨酸取代谷氨酸)。rs9332739提供的序列为 ACGACAACTCCCGGGATATGACTGARGTGATCAGCAGCCTGGAA AATGCCA，其中R为C或G ( SEQ ID NO:4 )。
SEQ ID NO:5显示具有refSNP ID: rsl048709的SNP,于2006年1 月30日(2006年1月5日校订)通过NCBI可得到所述refSNP ID: rsi048709。该SNP在BF基因中核苷酸第26位具有A或G。该SNP不 引起第150位的氨基酸改变(R150R)。
rsl048709提供的序列为
GATCTGTG,其中R为A或G ( SEQ ID NO:5 )。
SEQ ID NO:6和7显示delTT多态性序列。所述ddTT多态性是2bp 插入/缺失多态性。序列如下CCTTGCTATTACATACTAATTCATAACTTTTTTTTTCGTTTTAGAAAGGCCCTGTGGACA ( SEQ ID NO:6 );和
AAGGCCCTGTGGACA ( SEQ ID NO:7 )。
SEQ ID NO:8显示具有refSNP ID: rsl061170的SNP，于2006年1 月30日(2006年1月5日校订)通过NCBI可得到所述refSNP ID: rsl061170。该SNP在内含子9的核苷酸第1277位(以下序列中核苷酸第 26位)具有C或T,在CFH基因产生Y402H变体(在氣基酸第训2位组 氨酸取代酪氨酸 )。rsl061170提供的序列为
GGGTAA，其中R为C或T (SEQ ID NO:8 )。
SEQ ID NO:9显示具有9H & 32R的完整BF辱基酸序列 ，
<formula>formula see original document page 10</formula>
vvdvcknqkr qkgvpahard fhinlfqvlp wlkeklgded lgfl (SEQ ID NO:9) SEQ ID NO:10显示具有9L & 32Q的完整BF氨基酸序列mgsnlspqlc vcpsgfypyp ynvsdeisfh yrledsvtyh
t iegv<3aedg asygvkpa:yg
dyldvyvfgv vwehrkgtdy vggekrdlei
qyapgydlcvk wdvcknqkr
lmpfilglls ggvtttpwsl aqpqgscsle gveikggsfir llqeggaley
vgt;rtcrstg swstlktgdg ktvrkaecra ihcpxphdfe rxgeywprspy
cydgytlrgs anrtcqvngr" wsgqtaicdn gagycsnpgi pigtrkvgsq
csrgltlrgs grrtcgeggs wsgtepscgd sfmydtpqev aeaflsslte
hgpgeqgkr丄k ivldpsgs眼 iylvldgsds igasnftgak kclvnliekv lvtyatypki wvkvseadss nadwvtkcjln einyedhklk sgtntkkalg dvppegwr12rt rhviilmtdg lhnmggdpi t videirdlly igkc3:cknp:re gplvngvnin alaskkdneq hvfkvkdi^en ledvfygmid esqslslcgm hkqpwqakis virpskghes cmgavvseyf vltaahcftv dcikehsikvs evvlfhpriyn ingkkeagip efydydvali klknklkygq tirpiclpct ptttcqgqke ellpaqdika Ifvseeekkl trkevyikng dkkgscerda disewtprf lctggvspya dpntcrgdsg gplivhJorsr fiqygviswg qkgvpahard fhinlfgvlp wlkeklgdec3 lgfl (SEQ ID NO: 10)
SEQ ID NO:ll显示具有9H & 32Q的完整BF氨基酸序列
mgsnlspghc lmpfilglIs ggvtttpwsl agpggscsle gveikggsfr llqeggaley
vgtrtcrstg swstlktgdq ktvrkaecra ihcpxphdfe ngeywprspy
cydgytlrgs anrtcqvngr wsggtaicdn gagycsnpgi pig仁rkvgsq
csrgltlrgs grrtcqeggs wsgtepscqd sfmydtpgev aeaflsslte
hgpgeqqkrjk ivldpsgsmn iylvldgsds igasnftgaJc kclvnliekv lvtyatypki vrvkvseadss nadwvtkqln einyedhklk sgtntkkalcj dvppegwmrt rhvi丄lmtd3 lhnmggdpit videiirdlly igkdrknpre gplvnqvnin alaskkdneq hvfkvkdmen ledvfyqmid esqslslcgm hkgpwcjakis virpskghes crngawseyf vltaahcftv ddkehsikvs evvlfhpnyn ingkkeagip efydydvali klknklkygq tixpiclpct ptttcgqgke ellpagdika lfvseeekkl trkevyikng dkkgscerda disewtp:rf lctggvspya dpntcrgdsg gplivhkrsir fiqygviswg qkqvpahaxd fhinlfqvlp wlkeklqded lgfl (SEQ ID NO :11)
SEQ ID NO:12显示具有318D的完整C2 M酸序列
Tn犯lmvlfcl lflypglads apscpqrivni sggtftlshg wapgslltys cpqg]Lypspa
srlckssgqw qtpgatrsls kavckpvaccp apvsfengiy tprlgsypvg gnvsfecedg
filrgspv:rg crpngmwdge tavcdngagh cprapgislga vrtgfrfghg dkvryrcssii
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vwehrkgtdy vggekrdlei egttJralrlp qyapgydkvk wdvckriqkr1hvtikpksqe tergalisdg wvltaahcfr dgndhslwrv nvgdpksqwg kefliekavi spgfdvfakk nqgilefygd diallklagk vkmstharpi clpctmeanl alrxpggstc rdhenellnk gsvpahfval ngsklninlk mgvewtscae wsqektmfp nltdvrewt dqflcsgtqe despekgesg gavflerrfr ffqvglvswg lynpclgsad knsrkraprs kvppprdfhi nlfrmqpwlr qhlgdvlnfl pi (SEQ ID NO:12)
SEQ ID NO: 13显示具有32Q的9 BF氨基紗列wsl叫pqgs (SEQ ID NO:13)。
SEQ ID NO: 14显示具有9H的9 BF氨基財列lspqhclmp (SEQ ID NO:14)。
SEQ ID NO: 15显示具有318D的7 C2 ^&断列dmtdvis (SEQ ID NO:15)。
附图简述
图1是BF和C2中SNP的简图和单元型分析。^9f究中所用的SNP 与組合病例(CAS)和对照(CON)中的预测单元型、让步比(OR)、 P 值(P)和频率一同显示。对于H7， 95%的置信区间为(0.33-0.61)并且 对于H10为(0.23-0.56)。遗传(黑猩猩)单元型命名为Anc。已对具有 单元型H2( NCBI登录号AL662849,如2006年2月8日获得)、H5( NCBI 登录号AL645922和NCBI登录号NG—004658，如2006年2月8日获得) 和H7 (NCBI登录号NG—000013，如2006年2月8日获得)的样品进行 测序，并且在C2或BF基因中无额外的非同义变体存在(Stewart等(20(H) Genome Res. 14:1176-87 )。
图2显示组合的补体基因分析。个体SNP分析揭示了 SNP的几种可 能組合，其保护个体免于发生AMD。为了检测这些，首次使用了经验模 型。图2A显示图解模型，解释为给出将保护免于AMD的基因型的四种 可能組合。这些是(1) rs64U53 (R32Q)为G/A并且rsl061170 (Y402H) 为C/T; (2 ) rs547154为G/A并且rsl061170为C/C; (3 )rs4151667( L9H) 为T/A并且rsl061170为C/T; (4 ) rs4151667是T/A并且rsl061170是 C/C。该模型的应用引起图2B中显示的Iowa、 Columbia和组合组各自的分布。这些分布进行Fisher精确检测并显示P值为P = 0.00237、 P = 4.28x 108和p = 7.90x10"°。为了比较目的，Exemplar软件生成了保护性模型， 其使用称为Genetic Algorithms的机器研究方法为数据提供"最佳拟合"。 在图2C中描述了得到的最佳表现模型。该模型描述了保护免于AMD的 基因型的四种可能的单个基因型或基因型组合；即，导致模型"真实"的 组合。这些基因型是(1) rsl048709 ( R150R)为G/G并且rsl061170为 C/C;或(2 ) rs547154为G/A;或(3 ) rs4151667为T/A;或(4 ) CFH 内含子1变体为delTT。图2D中显示Iowa、 Columbia和组合组的才莫型表 现。这些分布分别显示P值为P = 0.00237、P = 4.28 x l(T8和P = 7.90 xlO 10。 图3显示BF (图3A)、 Ba (全长因子B的片段)(图3B )和沿视网 膜色素上皮(RPE)-脉络膜(CH)复合物(处于来自患有早期AMD的 72岁供体不固定眼的切片中)的C3 (图3C)的免疫定位。抗BF抗体 (Quidel;反应产物为红色)标记玻璃疣(D)，特别是沿它们的边缘、 玻璃膜和脉络膜基质。抗Ba抗体(Quidel;反应产物为紫色)标记玻璃 膜和RPE伴随斑点。注意BF的分布与C3的分布相似。RPE细胞质和脉 络膜中的棕色填色是因为黑色素的缘故。玻璃膜(BM);视网膜(R)。
发明详述
此处提供的是序列多态性，发现其赋予针对年龄相关性黄斑变性 (AMD)的保护性效应。这些多态性包括在因子B (BF)和补体组分2 (C2)基因中发现的那些多态性。保护性多态性也包括CFH基因中的 delTT多态性。鉴定具有这些多态性的受试者及具有近期发现的危险单元 型(补体因子H (CFH)基因中的Y402H)的受试者将帮助诊断处于AMD 遗传危险中的那些受试者。
术语
提供术语和方法的以下解释以更好地描述^/>开内容并在^L^开内容 的实践过程中指导本领域的普通技术人员。单数形式"一个"和"该"指一个或多于一个，除非本文清楚地另有说明。例如，术语"包括核酸"包 括单个或两个以上核酸并认为等同于短语"包括至少一个核酸"。术语"或" 指确定的备选元素的单一元素或两个或更多个元素的组合，除非本文清楚
地另有说明。如此处所用，"包含"意为"包括"。因此，"包含A或B" 意为"包括A、 B或A和B"，不排除其他元素。例如，短语"突变或多 态性"或"一种或多种突变或多态性"意为突变、多态性或其组合，其中 "一种，，可以指多于一种。
本公开内容的实践或检测中，但是下文描述了合适的方法和材料。该材料、 方法和实施例仅用作说明并不旨在限制。
除非另行指出，根据常规用法使用技术术语。可以在Benjamin Lewin， Genes V， Oxford University Press出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew等(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9);和Robert A. Meyers (编辑)， Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)中发现分子生物学 中常见术语的定义。
年龄相关性黄斑变性医学病症，其中黄斑中的光感觉细胞功能异常 并随时间停止工作。在黄斑变性中疾病的最终形式导致中央(视力读出部 分)的视力丧失或模糊。视力的外部外周部分保持完好。AMD进一步分 为"干涩的"或非渗出性形式，和"湿润的"或渗出性形式。85到卯％的 病例分类为"干涩"黄斑变性，其中脂肪组织(已知如玻璃疣)将在视网 膜后慢慢积累。干涩黄斑变性中的典型损伤是地图样萎缩。10到15%的病 例涉及视网膜下的异常血管生长。这些病例由于血液和其他流体从视网膜 后面渗漏到眼睛里而被称为"湿润"黄斑变性。湿润黄斑变性通常以干涩 形式开始。如果允许继续而不加以治疗，它通常会彻底破坏黄斑的结构和 功能。脉络膜新生血管形成是视网膜的视网膜色素上皮(RPE)层下面的 异常血管发生。对湿润黄斑变性的医学、光动力、激光凝固和激光治疗是可利用的。
AMD的危险因素包括衰老、吸烟、家族史、对日光尤其是蓝光的暴露、 高血压、心血管危险因素如高胆固醇和肥胖症、高脂才IUV、氧化应激和种 族。
AMD是特征为补体旁路级联失调的疾病的实例，其也包括膜性增生 性肾小球肾炎(MPGN)和发生主动脉动脉瘤的倾向。此处描述用于检测 发生AMD危险增加的方法也可用于检测特征为补体旁路级联失调的其他 疾病(例如，MPGN)的增加危险。
等位基因占据染色体上指定基因座(位置)的相同基因许多可变DNA 编码中的任何一个(有时术语指非基因序列)。该基因的个体基因型将是它 恰巧具有的一組等位基因。在每一条染色体具有两拷贝的生物(二倍体生 物)中，两个等位基因组成个体的基因型。在二倍体生物中，当基因的两 个拷贝相同时-即，具有相同的等位基因-说它们对那个基因而言是纯合 的。具有基因的两个不同等位基因的二倍体生物称为杂合的。
如此处所用，"检测等位基因"的方法可称作"基因分型、确定或鉴定 等位基因或多态性"，或任何类似的短语。实际检测的等位基因将在受试者 基因组DNA中是明显的，但也可以从RNA或蛋白质序列(从该区域转录 或翻译的)检测得到。
扩增增加样品中核酸分子拷贝数的技术的使用。体外扩增的实例是 聚合酶链式反应(PCR)，其中从受试者中获得的生物学样品与一对寡核 苷酸引物在允许引物与样品中核酸分子杂交的IH牛下接触。引物在适当条 件下延伸，从模板上解离并然后重退火、延伸并解离来增加核酸分子的拷 贝数。可以通过此类技术如电泳、限制性核酸内切酶切割模式、寡核苷酸 杂交或连接，和/或核酸测序对扩增产物进行表征。
扩增方法的其他实例包括如美国专利号5,744,311中公开的链置换扩 增；如美国专利号6，033，881中公开的无转录等温扩增；如PCT
发明者A·M·戈尔德, G·S·哈格曼, M·C·迪安, R·L·阿利科麦茨 申请人:爱荷华大学研究基金会;纽约市哥伦比亚大学信托人;美国国立卫生研究院