专利名称：：锦鲤疱疹病毒(khv)病用dna疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种DNA疫苗，该DNA疫苗用于i秀导锦鲤疱瘆病毒(Koiherpesvirus;KHV)对鱼类的感染症的防雄卩免疫。
背景技术：
：锦鲤疱渗病毒病是一种由于感染锦鲤疱瘆病毒(KHV)而在黑鲤鱼或锦鲤中发生的疾病，发病时行动变得緩慢，不再吃鱼食，但是显著的外部症状则比较少，能够看到鳃的褪色或糜烂(溃烂)等，由幼鱼到成鱼均有发生，是一种死亡率比较高的病。上述锦鲤疱瘆病毒病，最早是在1998年5月，在以色列发出了发病报告。之后，同样是在以色列，该年秋及翌年春2次发病，包含出口用鲤鱼在内的约600吨鲤鱼死亡。受损总额超过400万美元。之后，世界各国(以色列、英国、德国、荷兰、比利时、美国、印度尼西亚、台湾)等纷纷发出了发病报告。在我国，自2003年(平成15年)11月农林水产省发表报告确认茨城县霞浦疑似感染锦鲤疱疹病毒的鲤鱼以来，青森、山梨、三重、冈山、宫崎等各地均报发生锦鲤疱渗病毒病。农林水产省也正在进行以感染途径的确定为首的、关于防止该疾病扩散的研究。关于细菌感染，虽然已经开发出若干鱼贝类用疫苗，但是对病毒性疾病或寄生性疾病有效的疫苗几乎没有什么开发，仅开发出了针对鲑鱼科鱼类的一部分及鲈鱼目虹彩病毒的疫苗(例如，参照专利文献l)。在病毒感染症的预防或治疗中，通常使用疫苗。疫苗有非活化疫苗(曰本脑炎、韦尔氏病等)、类毒素(破伤风、白喉等)、减毒疫苗(BCG、脊髓灰质炎等)、基因重组疫苗(B型肝炎病毒等)等。使得非活化疫苗及外毒素无毒化的类毒素，是诱导针对这些的抗体的比较安全的疫苗。基因重组疫苗与非活化疫苗相比，因为不含有杂质，因此被认为是更为安全的疫苗。此外，目前在我国作为水产用疫苗，获得允许的仅有弧菌病非活化疫苗、a溶血性链球菌症非活化疫苗、虹彩病毒感染症非活化疫苗、P溶。但是，这些疫苗虽然能够诱导产生抗体，却存在难于诱导细胞免疫的缺点。此外，非活化疫苗及减毒疫苗，需要以工业化方式大量获得作为抗原的病毒，必须确保适当的细胞。而且，通过减毒疫苗获得的免疫效果，大多能够长期维持，但是另一方面，又被指出有副作用、危险性。非活化疫苗及基因重组疫苗，被认为在宿主内抗原的持续性短，需要辅药等。这些现有的疫苗，从制造到接种到受试体为止的期间，需要冷藏保存，因此存在成本增加和效力降低的问题。最近，疫苗的研究开发有所推进，开发出一种新的疫苗种(DNA疫苗)，该疫苗种通过给予对免疫原性蛋白质进行编码的质粒DNA而带来免疫诱导，由此，如下所述的现有疫苗的缺点得到了改善。即DNA疫苗具备如下优点不仅能够诱导体液免疫应答，而且能够强力地诱导细胞免疫，因此，能够赋予针对感染症的防御能力；此外，能够高度纯化；即使在室温或者高温下都稳定，不需要冷藏保存就能够长期储存；通过基因工程学的手段，能够容易地对DNA疫苗进行迅速改良；且能够缩短疫苗开发所需时间等。例如，关于通过月几肉注射编码弹状病毒(Rhabdovirus)的组成蛋白的糖蛋白的基因来刺激虹鳟的免疫应答(例如，参照非专利文献1。)和DNA疫苗(例如，参照非专利文献2。)已经有报道。此外，也提出了如下内容等，即一种针对比目鱼的病毒性出血性败血症的DNA疫苗(例如，参照专利文献2。)；一种针对病毒的DNA疫苗(例如，参照专利文献3。)，其中该病毒对传染性造血器官坏死症UHN)病毒的凋亡诱导蛋白进行编码；一种养殖种用DNA疫苗(例如，参照专利文献4。)，其中该疫苗使用了可诱导免疫原性多肽的表达的基因表达体系。但是，用于刺激对鲤鱼锦鲤疱瘆病毒病的防御免疫的DNA疫苗，一直没有提出。专利文献l:特开平9-176043号公报专利文献2:特开2005-112726号公才艮专利文献3:特开2002-125674号公报专利文献4:特开平9-285291号公报非专利文献l:P.Boudinotet.al，Virology,(USA)，1998,Vol.249，p.297-306非专利文献2:McLauchlanet.al,FishandShelIfishImmunology,England,2003，Vol.15，p.39-50
发明内容本发明的课题在于提供一种鲤鱼用DNA疫苗，该鲤鱼用DNA疫苗用于诱导对锦鲤疱疹病毒(KHV)病的防御免疫。本发明的发明人为了开发出对锦鲤疱瘠病毒(KHV)病有效的.疫苗，进行了锐意研究，确定了日本、美国、以色列、印度尼西亚的各锦鲤疱渗病毒(KHV)基因DNA的全碱基序列，从约180个基因中，选择出对锦鲤疱渗病毒(KHV)的糖蛋白进行编码的5种基因和对膜蛋白进行编码的5种基因，将装配了这些基因的质粒DNA接种(肌肉注射)到鲤鱼上之后，发现其对于鲤鱼的锦鲤疱渗病毒(KHV)具备免疫效果，乂人而完成了本发明。即本发明涉及(1)一种对如下(a)、(b)或(c)的蛋白质进行编码的DNA,(a)包含序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列的锦鲤疱疹病毒(KHV)的糖蛋白、(b)包含序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列中1个或者数个氨基酸缺失、取代或者添加而成的氨基酸序列，且对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质、或者(c)包含与序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列具有至少80%以上的同源性的氨基酸序列，且对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质；(2)—种包含序列号1、3、5、7或9所示碱基序列或其互补序列的DNA;(3)—种DNA,该DNA包含序列号1、3、5、7或9所示石威基序列中l个或数个碱基缺失、取代或者添加而成的碱基序列、且编码对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质；(4)一种DNA,该DNA在严格条件下和包含与序列号1、3、5、7或9所示碱基序列互补的序列的DNA进行杂交，且编码对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质；(5)—种对如下(d)、(e)或(f)的蛋白质进行编码的DNA,(d)包含序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列的锦鲤疱疹病毒(KHV)的膜蛋白；6(e)包含序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列中1个或者数个氨基酸缺失、取代或者添加而成的氨基酸序列，且对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质；或者(f)包含与序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列具有至少80。/。以上的同源性的氨基酸序列，且对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质。另外，本发明涉及(6)—种包含序列号11、13、15、17或19所示碱基序列或其互补序列的DNA;(7)—种DNA，该DNA包含序列号ll、13、15、17或19所示,咸基序列中1个或数个石威基缺失、取代或添加而成的石咸基序列，且编码对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性；(8)—种DNA，该DNA在严格条件下和包含与序列号11、13、15、17或19所示石威基序列互补的序列的DNA进行杂交，且编码对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质；(9)一种包含序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列的锦鲤疱疹病毒(KHV)的糖蛋白；(10)—种包含序列号2、4、6、8或IO所示氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加而成的氨基酸序列，且对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质；(11)一种包含序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列的锦鲤疱渗病毒(KHV)的膜蛋白；(12)—种包含序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列中1个或者数个氨基酸缺失、取代或者添加而成的氨基酸序列，且对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质。进而，本发明涉及(13)—种包含从上述(1)~(8)中任一项所述DNA中选出的1种或2种以上DNA的重组载体；(14)一种包含从上述(1)~(8)中任一项所述DNA中选出的1种或2种以上DNA的鲤鱼用DNA疫苗；(15)—种包含上述(13)所述重组载体的鲤鱼用DNA疫苗；(16)—种锦鲤疱渗病毒(KHV)病的预防或治疗方法，其特征在于向鲤鱼进;f亍上述(l4)或(I"所述鲤鱼用DNA疫苗的给药；(17)—种将上述(14)或(15)所述鲤鱼用DNA疫苗用于诱发对鲤鱼的锦鲤疱渗病毒(KHV)病的免疫应答的方法；(18)—种抗体，其特征在于特异性识别上述(9)~(12)中任一项所述蛋白质；(19)一种对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有抵抗性的转基因鲤鱼，其特征在于其通过基因导入上述(9)~(12)中任一项所述蛋白质的基因表达载体而得到。图1显示针对KHV感染症使用DNA疫苗的试验结果的图。(A)分别进行5种糖蛋白基因给药情况下的试验结果，(B)分别进行3种膜蛋白基因给药情况下的试验结果。图2显示针对KHV感染症使用DNA混合疫苗的试^r结果的图。纵轴表示累计死亡率，横轴表示KHV感染后的天数。组l表示阴性对照试验区，组2表示膜蛋白试验区，组3表示糖蛋白试验区。具体实施例方式本发明中的DNA，只要是如下DNA即可，没有特殊限制。即(a)对包含序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列的锦鲤疱疹病毒(KHV)的糖蛋白进行编码的DNA、(b)对蛋白质进行编码的DNA,其中该蛋白质包含序列号2、4、6、8或IO所示氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加而成的氨基酸序列，且对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性、(c)对蛋白质进行编码的DNA，其中该蛋白质包含与序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列具有至少80%以上的同源性的氨基酸序列，且对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性；包含序列号l、3、5、7或9所示碱基序列或其互补序列的DNA;—种DNA，该DNA包含序列号1、3、5、7或9所示碱基序列中1个或数个碱基缺失、取代或者添加而成的碱基序列，且编码对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质；一种DNA,该DNA在严格条件下和包含与序列号1、3、5、7或9所示碱基序列互补的序列的DNA进行杂交，且编码对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质、(d)对包含序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列的锦鲤疱渗病毒(KHV)的膜蛋白进行编码的DNA、(e)对蛋白质进^f亍编码的DNA,其中该蛋白质包含序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列中1个或者数个氨基酸缺失、取代或者添加而成的氨基酸序列，且对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性、(f)对蛋白质进行编码的DNA，其中该蛋白质包含与序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列具有至少80%以上的同源性的氨基酸序列，且对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性；包含序列号ll、13、15、17或19所示石烕基序列或其互补序列的DNA;—种DNA,该DNA包含序列号ll、13、15、17或19所示碱基序列中l个或数个碱基缺失、取代或添加而成的碱基序列，且编码对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质；一种DNA，该DNA在严才各条件下和包含与序列号11、13、15、17或19所示碱基序列互补的序列的DNA进行杂交，且编码对锦鲤疱渗病毒UHV)具有免疫原性的蛋白质。另外，本发明中的蛋白质，只要是如下蛋白质即可，并无特殊限制。即包含序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列的锦鲤疱渗病毒(KHV)的糖蛋白；或者包含序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列中1个或者数个氨基酸缺失、取代或者添加而成的氨基酸序列，且对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质；或者包含序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列的锦鲤疱疹病毒(KHV)的膜蛋白；或者包含序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列中1个或者数个氨基酸缺失、取代或者添加而成的氨基酸序列，且对锦鲤疱瘆病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质。在本发明中，对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质是指在进入鲤鱼生物体内的情况下能够在生物体内刺激、诱导对锦鲤疱渗病毒(KHV)的免疫应答(包括体液免疫应答及细胞免疫应答)的蛋白质。上述"1个或数个氨基酸缺失、取代或添加而成的氨基酸序列"是指例如1~20个，优选1~15个，更为优选1~10个、进一步优选1~5个的任意数目的氨基酸缺失、取代或添加而成的氨基酸序列。此外，上述"1个或数个碱基缺失、取代或添加而成的碱基序列"是指例如120个，优选1~15个，更为优选1~10个、进一步优选1~5个的任意数目的碱基缺失、取代或添加而成的石威基序列。例如，这些包含1个或数个碱基缺失、取代或添加而成的碱基序列的DNA(变异DNA),也可通过化学合成、基因工程学方法、突然变异诱发等9本领域普通技术人员已知的任意方法进行制备。具体而言，针对包含序列号l、3、5、7或9所示碱基序列的DNA、或者包含序列号ll、13、15、17或19所示碱基序列的DNA,利用与作为变异原的药剂接触作用的方法、照射紫外线的方法、基因工程学的方法等，通过向这些DNA导入变异，能够获得变异DNA。作为基因工程学方法之一的部位特异性变异诱发法，由于是能够在特定位置导入特定变异的方法，所以是有效的，可依照MolecularCloning:ALaboratoryMannual,3rdEd.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY.,2001.(以下简称为"MolecularCloning第3版，，)、CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement1~38,JohnWiley&Sons(1987-1997)等记载的方法进行。通过利用适当的表达体系对该变异DNA进行表达，能够得到包含1个或数个氨基酸缺失、取代或添加而成的氨基酸序列的蛋白质。上述"在严格条件下进行杂交的碱基序列"是指使用DNA或者RNA等的核酸作为探针，利用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或者DNA印迹(Southernblot)杂交法等而得到的碱基序列，具体而言，是釆用源于菌落或者噬菌斑的DNA、或将该DNA的片段固定化后的过滤器，在O.7~1.OM的NaCl存在的条件下，65。C下进行杂交后，使用0.1~2倍左右的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)，在65。C条件下通过洗涤过滤器，可提高能够鉴定出的DNA。杂交可依照MolecularCloning第3版等记载的方法进行。即严格条件下是指形成所谓的特异性杂交、而不形成非特异性杂交的条件。具体可以举出具有50~70%以上的同源性的DNA彼此之间进行杂交、而与其相比同源性低的DNA彼此之间不杂交的条件，或者作为通常的DNA印迹杂交法的洗涤条件，在相当于65。C、lxSSC、0.1%SDS、或者O.lxSSC、0.1%SDS的盐浓度下进行杂交的条件。例如，作为可以在严格条件下进行杂交的DNA,可以举出作为探针使用的DNA的碱基序列和具有一定以上的同源性的DNA,例如可举出具有60%以上，优选70%以上，更优选80%以上，进一步优选90%以上，尤其优选95%以上，最优选98%以上的同源性的DNA。本发明中的DNA的获得方法或制备方法，并无特殊限制，可基于本说明书中7>开的序列号1、3、5、7或9、或者11、13、15、17或19所示碱基序列信息，或者序列号2、4、6、8或10、或者12、14、16、18或20所示氨基酸序列所表示的氨基酸序列信息，制备适当的探针或引物，使用这些，通过对锦鲤疱渗病毒(KHV)的DNA文库进行筛选，由此分离出目标基因，可通过常规方法，采用化学合成制备得到。本发明中的蛋白质的获得方法或制备方法，并无特殊限制，使用来自天然的蛋白质、化学合成的蛋白质，利用基因重组技术制备得到的重组蛋白质均可。在获得来自天然的蛋白质时，通过适当组合蛋白质的分离、纯化方法，能够从表达这样的蛋白质的细胞或者组织中获得本发明的蛋白质。利用化学合成制备蛋白质时，可根据例如Fmoc法(訪甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法合成本发明的蛋白质。此外，也可以利用各种市售的肽合成机合成本发明的蛋白质。利用基因重组技术制备蛋白质时，可以将包含对该蛋白质进行编码的碱基序列的DNA导入适当的表达体系，由此制备得到本发明的蛋白质。其中，优选采用操作比较容易、且能够进行大量制备的基因重组技术进行制备。例如，通过基因重组技术制备本发明的蛋白质时，为了从细胞培养物中将这样的蛋白质回收纯化，采用包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石层析法及凝集素色谱法在内的公知方法，优选采用高速液体色谱法。尤其是用于亲和色谱法的色谱柱，通过例如使用结合了针对本发明蛋白质的单克隆抗体等抗体的色谱柱，或者在向上述本发明的蛋白质添加通常的标签肽(peptidetag)时，使用在该标签肽上结合了具备亲和性物质的色谱柱，能够得到这些蛋白质的纯化物。此外，在细胞膜表达本发明的蛋白质时，使细胞膜分解酶作用后，通过上述纯化处理，能够得到纯化的试样。进而，包含序列号2、4、6、8或10、或者序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或者添加而成的氨基酸序列的蛋白质，或者包含与序列号2所示氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质，只要是本领域的普通技术人员，就能够根据分别表示对序列号2、4、6、8或10、或者序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列进行编码的碱基序列的1例的序列号1、3、5、7或9、或者序列号ll、13、15、17或19所示碱基序列的信息，适当地制备或者获得。本发明中的重组载体，只要是包含上述本发明的基因DNA、且能够在ii鲤鱼的生物体内对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质进行表达的重组载体即可，没有特殊的限制，本发明的重组载体，可以通过将本发明的基因DNA适当整合到表达载体中而构建得到。作为表达载体，优选为能够在宿主细胞中自主复制的物质、或者能够装配到宿主细胞的染色体中的物质，此外优选使用在能够表达本发明的基因的位置上含有启动子、增强子、终止子等控制序列的物质。作为表达载体，优选使用了动物细胞用表达载体、尤其是使用了鱼类细胞用表达载体的重组载体。可用于本发明的表达载体的构建的步骤及方法，可以使用基因工程学领域惯用的步骤及方法。作为可在本发明中使用的控制序列，可举出组成型启动子、诱导型或者可变启动子、组织特异性启动子、或者来自于表达的抗原的基因的启动子等，只要是能够在鱼类的细胞内进行表达的即可，没有特殊限制。作为组成型启动子，可举出来自于巨细胞病毒(CMV)的启动子序列、或者劳斯肉瘤病毒(RSV)、猿猴病毒-40(SV-40)、肌肉p-肌动蛋白启动子或者单纯疱療病毒(HSV)等强启动子等。作为组织特异性启动子，可举出例如胸苷激酶启动子等。作为诱导型或者可变启动子，可举出例如生长荷尔蒙调控型启动子、在乳糖操纵子序列调控下的启动子、或者锌诱导型金属硫蛋白启动子。上述转录调控序列能够在编码免疫原性多肽的核苷酸序列上以可操作的方式(即以能够调节上述核苷酸序列的表达的方式)结合。上述控制序列，可以包含含启动子(例如上述诱导型或组成型启动子)DNA序列的表达控制序列，根据要求，还可以包含下述物质中的一个或者一个以上增强子因子、在用于转录或多聚腺苷酸化信号[例如来自于猿猴病毒-40(SV-40)或者来源于牛体生长荷尔蒙]的剪接的内含子序列、或者作为CpG基序而公知的免疫刺激DNA序列。此外，表达载体可根据要求，包含例如细菌复制起点序列、或者用于选出的抗生物质耐性(例如卡那霉素等)基因或非抗生物质耐性基因(例如，|3-半乳糖基因等)等的选择性标记。本发明中的鲤鱼用DNA疫苗，只要是包含从上述本发明的DNA中选出的1种或2种以上的DNA的组合物、或者包含上述本发明的重组载体的组合物即可，没有特殊限制。但是优选包含序列号l、3、5、7及9所示碱基序列的5种DNA的混合液、或包含序列号ll、13、15、17及19所示石威基序列的5种DNA的混合液、这10种DNA的混合液、或能够表达这些DNA混合液的重组载体。另外，可以向本发明的鲤鱼用DNA疫苗中添加、配合辅药。辅药是用于刺激免疫系统提高对抗原的免疫反应的物质，主要是作为辅助剂添加到疫苗中。代表性的辅药，有例如铝化合物、多核普酸或者细菌的菌体成分等，但是优选举例给出鲤鱼IL-1(3或ZEBRAIFN-a等，这些以可在鲤鱼的体内表达的方式制备出插入了IL-1P基因或ZEBRAIFN-a基因的质粒，能够和本发明的疫苗一起接种到鱼类上。通过对鲤鱼进行本发明的鲤鱼用DNA疫苗的给药，能够诱发针对鲤鱼的锦鲤疱瘆病毒(KHV)病的免疫应答，可以对锦鲤疱渗病毒(KHV)病进行预防或治疗。作为可适用本发明的鲤鱼用DNA疫苗的鱼类，只要是有可能感染锦鲤疱渗病毒UHV)病的鱼类即可，并无特殊限制，例如可具体举出黑鲤鱼或锦鲤。作为特异性结合在本发明的蛋白质上的抗体，可具体给出单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合体抗体、单链抗体、人化抗体等的免疫特异性的抗体，这些可利用上述糖蛋白或膜蛋白作为抗原，依照常规方法制备得到。其中，单克隆抗体从其特异性方面出发较为优选。这样的单克隆抗体等，是在本发明的蛋白质上特异性结合的抗体，其在本发明的蛋白质的分离、定量、或明确本发明的蛋白质的分子机构方面，是有用的。针对本发明蛋白质的抗体，采用惯用的操作规程，通过在动物(优选除人以外)上给予包含该蛋白质或者表位的片断、或者在膜表面表达该蛋白质的细胞而产生，例如，为了制备单克隆抗体，可以采用带来利用连续细胞系的培养物所产生的抗体的杂交瘤(Hybridoma)法(Nature256,495-497,1975)、三瘤体(trioma)法、人B细胞杂交瘤法(ImmunologyToday4，72,1983)及EBV-杂交瘤法(MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,pp.77—96，AlanR.Liss,Inc.,1985)等任意的方法。此外，通过在上述本发明的单克隆抗体等的抗体上，使用将例如FITC(荧光素异硫氰酸酯)或异硫氰酸四曱基玫瑰红等的荧光物质，或者mI、32P、"C、35S或311等的放射性同位素、碱性磷酸酶、过氧化物酶、(3-半乳糖苷酶或藻红素等的酶标记的物质，或者绿色荧光蛋白质(GFP)等的荧光发光蛋白质等融合而成的融合蛋白质，能够进行上述蛋白质的功能解析。此外，作为免疫学测定方法，可以举出RIA法、ELISA法、荧光抗体法、嗟菌斑(plaque)法、斑点(spot)法、血球凝集反应法、Ouchterlony法等的方法。作为对本发明的锦鲤疱渗病毒具有抵抗性的转基因鲤鱼类，只要是基因导入1种或2种以上的本发明蛋白质的基因表达载体而得到的转基因鲤鱼类即可，并无特殊限制，在鲤鱼类中构建导入l种或2种以上的本发明蛋白质基因的表达载体的情况下，优选制备连接到启动子下游的表达载体，其中该启动子能够有效地在鲤鱼类细胞内对本发明的蛋白质基因进行表达。作为这样的启动子，可举例给出凝集素启动子、脂肪细胞P2(aP2)启动子、Mylz2(Danioreriomyosinlightpolypeptide2skeletalmusclemylz2)启动子、UCP启动子、SV40启动子、巨细月包病毒启动子、EFlct启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子等，但是其中，青鏘|3-凝集素启动子、以及mylz2启动子从表达效率的观点出发优选使用。此外，为了稳定mRNA,优选在本发明的蛋白质基因的下游连接牛体生长荷尔蒙多聚腺苷酸化序列等的多聚腺苷酸化序列。此外，根据需要，也可以使用具备增强基因表达功能的内含子序列或增强子序列、用于命令转录终止的终止子序列。所构建的表达载体向鲤鱼类的导入，可以通过针对卵母细胞或者受精卵的显微注射法、病毒载体感染法、粒子枪法、电气穿孔法而进行。另夕卜，本发明的转基因鲤鱼类中，除包含导入了本发明的蛋白质基因的鲤鱼成体、其后代外，还可以根据需要包含鲤鱼受精卵细胞、鲤鱼胚细胞等。以下，通过实施例对本发明进4亍详细i兌明。本发明并不限于这些实施例。实施例1通过聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction:PCR)，对5种糖蛋白基因和5种膜蛋白基因从翻译起始密码子到翻译终止密码子为止进行了扩增，其中上述5种糖蛋白基因和5种膜蛋白基因编码在进行了基因组解析的、在日本、美国以及以色列分离出的KHV的基因组上。使用的引物组如表l所示。进行PCR时的DNA模板，使用在日本分离的KHV-J。PCR的条件为95。C下30秒、55。C下30秒、72°C下30秒为1个周期，进行30个周期。14[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>将PCR扩增DNA克隆化为基因表达载体pcDNA3.1,导入到大肠杆菌中。大量培养该转化大肠菌，萃取、纯化质粒DNA。质粒的纯化，通过使用氯化铯的超离心法(MolecularCloning第3版)进4亍。实施例2疫苗试验中，针对每l尾鲤鱼，使用注射器，将50jig的DNA与100jaL的磷酸緩冲液(phosphatebufferedsaline:PBS)—起，向鲤鱼的背部肌肉接种。此时，分别接种各种糖蛋白基因和膜蛋白基因。作为阴性对照，仅接种载体质粒DNA。接种疫苗后30天期间，在23。C下于循环过滤式水槽内培养。感染实验是在PBS中将KHV感染的鲤鱼鳃均质化，使用0.22pm过滤器进行过滤，将过滤后的液体，每l尾鲤鱼，接种100jiL。病毒液接种后，在23。C下将鲤鱼在循环过滤式水槽中培养。KHV感染后，连续观察鲤鱼12天，计算鲤鱼的累计死亡率，其结果如图1所示。试l全结果显示，对照区的鲤鱼为约50%的累计死亡率，而疫苗试验区的累计死亡率为约13~40%(糖蛋白)、14~40°/。(膜蛋白)，由此可知DNA疫苗对于MV感染的感染防御的有效性，即可明确得知疫苗效果。实施例3与上述方法相同，进行疫苗试验。此时，分别混合5种糖蛋白基因(组2)和5种膜蛋白基因(组3),进行接种。作为阴性对照，仅接种载体质粒DNA(组1)。接种疫苗后30天期间，在23。C下于循环过滤式水槽内培养。与上述同样地进行感染试验。KHV感染后，连续观察鲤鱼3周，计算鲤鱼的累计死亡率，其结果如图2所示。试验结果显示，对照区的鲤鱼为约60%的累计死亡率，而疫苗试验区的累计死亡率为约10~20°/。，由此可知DNA疫苗对于KHV感染的感染防御的有效性，即可明确得知疫苗效果。工业实用性使用本发明的鲤鱼用DNA疫苗，能够赋予针对锦鲤疱疹病毒(KHV)引起的锦鲤疱渗病毒病的免疫能力。进一步详细地说，使用本发明的鲤鱼用DNA疫苗，能够诱导针对锦鲤疱渗病毒病的免疫应答(包括体液免疫应答及细胞免疫应答)，因此，对于锦鲤疱疹病毒(KHV)感染的预防或者锦鲤疱渗病毒病的治疗有效。权利要求1.一种对如下(a)、(b)或(c)的蛋白质进行编码的DNA，(a)包含序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列的锦鲤疱疹病毒(KHV)的糖蛋白、(b)包含序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列中1个或者数个氨基酸缺失、取代或者添加而成的氨基酸序列，且对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质、或者(c)包含与序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列具有至少80％以上的同源性的氨基酸序列，且对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质。2.—种包含序列号1、3、5、7或9所示碱基序列或其互补序列的DNA。3.—种DNA,该DNA包含序列号1、3、5、7或9所示碱基序列中1个或数个名威基缺失、取代或者添加而成的碱基序列、且编码对锦鲤疱瘆病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质。4.一种DNA,该DNA在严格条件下和包含与序列号1、3、5、7或9所示碱基序列互补的序列的DNA进行杂交，且编码对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质。5.—种对如下(d)、(e)或(f)的蛋白质进行编码的DNA,(d)包含序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列的锦鲤疱疹病毒UHV)的膜蛋白；(e)包含序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列中1个或者数个氨基酸缺失、取代或者添加而成的氨基酸序列，且对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质；或者(f)包含与序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列具有至少80%以上的同源性的氨基酸序列，且对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质。6.—种包含序列号11、13、15、17或19所示石威基序列或其互补序列的DNA。7.—种DNA,该DNA包含序列号ll、13、15、17或19所示碱基序列中1个或数个碱基缺失、取代或添加而成的碱基序列，且编码对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质。8.—种DNA,该DNA在严格条件下和包含与序列号11、13、15、17或19所示石威基序列互补的序列的DNA进行杂交，且编码该蛋白质对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质。9.一种包含序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列的锦鲤疱渗病毒(KHV)的糖蛋白。10.—种包含序列号2、4、6、8或10所示氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加而成的氨基酸序列，且对锦鲤疱渗病毒(KHV).具有免疫原性的蛋白质。11.一种包含序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列的锦鲤疱疹病毒(KHV)的膜蛋白。12.—种包含序列号12、14、16、18或20所示氨基酸序列中1个或者数个氨基酸缺失、取代或者添加而成的氨基酸序列，且对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有免疫原性的蛋白质。13.—种包含从权利要求1~8中任一项所述DNA中选出的1种或2种以上DNA的重组载体。14.一种包含从权利要求1~8中任一项所述DNA中选出的1种或2种以上DNA的鲤鱼用DNA疫苗。15.—种包含权利要求13所述重组载体的鲤鱼用DNA疫苗。16.—种锦鲤疱渗病毒(KHV)病的预防或治疗方法，其特;f正在于，向鲤鱼进行权利要求14或15所述鲤鱼用DNA疫苗的给药。17.—种将权利要求14或15所述鲤鱼用DNA疫苗用于诱发对鲤鱼的锦鲤疱渗病毒(KHV)病的免疫应答的方法。18.—种抗体，其特征在于，特异性识别权利要求9~12中任一项所述的蛋白质。19.一种对锦鲤疱渗病毒(KHV)具有抵抗性的转基因鲤鱼，其特征在于，其通过基因导入权利要求9~12中任一项所述蛋白质的基因表达载体而得到。全文摘要本发明提供一种鱼类用DNA疫苗，该疫苗用于诱导针对鲤鱼的锦鲤疱疹病毒(KHV)病的防御免疫。上述DNA疫苗含有包含核苷酸序列的DNA、或者含上述DNA的表达载体作为有效成分，其中上述核苷酸序列编码针对鲤鱼的锦鲤疱疹病毒(KHV)的免疫原性多肽。文档编号C12N15/38GK101495636SQ20078001286公开日2009年7月29日申请日期2007年1月30日优先权日2006年4月13日发明者广野育生,青木宙申请人:国立大学法人东京海洋大学