专利名称：表达cry1ac基因的转基因茄子(solanum melongena)的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含原种事件(elite event)EE-l的抗虫转基因
茄子植物。
背景技术：
茄子在农村种植已持续4000年，虽然它经常被认为是一种 地中海或中东蔬菜。已普遍认为印度是茄子起源的发源地。在 茄属蔬菜中，茄子(5^/awwm me/owge"a Linn.)是种植于在印度许 多地理部分中的最普通、普遍和主要的蔬菜作物。茄子种植面 积据估计为0.51百万公项，总产量为8，200,00(VX(FAO数据， 2004, http:〃faostat.fao.org/)。茄子由小农场主种植并且是收入 的重要来源。它是一种多用途植物，适于不同的农业气候区， 并且在印度可全年种植。在农村中种植有许多栽培品种，消费 者的偏爱依赖于栽培品种的产量、果实颜色，大小和形状。它 是高产的作物，果实以各种方式用作蒸调的蔬菜，在印度农村 人将干燥的茎用作燃料。它是矿物质和维生素的优质来源，并 富含总水分、可溶性糖、自由还原糖和酰胺蛋白质等。
然而，由于虫害侵扰，尤其是果实和嫩梢蛀虫(fruit and shoot borer)(丄ewc/"odw or6owa/" (Guen.))的牙急定增力口 , 近年来 在印度次大陆茄子产量已受到严重影响。果实和嫩梢蛀虫的幼 龄幼虫钻入大叶子的叶柄和中脉以及嫩茎，引起茎尖枯萎，并 且随后它们钻入花蕾和果实。受影响的果实除了产量上可观的 减少外，还失去它们的市场价值。在印度，据估计果实和嫩梢 蛀虫引起果实的损失为25.8-92.5%，产量减少为20.7-60%。
农民单独或组合使用大量的化学杀虫剂以获得在市场上取得溢价的无瑕疵的果实。杀虫剂滥用的实际导致在生产中产生 杀虫剂残留、天敌的毁灭、害虫再猖獗和环境污染。
为了在茄子作物中减少害虫相关的损失以及保护环境免受 杀虫剂的不利影响，配置在用于在茄子中高水平表达的合适的 启动子的控制下的鳞翅目特异co^7Jc基因将提供有效的用于果 实和嫩梢蛀虫的内置控制。由于与化学杀虫剂对茄子种植的贡 献相当，这将导致茄子种植成本的降低。
许多研究小组已使用不同方法进行茄子的转化。最成功的
方法是用于转化的农杆菌介导的方法(Kumar等1998 ， Nicola等 1998, Fdri等1995, Rotino等1990)。
c^;/基因的来源有机体是苏云金杆菌(Sac///^， Awr,'"g^w" )(Bt)，其为在芽孢形成期间合成杀虫晶体(Cry)内 含物的革兰氏阳性细菌。该cr少/Jc基因编码130kDa的cry 1 Ac蛋 白(5-内毒素)，并且对鳞翅目幼虫高度特异。crylAc蛋白必须被 昆虫摄取以展现杀虫活性。晶体形式的该蛋白在中性或酸性pH 下的水溶液中是不溶的，然而幼虫昆虫的肠道的pH为有助于该 蛋白质晶体溶解的碱性。溶解的蛋白质随后被昆虫肠道的蛋白 酶激活。这些蛋白酶从该蛋白质剩余部分切割羧基末端结构域 以及从该蛋白质的氨基末端切割约2 8个氨基酸。激活的蛋白质， 其由约600个氨基酸组成，通过昆虫的围食膜扩散至中肠上皮。 在此其结合到靶昆虫的中肠上皮表面上的特异高亲和受体上。 在该膜上形成孔，导致细^^内含物(如K+》参漏到肠腔，并且水 渗漏入上皮肠道细胞。由于渗透压和细胞溶解引起幼虫肠道上 皮细胞膨胀。由于肠道中电解质和pH的变化肠道变得瘫痪，导 致幼虫昆虫停止进食和死亡。
已知植物中外源基因的表达受植物基因组中转基因的位置 的影响。由于插入到可能为较高转录活性(常染色质)或较低活性(异染色质)的染色质区而引起转基因表达中的变化出现。这 些的实例为甲基化区，其中基因表达被抑制，或在转录调控元 件如增强子和抑制子的附近，其分别增加或减少基因表达。因 此，有必要筛选用于转基因表达的大量独立的转化事件，并且 鉴定显示异源插入基因所期望的表达的事件。
发明内容
本发明涉及包含原种事件EE-1的抗虫转基因茄子植物。该 转基因植物的特征在于包含在茄子基因组中的特异位点的在 CaMV35S启动子控制下的co;〃c基因。另外，本发明公开了用 于在茄子植物中检测原种事件E E -1的方法。本发明进 一 步提供 了用于鉴定包含原种事件EE-1的茄子植物的试剂盒。
本发明涉及使用cry/^c基因转化茄子植物以赋予抗虫性。 本发明涉及通过农杆菌介导法用植物表达载体pMON10518转 化茄子植物。另外它还涉及包含co^^4c基因的50个以上独立的 转化事件的生产。筛选和表征所有的独立事件以表达cryl Ac蛋 白质。基于crylAc蛋白质的表达水平和昆虫生物测定，选择两 个事件以进一步表征。本发明还涉及鉴定转化事件的方法。将 命名为EE-1的一个事件鉴定为原种事件并具体表征。
通过分子方法分析异源基因插入的特异位点。这包括将与 T-DNA右边界侧翼相接的基因组区克隆入合适的载体。本发明 还涉及通过测序表征和分析该侧翼区。本发明涉及从DNA序列 的该区设计引物以PCR扩增茄子原种EE-1事件的基因组DNA。
本发明进一步提供从其它茄子转化事件和非转基因茄子植 物中辨别E E -1原种事件的诊断工具。
本发明的一个方面为提供检测在样品中茄子植物EE-1原 种事件核酸序列的存在的方法，其中所述方法包括(a) 使样品与多核苷酸探针接触，其中所述多核苷酸包括源
自示于SEQ ID NO: 8中的序列的核苷酸22^f立至核普酸71位的至 少50个连续的核苷酸。
(b) 将样品与所述的多核苷酸探针置于严谨杂交条件下；和
(c) 检测在所述样品中所述多核苷酸探针至核酸的结合。 本发明的另 一方面为提供一种检测样品中茄子植物EE-1
原种事件核酸序列的存在的方法，其中所述方法包括
(aM吏样品与示于SEQ ID NO: 11中的第 一核苷酸序列和选 自由SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14组成的 组中的第二核苷酸序列接触。
(b) 进行核酸扩增反应，从而产生扩增片段；和
(c) 检测所述的扩增片段。
1211碱基对。
本发明的另 一 方面提供了用于检测茄子植物EE-1原种事 件的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 8 中的核苷酸序列或其互补序列组成。
本发明的又一方面提供了用于检测茄子植物EE-l原种事 件的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 9 中的核苷酸序列或其互补序列组成。
本发明的又一方面提供了用于检测茄子植物EE-l原种事 件的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 10 中的核香酸序列或其互补序列组成。
本发明的另 一 方面还提供了用于使用杂交方法检测样品中 茄子植物E E -1原种事件核酸序列的存在的试剂盒；其中所述试 剂盒包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10 中的多核苷酸序列或其互补序列；和用于杂交的緩冲液。本发明的另 一 方面还提供了用于检测样品中茄子植物
EE-1原种事件核酸序列的存在的试剂盒；其中所述试剂盒包含 具有示于SEQ ID NO: ll的序列的第一核苷酸序列和选自由 SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14组成的组中 的第二核苷酸序列。
本发明还提供了用于检测茄子植物EE-l原种事件的存在 的合成寡核苷酸，其中该寡核苷酸的序列选自由SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15组成的组。
本发明进一步提供了具有茄子植物EE-l原种事件的转基 因植物或种子，其中所述EE-1原种事件的基因组包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其 互^卜序歹ll 。
本发明进一步提供了具有茄子植物EE-1原种事件的转基 因植物细胞，其中所述EE-1原种事件的基因组包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其互 补序列。
本发明进一 步提供了具有茄子植物EE-1原种事件的后代， 其中所述EE-l原种事件的基因组包含示于SEQ ID NO: 8或 SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其互补序列。
图l显示了构建体pMON10518的图谱。
图2显示了使用事件特异引物的源自茄子植物的扩增产物 的凝胶图像。
泳道1:噬菌体V/7/wJ III标记
泳道2:源自包含EE-l原种事件植物的显示580bp扩增片段的DNA泳道3和4:源自不包含EE-1事件的转基因茄子植物的DNA 泳道5:源自非转基因茄子植物的DNA模板 泳道6:非DNA(水)-阴性对照
具体实施例方式
术语"扩增子"或"扩增DNA"、"扩增片l殳"是指为部分核酸 模板的靶核酸序列的核酸扩增产物。
术语"异源基因/DNA"是指插入植物基因组的外源DNA序列。
术语"事件"是指原始转化体，和通过含有异源基因的原始 转化体或其后代和其它茄子品种间的有性异型杂交产生的任一 后代。
术语"探针"是指用于杂交实验或检测的DNA序列。
通过在"严谨条件"下杂交意味着如由Sambrook等(1989)描 述的传统杂交条件(Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY)。
此处所用的"原种事件"，为选自一组事件的事件，该事件 基于转基因的表型表达和稳定性以及对包含其的植物不存在对 农学性状的负面影响，通过用相同转化的DNA转化或通过用由 该转化获得的植物回交获得(即选择的转化事件)。
本发明涉及包含原种事件EE-1的抗虫转基因茄子植物。该 转基因植物的特征在于在茄子基因组中的特异位点包含在 CaMV 35S启动子的控制下的co^"c基因。另外，本发明公开了 用于检测转基因茄子植物中原种事件EE-1的方法。本发明进一 步提供了用于鉴定包含原种事件EE-l的转基因植物的试剂盒。
本发明的 一 个实施方案为提供检测样品中茄子植物EE-1 原种事件核酸序列的存在的方法，其中所述方法包括(a) 使样品与多核苷酸探针接触，其中所述多核苷酸包括源 自示于SEQ ID NO: 8中的序列的核苷酸22位至核苷酸71位的至 少50个连续的核苷酸。
(b) 将样品与所述的多核苷酸探针置于严谨杂交条件下；和
(c) 检测样品中所述多核苷酸探针至所述核酸的结合。 本发明的另 一实施方案为提供一种检测样品中茄子植物
EE-1原种事件核酸序列的存在的方法，其中所述方法包括
(a) 使样品与示于SEQ ID NO: 11中的第 一核苷酸序列和选 自由SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: M组成的 组中的第二核苷酸序列接触。
(b) 进行核酸扩增反应，从而产生扩增片段；和
(c) 检测所述的扩增片段。
其中，所述的扩增片段为约5 8 0碱基对或约1012碱基对或约 1211》咸基对。
另外，本发明的另 一 实施方案提供了用于检测茄子植物 EE-1原种事件的分离的多核普酸，其中所述多核苷酸由示于 SEQ ID NO: 8中的核苷酸序列或其互补序列组成。
本发明的另 一 实施方案还提供了用于检测茄子植物EE-l 原种事件的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 9中的核香酸序列或其互补序列组成。
本发明的另一实施方案提供了用于检测茄子植物EE-l原 种事件的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其互补序列组成。
本发明的进一步实施方案提供了用于使用杂交方法检测样 品中茄子植物EE-1原种事件核酸序列的存在的试剂盒；其中所 述试剂盒包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: IO中的多核苷酸序列或其互补序列；和用于杂交的緩沖液。本发明的又 一 实施方案提供了用于检测样品中茄子植物
EE-1原种事件核酸序列的存在的试剂盒；其中所述试剂盒包含 具有示于SEQ ID NO: 11的序列的第 一 核苷酸序列和选自由 SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14组成的组中 的第二核苷酸序列。
本发明还提供了用于检测茄子植物EE-l原种事件的存在 的合成寡核苷酸，其中该寡核苷酸的序列选自由SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15组成的组。
本发明进一 步涉及具有茄子植物EE-1原种事件的转基因 植物或种子，其中所述EE-l原种事件的基因组包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其 互^卜序列。
本发明还涉及具有茄子植物EE-1原种事件的转基因植物 细胞，其中所述EE-l原种事件的基因组包含示于SEQ ID NO: 8 或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核普酸序列或其互补序 列。
本发明进一 步涉及具有茄子植物EE-1原种事件的后代，其 中所述EE-l原种事件的基因组包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其互补序列。
本发明提供了使用农杆菌介导的转化方法来转化茄子 (So/""wm me/o"ge"a)的才直才朱、才直物纟田月包和纟且织的有#文方法，以 赋予对昆虫害虫的抗性。
本发明的一个实施方案提供了用于转化的外植体，其选自 由具有叶柄的子叶、胚轴、胚芽、幼胚、叶片、子叶叶腋、茎 尖、花粉嚢、根和愈伤组织组成的组或任何其它合适的外植体。
本发明的另 一实施方案为提供了 一种通过PCR扩增或本原种事件E E -1的转基因插
入位点附近的侧翼序列的方法。核酸扩增可通过任一本领域已 知的各种核酸扩增方法实现，包括聚合酶链反应(PCR)。茄子
植物原种事件EE-1的鉴定方法通过引物步移方法进行。这还可
通过本4页i或乂^^口的方法进^f亍。
转基因插入片段和相邻的侧翼茄子D N A通过琼脂糖凝胶 电泳纯化，并克隆到本领域已知的合适载体中。克隆片段通过 本领域已知方法测序。
本发明的另一实施方案为提供了用于鉴定茄子植物EE-1 原种事件的诊断方法或检测。
本发明的另一实施方案为提供了在其它的背景或茄子的栽 培品种中导入E E -1原种事件的方法。
本发明的另 一 实施方案为提供了使用具有EE-1原种事件 的转基因茄子生产茄子杂交种的方法。
本发明的另 一实施方案提供了具有示于SEQ ID NO: 8-10 中的多核苷酸序列和其互补序列的新的DNA分子。
本发明的另一实施方案为提供了包含选自由SEQ ID NO: 8、 SEQIDNO: 9和SEQIDNO: 10组成的组中的多核苷酸序列 的转基因茄子植抹、植物细胞、种子和后代。
本发明进一 步提供了抗昆虫害虫的转基因茄子植物的生产 方法，其包括用DNA构建体pMON10518转^(匕茄子细胞。乂人上述 茄子细胞获得的该可育茄子植物可自花授粉或与相容的茄子品 种杂交以产生抗虫茄子植物。
将源自苏云金杆菌的杀虫co;"c基因转入由MAHYCO开 发的茄子系60208。本发明提供了使用农杆菌介导的转化方法来 转化痴子0SW^2wm we/o"ge"a)植物的植抹、植物细胞和组织的 有效方法，以赋予对昆虫害虫的抗性。用于茄子植物的农杆菌介导转化的外植体选自由具有叶柄 的子叶、胚轴、胚芽、幼胚、叶片、子叶叶腋、茎尖、花粉嚢、 根和愈伤組织组成的组或任何其它合适的外才直体。
将包含在CaMV e35S启动子和Gm7S终止子控制下的 co;/Jc基因；作为植物筛选标记基因的在CaMV 35S启动子控制 下的"/ ///的基因载体pMON10518(图l)转化入根癌农杆菌 (JgroZ ""er/ww /wwe/"c/e"5)纟田月包。将该重纟且才艮癌农4干菌4妄种入 用于农杆菌生长的适合培养基。将农杆菌细胞接种入在瓶中的 25ml无菌2YT培养基(pH7) 。 2YT培养基包含1 %酵母提取物、 1.6 %胰蛋白胨和0.5 % N a C1 。在接种细菌前将合适的抗生素加入 到该培养基中以用于具有质粒pMON10518的农杆菌的选4奪性 生长。将细菌接种到瓶中的2YT培养基上，并保持在摇床上以 获得0.01至2范围内，优选1.8的光密度(600nm)。
将外植体接种至重组农杆菌悬浮液中(优选15分钟)，在无 菌滤纸上印迹干燥(blotted dry)，随后转移至包含用于共培养的 合适生长培养基的培养皿。
共培养后(共培养2至5天，优选2天)，将这些外植体在液体 MS0培养基中用500mg/l的头孢p塞肟洗涤，以抑制农杆菌的生 长，并转移至选择培养基上。
将在选择培养基上再生的转化体转移至生根培养基，并将 生根的植物在温室中固化(harden)和定植(established)。
用p M O N10 518构建体转化茄子植物的具体方法在实施例1 中提供。
在本发明中，源自苏云金杆菌的co;/爿c基因已转移至由 MAHYCO开发的茄子系60208中，该茄子系60208具有以下性 状
果实颜色紫色、白色夹杂果实形状:卵形
植物习性:茂密
果实发育聚簇
花萼刺状
筛选超过5 0个独立的转化事件以筌定原种茄子植物E E -1 事件。所有事件进行转基因分离分析和蛋白表达评价以确定用 于商业化的最优事件。详情在实施例2中提供。
进行茄子植物EE-1原种事件的分子表征。具体在实施例3 中提供。进行进一步的用于鉴定茄子植物EE-1原种事件的诊断 方法。详情在实施例4中提供。实施例5描述了进行对于茄子植 物EE-1原种事件的合子检测。
本发明进一步提供了使用由Sambrook等描述的Southern杂 交方法检测在样品中茄子植物EE-1原种事件核酸序列的存在 的方法(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二片反，Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY)。 该方法包4舌1)在滤月莫 (filter)上固定植物基因组DNA片段，2)在42。C下在50%甲酰胺、 5XSSPE、 2X Denhardt试剂和0.1% SDS中预杂交滤膜l至2小时， 或在68。C下在6X SSC、 2X Denhardt试剂和0.1 %SDS中预杂交 滤膜1至2小时，3)加入已标记的杂交探针，4)温育16至24小时， 5)在室温下在1X.SSC、 0.P/。SDS中洗涤滤膜20分钟，6)各在68。C 下在0.2XSSC、 0.1。/。SDS中洗涤滤膜20分钟3次，和7)在-70。C下 用增光屏将滤膜曝光在X-射线胶片上24至48小时。杂交可通过 本领域已知的方法进4亍。
茄子植物EE-1原种事件基于许多标准选择。超过三代的分 离分析表明在该系中存在co^^c基因插入的单一位点。这通过 DNA印迹分析确认。在许多茄子单一插入事件上进行使用定量 ELISA的蛋白质定量研究。这些研究表明EE-1系为最高的crylAc蛋白表达系，插入基因的表达在许多不同的遗传背景下 经过多个世代是稳定的。EE-1原种事件承载系的表型分析表明 其在形态学上不能区别于其所起源的非转化亲本系，因此最适 合用于进一步回交育种。使用原种植物以将EE-1原种事件转移 至其它茄子栽培品种。
核酸扩增可通过任何本领域已知的各种核酸扩增方法实 现，包括聚合酶链反应(PCR)。本领域已知各种扩增方法，并 描述于PCR protocols: a guide to methods and applications(Innis 等主编，Academic Press, San Diego, 1990)中。转基因插入 和相邻的侧翼茄子D N A通过琼脂糖凝胶电泳纯化并克隆。克隆 片#殳通过本领域已知的方法测序。
虽然本发明已粗略的如上定义，本领域技术人员将意识到 其不限于此，并且其还包括以下描述给出了实施例的实施方案。
实施例
给出的实施例仅为本发明中要求的用途、方法和产品的说 明，本发明自身的实施不限于所描述的实施例，或由所描述的 实施例i兌明。
实施例l
茄子的转化
种子的消毒和接种
在50ml塑料离心管中用1.5。/。NaOCl将来自系60208的茄子 种子进行表面消毒10分钟，同时剧烈摇晃(500粒种子用 20mlNaOCl)。 5分钟后将溶液倒出，并用无菌蒸馏水洗涤种子5 次。将种子在无菌滤纸上印迹干燥l小时，并以10粒种子/每瓶 接种到瓶中的MS0培养基(表1 )上。在16小时光照和8小时黑暗 的光周期状况下将种子保持在25。C下12-15天以萌发。
农杆菌培养进行共培养的前一天，将包含转化载体pMON10518的农斥干 菌菌林的培养物在28。C下在25ml液体LB培养基中在175rpm的 摇动下用各自的抗生素培养过夜。该过夜培养物起始自菌环量 的取自含相同抗生素的新制的条状(freshly-streaked)固态培养
基盘的细菌细胞。 外植体制备
在共培养的当天，将子叶从2-15天大的幼苗除去，并沿中 脉纵向剪成两半，并用作外植体。将外植体保持在在培养皿中 用液体MS培养基(表1)浸湿的无菌滤纸上，以防止外植体干燥。
共培养
在共培养的早上，将过夜培养的细菌培养物在1 OOOOrpm下 离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于液体MS培养基(25ml) 中，并充分混合(表l)。将25 ju l的100mM乙酰丁香酮力口入到细 菌培养物中，将该细菌培养物随后放置于培养箱中在摇晃下另 外2小时以生长。纟田菌培养物的光密度(OD)在600nm下测量，直 到达到1.5-1.8的OD。外植体在培养皿或玻璃烧杯中的细菌培养 物中在緩慢搅拌下培育10分钟。随后将外植体在无菌滤纸上印 迹以除去过量的细菌，并放置于共培养培养基BlAsP(请在表中 查找该培养基组合物)中三天以共培养。(15个外植体/每盘)。
将该盘在25°C下在16小时光照+8小时黑暗的光周期状况 下在光照下培育三天。
还在各实验中保持阳性或阴性对照。阳'性对照为在无抗生 素的培养基上再生的外植体，以校验组织培养物再生，而阴性 对照为保持在含抗生素的培养基上的外植体，以确保抗生素检 验生长。
选择(B1KC培养基)
三天后，将外植体转移至具有卡那霉素50mg/l和头孢噻肟250mg/l的选择培养基BlKC(表l)培养基上2周的时间。转化的 外植体在外植体的切割端产生愈伤组织，而未转化的外植体变
上两周。在选择培养基上重复此操作6周的总时间。在第六周末， 产生绿色的分生组织/愈伤组织。 再生(CF2KC培养基)
将绿色的分生组织转移至具有卡那霉素50mg/l和头孢噻肟 250mg/l的再生培养基，CF2KC(表1)两周的时间。将愈伤组织 在新鲜培养基上每两周传代培养三次(3次选择)，产生源自愈伤 组织的小的绿色枝芽(shoot buds)。
伸长(BrootKC培养基)
将枝芽转移至具有卡那霉素5Omg/1和头孢噻肟25Omg/1的 BrootKC培养基(表1)两周的时间。将该枝芽在新鲜培养基上每 两周进行2次传代培养(2次选择)。在第四个周末，枝芽伸长并 准备生根。有时在伸长培养基上可能开始生根。如果生根在伸 长培养基上开始，保持小植物不受干扰以免损伤根。
生根(TMRGKC培养基)
将该茎转移至有卡那霉素50mg/l和头孢噻力亏250mg/l的生 根培养基TMRGKC(表l)上两周的时间。每两周将该茎传代培养 直到出现生根。
固化(harden)
将生根的植物用无菌蒸馏水彻底洗涤以除去胶凝剂(琼脂 或植物凝胶(phytagel))。在转移至含普罗米克斯(promix)(60%) 和土壤(40%)的混合物的杯中之前，将该植物用0.1 %的多菌灵 杀菌剂(Bavistin)处理至少l小时。将该植物用聚乙烯袋罩住7 天。7天后，将聚乙烯袋从角剪开，以允许固化过程开始，其在 约2周内完成。目的
细菌 细菌接押 纟田菌再悬浮—
<formula>formula see original document page 18</formula>
种子接种 共培养
选择
表l:用于茄子转化的培养基的组分 Sr. ) ^錄i ■ 一
No.—
1 — : LS ——固尿:胰^白胨—i0gm/L,，每哀泉物5gm/L, NaCl 10 :
gm/L,pH7.0,琼脂15gm/L 2丄B液体(胰蛋白胨10gm/L,酵母哀取物5gm/L,NaCl 10 ::
i ! ;gm/L,pH7.0
3 ;MS液体；MS大量(MS m^jor)100ml/L, MS微量(MS
^ninor)10ml/L, MS CaCl2 10ml/L, MS铁10ml/L， MS; :维生素lOml/L,肌醇lOml/L,蔗糖3%, pH 5.8 | MS大量100ml/L,MS微量lOml/L, MS CaCl2 : 10ml/L，MS铁10ml/L,B5维生素10ml/L,月几醇；
; 10ml/L,蔗糖3%, pH5.8,琼脂0.8%
5 : BlAsP 1 MS大量lOOml/L, MS微量lOml/L, MS CaCl2 | !10ml/L,MS铁lOml/L, B5维生素lOml/L,肌醇 :10ml/L,NAA0.05mg/L，玉米素2mg/L,乙酰丁香i
; :S同lOOuM，葡萄糖1.5%, pH5.8, 植物凝胶
: 0.35% I
6 B1KC : MS大量100ml/L,MS微量lOml/L, MS CaCl2 :
10ml/L,MS铁lOml/L, B5维生素10ml/L，肌醇； I 10ml/L,NAA0.05mg/L,玉米素2mg/L,葡萄糖 ; |l.5%,卡那霉素50mg/l,头孢噻肟250mg/l,pH:
i : 5.8, 琼脂0.8%
7 : CF2KCMS大量100ml/L， MS微量lOml/L, MS CaCl2 !
!10ml/L, MS铁10ml/L,B5维生素lOml/L,肌醇 ;10ml/L, BAP2.5mg/L,激动素lmg/l,腺噪呤(自 ;由基)2mg/L， IAA0.5mg/1,蔗糖3%卡那霉素50: ' ! m名/1,头孢噻肟250mg/l,pH5,8, 琼脂0.8% ;
! 8 ;BrootKC[ MS大量100ml/L,MSi量10ml/L， MS CaCl2 : I |10ml/L,MS铁10ml/L,MS維生素lOml/L,肌醇|
I j :10ml/L, IAA0.5mg/1,葡萄糖1.5% ，卡那霉素^
; i50mg/1,头孢^月T 250mg/l,pH5.8, 琼脂0.8%!
9 : TMRGK: MS大量50ml/L， MS#* 1 Oml/L, MS CaCl2 ! C :10ml/L, MS铁10ml/L,B5维生素lOml/L,肌醇: : ; :10ml/L,葡萄糖0.75%， 卡那霉素50mg/L,头孢i
: 1 漆月亏250mg/L，pH 5.8,植物凝胶10.35%. :
实施例2
茄子植物EE-l原种事件的鉴定
产生大量(>50)的独立转化事件以最大化高-转基因-表达的 遗传稳定的事件的机会用于商业化转基因茄子系的生产。将转
，基因存在的分
再生
伸长
生根析，并将阳性植物进行ELISA以确定该转基因的表达性。将起 始转化体CTO)通过自交发展下一代，通过PCR检查T1后代植物 以确定转基因的分离。在具有单co;^Mc基因插入的系中对于转 基因的预期T1分离率为基于孟德尔遗传学的3:1。另外，由于当 导入作为转基因时，c^;/Jc担当显性基因，该基因的表达在T1 代中通过ELISA监视。此外，在单一插入事件中，crylAc表达 植物与未表达植物的预期比值为3:1。在源自选择的系的组织上 进行昆虫生物测定以确定哪一 系将具有抗果实和嫩梢蛀虫害虫 的较好功效。进行选择的个体转化事件的Southern印迹分析以 确认位点的数目(插入拷贝数目)，在所述位点处转基因整合到 茄子基因组。
基于上述标准，选择转化系，该转化系显示单一位点插入 事件的分离性状和显示对果实和嫩梢蛀虫的有效耐性。相反地， 不再采用那些发现具有异常分离率和/或抗害虫低功效的系。将 选择用于进展的系种植于温室中，通过定量ELISA在作物的整 个生命周期评价CrylAc蛋白质，其能够确定最高蛋白表达系。 所分析的组织为叶、芽、茎、花和根。仔细分析上述参数后， 根据三个植物世代的CrylAc表达、抗害虫功效和遗传稳定性， 发现事件EE-1为最有效的事件。将EE-1原种事件用于进一步的 育种以开发果实和嫩梢蛀虫抗性茄子。
实施例3
EE-1原种事件的分子性状
使用Cottage等，2001的方法分析茄子转基因EE-1原种事 件，以鉴定与CrylAc基因表达盒侧翼相接的茄子基因组DNA序 列。使用本领域已知的方法从具有EE-1原种事件的植物的新鲜 嫩叶中，提取植物基因组DNA。将基因组DNA(2i^g)在使用标准 緩沖液的20jil反应体积中用Zww/酶消化。消化反应在37。C下温育过夜。然后将消化产物在65。C下温育以使酶失活，并用3M醋 酸钠和乙醇沉淀。将DNA风干和溶解于12pl无菌蒸馏水中。在 由厂商提供的连接酶緩沖液中将已消化的DNA连接到退火的 衔接子上。衔接子的序列如下
ADAP 1: !T-CTA ATACGACTCACTATAGGGCGGCCGCCCGGGCAGGT- 3'SEQ !D. NO: 1
ADAP 2: 5，- P-ACC TGC CC-, -3' SEQ ID NO: 2
两种衔接子首先相互退火和然后连接到EE-1原种事件的 已消化的基因组DNA上。
将连接混合物在15-16°C下温育过夜以使已消化的基因组 D N A连接到退火的衔接子上。将连接混合物稀释至10 0 p 1以获得 衔接子文库，并且使用以下的引物组合进行第一轮扩增与插 入的异源DNA SEQ ID NO: 3互补的正向引物，和与摊f接子DNA 序列SEQ ID NO: 4互补的反向引物。
國P隱10 - 5'- TTG GGT CTT TCA GAC T(]A CAA G -3' SEQ〖D NO: 3 AP - 5'- GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' S已Q ID NO: 4 限制酶切消化
基因组DNA
12.0^il (2吗) 2.0[il(最终浓度lx)
10X反应緩沖液
為"I酶
1.0pl(10单位/ial)
无菌水
补足体积至20.0^1.连接
消化的基因组DNA(热失活) 退火的衔接子
10X反应緩冲液 T4-连接酶
第一PCR:
无菌水
试剂 无核酸酶水
10X反应緩冲液(具有MgCl2) 10mMdNTPs 引物MHIP-10(100ng/(11) 引物AP(100ng/pl) Taq DNA聚合酶(5单位/pl) DNA模板
热循环4义程序
95 °C 94 °C 58°C 68 °C 68 °C 4°C
时间 5分钟
30秒
30秒 4分钟 10分钟
保持
12単(2吗) 2.0|il(100ng/(il)
3.0pl(最终浓度lx) 1.0(11(5单位/fil)
补足体积至30.0|il
体积 补足至25^1 2.5(xl 0.5(^1 1.0|il l単 0.5|il
循环 1
40第二轮P C R是必需的以获得与插入的异源基因相邻的特异
侧翼区。PCR用正向引物(SEQ ID NO: 5)和反向引物(SEQ ID NO:6)进4亍。具体如下纟合出
MHIP-11- 5'- CTG ACA AGA TCG ATC TGA AGT C -3' SE( TD NO: 5
NAP ^ 5'- TAT AGG GCT CGA GCG GC-3'
第二PCR
式剂
无核酸酶水
10X反应缓沖液(具有MgCl2) 10mMdNTPs 引物MHIP-1 l(100ng/pl) 引物NAP(100ng/pl) TaqDNA聚合酶(5单位/pl) DNA模板
热循环程序
溫度 95 °C 94 °C 58°C 68。C 68 °C 4°C
时间 5分钟
30秒
30秒 4分钟 10分钟
保持
SEQ ID NO: 6
体积 补足至25^1 2， 0.5jil l.Ojil 1， 0.5 (il 2単
循环 1
40
在1 %琼脂糖凝胶上分析少量的PCR产物，通过使用本领域已知的方法从凝胶上洗脱扩增片段。两4仑PCR(使用引物
MHIP-ll SEQ ID NO: 5和NAP SEQ ID NO: 6)后，将309bp的
增子)克隆至pGEM-T Easy载体上以获得重组载体。将该重组载 体通过本领域已知的方法转化至大肠杆菌菌抹中。菌林可为 DH5a， ToplO等。将选择的用于分析序列的包含该重组载体的克 隆称之为EE-l-Xmnl-4。使用本领域已知的标准方法分离源自 克隆EE-1 -XmnI-4.的质粒DNA 。使用T7引物测序该克隆片段(扩 增子)。获得的多核苷酸序列如SEQIDNO: 7所示。该序列包含 由部分Gm7S终止子和右边界、衔接子序列和与茄子基因组 DNA序列侧翼相接的EE-1 T-DNA构成的T-DNA载体序列。
序列ID NO: 7由以引物MHIP-11开始(SEQ ID NO: 5，碱基 对1-22)、之后为附近是EE-1原种事件的侧翼茄子基因组DNA序 列(碱基对143至278)的右边界序列(碱基对97-142)的部分 T-DNA序列构成。衔接子序列(碱基对279至309)在该侧翼基因 组序列之后。
SEQ ID NO: 7
CTGACAAGATCGATCTGAAGTCTAAACAATTCTAAGAGGTATCATGTAGCAGTGTCC TGCCACAATATTGAATTGACCTGCAGGCATGCAAGCTGGGM CA(3ATAGTCGTTTCC CGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGTTACCAAAAGTGCTGTCAATAAACACTTA GAAAGGTGTTATCCAAATTTTAAAAAGAAAAAAATAAATGTAAGATTTAAATTTCTA ACTTCAAGAGATGCATTCAATTATCACCGCATTATATGATATTCCAAGAATACCTGC CCGGGCGGCCGCTCGAGCCCTATA
序歹'JIDNO: 8由右边界序列(1-46)、之后的EE-1原种事件的 侧翼茄子基因组DNA序列(47-182)构成。该完整的多核苷酸序 列示于SEQ ID NO: 8。SEQ ID NO: 8
GATCAGJVTAGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGTTACCAA2\AGT
GTAAGATTTAAATTTCTAACTTCAAGAGATGCATTCAATTATCACCGCATTATATGA TATTCCAAGAA
序列ID NO.' 9由右边界序列(1-41)、之后的EE-l原种事件的 侧翼茄子基因组DNA序列(41-125)构成。该完整的多核香酸序 列示于SEQ ID NO: 9。
SEQ ID NO: 9
GTAAGATTTAA
序列IDNO: 10由右边界序列(1-15)、之后的EE-l原种事件 的侧翼茄子基因组DNA序列(16-75)构成。该完整的多核苷酸序 列示于SEQ ID NO: 10。
SEQIDNO: 10
TTATCCMATTTTAAAAA
实施例4
用于鉴定EE-l原种事件的诊断方法
PCR方法
为了检测茄子EE-1原种事件的存在或不存在，开发了分子 诊断方法。进行如SEQ ID NO: 8所示的片段的序列分析，并设 计引物来扩增转基因插入位点以用作诊断工具。设计的两种引物为正向引物MI-ITBJ-2 (SEQ ID NO: 1 l)和第二引物MHIP-2 (SEQIDNO: 12),以扩增源自EE-l基因组DNA的转基因插入位点。
MHTBJ-2: 5、 TGC GGT GAT AAT TGA ATG CAT C -3' SEQ II) NO: 11
M證-2: 5'- GGA GCT TCT CTT GAT GGA GG -3' SEQ ID MO: 12
这些引物对包4舌{旦不限于SEQ ID NO: ll和SEQ ID NO: 12。为了3，区的扩增，衍生自SEQ ID NO: 8的任一引物对，当 其用于DNA扩增反应时产生用于EE-l原种事件i貪断的DNA扩 增子，为本发明的一方面。多核苷酸序列为从CrylAc基因至右 边界(从SEQ ID NO: 16中提供的核普酸位点1至4091位点)。完 整的多核苷酸序列由GM7S终止子侧接的Oj〃c基因、之后的 右边界，该右边界进一步之后的茄子基因组DNA和衔接子序列 构成，提供于SEQ ID NO: 16中。
然而，使用DNA分子或其互补物以产生用于EE-1诊断的扩 增子DNA分子的这些方法的任何变型，为本领域的公知常识。 例如如果SEQ ID: ll引物与引物l(SEQ ID NO: 13)组合使用将 产生1012碱基对的扩增子，或与引物2 (SEQ ID NO: 14)组合使 用将扩增源自EE-1事件的1211碱基对。该引物l和2的序列如 下
Primer 1:- 5，- CGAGCTTAAGTTCTCCAACTGC-3， SEQ ID NO: 13
Pri證2:- 5，- GGAATGTGAAAGGTCATGTGG- 3' SEQ ID NO: 14
对于分析，具有阳性和阴性对照是重要的。设计PCR方法 以从其他茄子转基因事件和非转基因系中辨别出EE-l原种事 件。使用本领域已知的方法从叶子中分离源自茄子EE-l原种事 件的基因组DNA。还从其它茄子转基因事件和非转基因茄子系中分离基因组DNA以作为用于PCR4企测方法的对照。还包括在 反应混合物中不含DNA的对照反应。
使用两种引物，即SEQ ID NO: ll和SEQ ID NO: 12,将源 自不同植物的基因组DNA进行扩增，具体如下
试剂 加入量 无核酸酶水 补足至25pl
10X反应緩沖液(具有MgCl2) 2.5^1
lOmMdNTPs 0，
I物MI-IIP-2( 1 OOng/pl) 1.0)il
亏！物MHTBJ-2( 1 OOng/pl) 1 .Ojil
Taq DNA聚合酶(5单位/jil) 0.5|il
DNA模板 2.0jil
温度时间循环
95 °C5分钟1
94 °C30秒
58°C30秒35
72 °Cl分钟
72 °C5分钟1
4°C保持___
将扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上分析。获得的结果如图2 所示。泳道l包含用/i7wd III标记消化的X噬菌体DNA。在泳道2 中的样品包含源自EE-1原种事件的DNA,而泳道3和4中的样品 包含源自其它不包含EE-1原种事件的转基因茄子植物的DNA。道6为非DNA对照样品。从图 中明显看出580bp片段扩增自茄子EE-1原种事件，而不是其它 转基因事件和非转基因茄子植抹。 实施例5
用于茄子EE-1原种事件的合子检测
表征插入位,泉附近的基因组区。将插入位点的 一 端进行序 列分析，该序列为如在SEQ ID NO: 8中示出。分析源自T-DNA 的其它侧翼侧的茄子基因组DNA序列，设计具有如SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的引物。当该引物与具有SEQ ID NO: 11 和SEQIDNO: 12所示的核苷酸序列的引物组合^f吏用时，由于扩 增转基因特异等位基因，从包含EE-1原种事件的转基因茄子植 物获得580碱基对片段，和由于从SEQIDNO: ll和SEQIDNO: 15扩增非转基因等位基因带，从非转基因茄子植物获得330碱基 对片段。
MHTBM: 5，-CCA TCT ACT AAC GGT GAT GGT -3， SEQ ID NO: 15
为了鉴定包含EE-1原种事件的纯合和杂合转基因茄子植 物，使用具有SEQIDNO: 11、 SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 15 所示的核苷酸序列的三个引物进行聚合酶链反应。
使用本领域已知的方法分离源自包含EE-l原种事件的转 基因茄子植物和非转基因茄子植物的基因组DNA。利用该DNA 作为DNA模板进行PCR分析。用于进行用于EE-l原种事件的接 合性PCR的PCR条件给出如下i式剂 力O入量
无核酸酶水 补足至25(il
10X反应緩冲液(具有MgCl2) 2.5(il
10mMdNTPs 0，
亏1物MHTBJ-6(1 OOng/pl) 1.0|il
亏1物MHIP-2( 100ng/|il) 1.0(il
1物MHTBJ-2( 1 OOng/jil) 1 .Opl
Taq DNA聚合酶(5单位/pl) 0.5^1
DNA模板 2.0(^1
热循环程序
温度 时间 循环
95 °C 5分钟 1
94 °C 40秒
58°C 40秒 35
72 °C l:40分钟
72 °C 5分钟 1
4°C 保持 ---
聚合酶链反应扩增了源自包含EE-l原种事件的纯合茄子 植物的580碱基对的片段；580和330碱基对大小的两个片段从包 含EE-1事件的杂合茄子植物获得；330碱基对大小的片段从非 转基因茄子植物获得。 SEQIDNO: 16<formula>formula see original document page 29</formula>GTTCGTGAACTCCCAATATGATCAGTTGCAAGCCGACACCAACATCGCCATGATCCA CGCCGCAGACAAAa3TGT GCACAGCATTCGTGAGGCTTACTTGCCTGAGTTGTCCGT GATCCCTGGTGTGAACGCTGCCATCTTCCmGGAACTTGAGGGACG'rATCTTmCCGC ATTCTCCTTGTACGATGCCAGAAACGTCATCAAGAACGGTGACTTCAACTATGGCCT
CGTCCTGGTTGTGCCTOM3TGGGAAGC'rGAAGTGTCCCAAGAGGTTAGAGTCTGTCC AGGTMmGGCTACATTCTCCGTGTGACCGCTTACAAGGAGGGATACGGTGAGGGTTG CGTGACCATCCACGAGATCGAGAACAACACCGACCmGCTTAACTTCTCCAACTGCGT CGAGGAAGAAATC'rATCCCAACAaCACCGTTACTTGCAACSaCTACACTCTGAATCA GGAAGMn'ACGGAGGTGC'CTACACTAGCCGTAACAGAGG'rTACAACGAAGCTCCTTC CGTTCCTGCTGACTATGCCTCCGTGTACGAG-GAGAAATCCTACACAGATGGCAGACG TGAGAACCCTTGeGAGTTCAACAGAGGrrACAGGGACTACACACCmCTTCCAGTTGG C:T7iTGTTACCAAGGAGCTTGAGTilC:TTTCCTC5AGAC■CGACAAAGTGTGGATCmG■M, CGGTGAJmCCGAGGGAACCTTCATCGTGGACAGCGT.GGAGCTTCTCTTCATGGAGGA
MTTTGAGGGCTTTTTMrTGA:TAAGTATGTAGTACTAAAATGTA,rGCI1CTAATAG;
TCA丁AGTGAGCGAGCmAAGTATCGGGCTATTT iACTATGACTTGAGCTCCATCTJVTG AATAAATJmATCAGCATM'GATGCTTTTGTTTTGTGTACTTCAACTGTCTGCTTAGC TAATTTGAT ATGGTTGGCAC TTGIG CACGTATAAATATGCTGAACTAATTTACT CTG A A3C"I'AAATAACTAGATTAGATGAGTGTATTAmTAX:'AAAAGGOlTTAAA:rCMmTAC ATCTT船ACAAATTGTCACGGTCTACCAGJiiyiAGAAATTGCATTTGTTTTTGC5G'rCT TTCAGACTGACAAGATCGA了CTGAAGTC'rAAMmATTCTAAGAGC5'mTCATGTAGCA AT(3"TCCTGCCACAATATTC^ATTGACCTGCAGGCATGCAAGerGGGATCAGA-TAGTC GTTTCCCGCCTTC!ACTTTAAACTATCAGTGTTTGTTACCAAAAOTGCTGTCAATAAA CACTTAGAAAGC-TGTTA'fCCAAATT'rTAAAAAGAAAAAAA'TAAATGTAAGA'rrTAAA TTTCTAACTTCAAGAGATGCATTCAATTA CACCGCATTATATGATATTCCAAGAAT ACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGAGCCCTATA
参考文献
1. Cottage, A., Yang, A., Maunders, H.， de Lacy， R.C. and Ramsay, N.A. (2001) Identification of DNA sequences flanking T-DNA insertions by PCR-walking. Plant Molecular Biology Reporter 19:321-327.
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3. Kumar, A. P., Mandaokar, A" Sreenivasu， K.， Chakrabarti, S. K.， Bisaria, S. and Sharma， R. P. (1998) Insect-resistanttransgenic brinjal plants. Molecular Breeding 4:33-37.
4. Nicola， L.P., Valeria, B. and Leonardo, R. G. (1998) Regeneration of transgenic eggplants (Solanum melongena L) for a cysteine proteinase inhibitor. Capsicum and Eggplant Newsletter, 17:92-95.
5. Rotino, G. Land Gleddie, S, (1990) Transformation of Eggplant (Solanum melongena L.) using a binary Agrobacterium tumefaciens vector. Plant Cell Reports, 9:26-29.
权利要求
1. 一种检测样品中茄子植物EE-1原种事件核酸序列的存在的方法，其中所述方法包括(a)使样品与多核苷酸探针接触，其中所述多核苷酸包括源自SEQ ID NO8中示出的序列的核苷酸22位至核苷酸71位的至少50个连续的核苷酸；(b)将样品与所述多核苷酸探针置于严谨杂交条件下；和(c)检测在所述样品中所述多核苷酸探针至核酸的结合。
2. —种#r测样品中茄子植物E E -1原种事件核酸序列的存 在的方法，其中所述方法包括(a) 使样品与示于SEQ ID NO: 11中的第 一核苷酸序列和选 自由SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14组成的 组中的第二核苷酸序列接触；(b) 进行核酸扩增反应，从而产生扩增片段；和(c) 检测所述的扩增片段；其中，所述的扩增片段为约580碱基对或约1012碱基对或约 1211碱基对。
3. —种分离的多核苷酸，其用于检测茄子植物EE-1原种事 件，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 8中的核苷酸序列或 其互补序列组成。
4. 一种分离的多核苷酸，其用于检测茄子植物EE-1原种事 件，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 9中的核苷酸序列或 其互补序列组成。
5. —种分离的多核香酸，其用于检测茄子植物EE-1原种事 件，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: IO中的核苷酸序列或 其互补序列组成。
6. —种试剂盒，其用于使用杂交方法检测样品中茄子植物 EE-1原种事件核酸序列的存在，其中所述试剂盒包含示于SEQID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: IO中的多核苷酸序列或 其互补序列；和緩冲液。
7. —种试剂盒，其用于检测样品中茄子植物EE-l原种事件 核酸序列的存在，其中所述试剂盒包含具有示于SEQ ID NO: 11 中的序歹'J的第一核普酸和选自由SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14组成的组中的第二核苷酸序列。
8. —种合成寡核苷酸，其用于检测茄子植物EE-l原种事件 的存在，其中该寡核苷酸的序列选自由SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15组成 的组。
9. 一种转基因植物或种子，其具有茄子植物EE-l原种事 件，其中所述EE-l原种事件的基因组包含示于SEQIDNO: 8或 SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其互补序列。
10. —种转基因植物细胞，其具有茄子植物EE-l原种事件， 其中所述EE-l原种事件的基因组包含示于SEQ ID NO: 8或 SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其互补序列。
11. 一种具有茄子植物EE-1原种事件的后代，其中所述 EE-l原种事件的基因组包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10中的核普酸序列或其互补序列。
全文摘要
本发明涉及包含特异事件EE-1的抗虫转基因茄子(Solanummelongena，茄子)植物、植物细胞、种子及其后代。EE-1事件由表达苏云金杆菌的crylAc基因的构建体的单位点整合产生。另外，本发明提供了与茄子植物EE-1事件的插入位点侧翼相接的区域的DNA序列。其还涉及检测特异茄子植物EE-1事件存在或不存在的方法。本发明还提供了用于在转基因茄子植物中辨别上述特异茄子植物EE-1原种事件的诊断方法。本发明进一步提供了用于鉴定包含原种事件EE-1的转基因植物的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101421404SQ200780012769
公开日2009年4月29日 申请日期2007年2月9日 优先权日2006年2月10日
发明者拉格纳特·巴拉特·查尔, 波帕特拉·拉特那帕尔·甘地 申请人:马哈拉施特拉杂交种子有限公司