核酸的制作方法

专利名称：：核酸的制作方法核酸本发明涉及来源于海生鞭孢簇虫(亦称海水派金虫，尸^h'ra^waWm/力的核酸，其编码9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶。所有这些编码序列都可转录为单一转录物，这简化了转化表达所有三种蛋白质所需细胞的方法。本发明还涉及各个编码序列和这些序列所编码的蛋白质以及将亚油酸转化成花生四烯酸的方法。脂肪酸和三酰甘油在食品工业、动物营养、化妆品和药理学方面都有多种用途。按照它们是否是游离饱和或不饱和脂肪酸或者是具有高含量饱和或不饱和脂肪酸的三酰甘油，它们适用于各种非常不同的用途。多不饱和脂肪酸例如亚油酸和亚麻酸是哺乳动物必不可少的，因为哺乳动物不能合成之。因此，多不饱和co3-脂肪酸和ca6-脂肪酸是动物和人类营养中的重要组分。在下文，多不饱和脂肪酸称为PUFA或LCPUFA(polyunsaturatedfattygcid，PUFA,!ong￡hain总oly且nsaturatedfatty汪cid,LCPUFA)。多种脂肪酸和甘油三酯主要得自微生物(例如被孢霉和裂殖壶菌)或产油植物(例如大豆、油菜)、藻类(例如隐曱藻或褐指藻)和其它来源，其中它们通常呈三酰甘油(=甘油三酯=三甘油酯)的形式。然而，它们也可得自动物，例如鱼类。通过水解可以方便地制备游离脂肪酸。油料作物并不合成非常长链的多不饱和脂肪酸例如二十二碳六烯酸(=DHA，C22:6M'7，10'13'16'19)、二十碳五烯酸(二EPA,C20:5A5'8'1U4，17)、花生四烯酸(二ARA，C20:4A5，8，1U4)、二高卞亚麻酸(C20:3A8"'")或二十二碳五烯酸(DPA,C22:5A7'1G，13，16'19)，所述油料作物例如油菜、大豆、向日葵或红花。这些脂肪酸的常规天然来源是鱼类(例如绅鱼、鲑鱼、沙丁鱼、红鲑鱼、鳗鱼、鲤鱼、鳟鱼、鲽鱼、鲭鱼、梭鲈或金枪鱼)或藻类。根据预期用途，优选含饱和或不饱和脂肪酸的油。在人类营养中，例如，优选含不饱和脂肪酸、尤其是多不饱和脂肪酸的脂质。据说，多不饱和0)3-脂肪酸对血液中胆固醇水平具有积极效果，因此可能对预防心脏病有效。在食物中添加这些co3-脂肪酸，可明显降低心脏病、中风或高血压的危险。而且，0)3-脂肪酸对炎症、尤其是与免疫性疾病有关的慢性炎症(例如类风湿性关节炎)进程具有积极效果。因此，可将其添加在食物、尤其是营养性食物中，或者用于药物。co6-脂肪酸(例如花生四烯酸)倾向于对与我们通常饮食摄入所致的这些风湿性疾病有关的疾病具有负面效果。Q)3-脂肪酸和co6-脂肪酸是组织激素的前体，称为类二十烷酸，例如前列腺素以及血栓烷和白三烯，其中前列腺素衍生自二高-y-亚麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸，而血栓烷和白三烯衍生自花生四烯酸和二十碳五烯酸。由①6-脂肪酸形成的类二十烷酸(称为PG2系歹寸)通常能促进炎症反应，而来自co3-脂肪酸的类二十烷酸(称为PG3系列)却没有或几乎没有促炎效果。因为多不饱和脂肪酸具有有利特性，所以过去一直在努力制备可用的基因，所述基因参与这些脂肪酸或甘油三酯的合成，用于在具有改良不饱和脂肪酸含量的各种生物中产生油。因此，WO91/13972及其美国等同专利说明书介绍了A9-去饱和酶。WO93/11245要求保护A15-去饱和酶，而WO94/11516要求保护A12-去饱和酶。更多的去饱和酶可参见例如EP-A-0550162、WO94/18337、WO97/30582、WO97/21340、WO95/18222、EP-A-0794250，Stukey等，J.Biol.Chem"265，1990:20144-20149，Wada等，Nature347，1990:200-203或Huang等，Lipids34，1999:649-659。然而，迄今为止，对各种去饱和酶的生化特性的了解尚不充分，因为酶是膜结合蛋白，在其分离和表征方面非常困难(McKeon等，MethodsinEnzymol.71,1981:12141-12147,Wang等，PlantPhysiol.Biochem.,26,1988:777-792)。通常，通过将膜结合去饱和酶引入合适生物体内，再通过分析原料和产物而分析酶活性，从而表征膜结合去饱和酶。A6-去饱和酶在以下文献中有描述WO93/06712、US5，614，393、US5614393、WO96/21022、WO00/21557和WO99/27111;而转基因生物产生脂肪酸的应用可参见WO98/46763、WO98/46764和WO98/46765。就这一方面而言，WO99/64616或WO98/46776也介绍和要求保护各种去饱和酶的表达和多不饱和脂肪酸的形成。有关去饱和酶表达功效及其对多不饱和脂肪酸形成的作用，必须注意，迄今为止，所述单一去饱和酶的表达仅产生少量不饱和脂肪l^/脂质，例如"亚麻酸和十八碳四烯酸。此外，通常可得到G)3-脂肪酸和co6-脂肪酸的混合物。用于生产PUFA的特别合适的微生物是微藻类，例如三角褐指藻(/Vzaeodac^/w/w^7.cor"i^wm)、^^求》莱(尸or//z/n'(i/wwspecies)、石皮嚢壶菌(rArawWoc/^fWwwspecies)、裂殖壶菌(*Sc/z/zoc/^^7'wmspecies)或隐曱藻(Oy//7ec0(^m'wmspecies);纤毛虫类，例浊口棘尾虫属(5^/o"yc/z/(3)或豆形虫属(Co/pWww);真菌类，例如被孢霉属(^/0^￡"//<3)、虫霉属(￡"towo//^ora)或毛霉属(Mwcor);和/或苔藓类，例如剑叶藓属(尸/zj^co附z7re〃a)、角齿藓属(Ceratocfo")和地4艮属(Afo/x/za""a)(R.Vazhappilly&F.Chen(1998)BotanicaMarina41:553-558;K.Totani&K.Oba(1987)Lipids22:1060-1062;M.Akimoto等(1998)Appl.BiochemistryandBiotechnology73:269-278)。株系的选择导致开发出大量的微生物突变林，所述株系产生一系列想要的化合物，包括PUFA。然而，改进特定分子(例如多不饱和脂肪酸)产量的林系的突变和选择是耗时而困难的。这也就是为什么在可能情况下会优选上述重组方法。然而，借助于上述微生物仅可产生有限量的所需多不饱和脂肪酸(例如DPA、EPA或ARA)，而且根据所用微生物的不同，通常得到的是EPA、DPA和ARA等的脂肪酸混合物。讨论了花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)合成的各种合成途径(图1)。因此，EPA或DHA是在海洋细菌中通过聚酮化合物途径产生的，例如弧菌(WZWosp.)或希瓦氏菌(幼ew朋e〃asp.)(Yu，R.等，Lipids35:1061-1064，2000;Takeyama，H.等,Microbiology143:2725-2731，1997)。一个替代策略是改变去饱和酶和延伸酶的活性(Zank,T.K.等，PlantJournal31:255-268,2002;Sakuradani,E.等，Gene238:445-453，1999)。对上述通过A6-去饱和酶、A6-延伸酶、A5-去饱和酶、A5-延伸酶和A4-去々包和酶途径的〗务饰是哺乳动物的Sprecher途径(Sprecher2000,Biochim.Biophys.Acta1486:219-231)。替代A4-去饱和的是，在此导致进一步延伸步骤，得到C24,接着再进行A6-去饱和和最终的卩-氧化，得到C22链长。因此，称为Sprecher的途径(参见图l)并不适合在植物和微生物中进行生产，因为调节机制尚不清楚。根据其去饱和方式的不同，可将多不饱和脂肪酸分为两大类，即co6-脂肪酸或co3-脂肪酸，这两者在代^射和功能活性上不同(图1)。0)6-代谢途径的原料是脂肪酸亚油酸(18:2^'12)，而①3-途径是通过亚麻酸(18:3"9，12'15)来进行。亚麻酸是由co3-去饱和酶活性而形成的(Tocher等，1998,Prog.LipidRes.37，73-117;Domergue等，2002,Eur.J.Biochem.269，4105-4113)。哺乳动物和人类都没有相应去饱和酶活性(A12-去饱和酶和0)3-去饱和酶)，而必须通过食物摄入这些脂肪酸(必需脂肪酸)。自这些前体开始，通过去饱和酶和延伸酶反应程序，合成生理上重要的多不饱和脂肪酸花生四烯酸^ARA,20:4"'8，11，14)、6-脂肪酸和两种co3-脂肪酸二十碳五烯酸(=EPA，20:5As'8，11，14，17)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6A4，7，iG,i3'n'i9)。应用①3—脂肪酸对治疗心血管疾病(shimikawa2001,WorldRev.Nutr.Diet.88,100-108)、Entztindungen(Calder2002,Proc.Nutr.Soc.61,345-358)和关节炎(Cleland和James2000，J.Rheumatol.27，2305-2307)具有上述治疗性活性。脂肪酸通过延伸酶以2个或4个碳原子方式延伸，分别对于C2(rPUFA和C22-PUFA的产生而言是至关重要的。该过程是通过4个步骤而进行的。第一步是通过酮脂酰-CoA合酶(KCS，在下文称为延伸酶)使丙二酰-CoA与脂肪酸-酰基-CoA缩合。这之后是还原步骤(酮脂酰-CoA还原酶，KCR)、脱水步骤(脱水酶)和最终的还原步骤(烯酰基-CoA还原酶)。假定延伸酶活性影响整个过程的特异性和速率(Millar和Kunst,1997PlantJournal12:121-131)。过去一直在努力工作以获取延伸酶基因。Millar和Kunst,1997(PlantJournal12:121國131)和Millar等，1999，(PlantCellU:825-838)介绍了植物延伸酶的表征，这些酶用于合成单不饱和长链脂肪酸(C22:1)和合成非常长链脂肪酸(用于形成植物蜡(C28-C32))。有关花生四烯酸和EPA合成的介绍可参见例如WO0159128、WO0012720、WO02077213和WO0208401。多不饱和(324-脂肪酸的合成可参见例如Tvrdik等，2000，JCB149:707-717或WO0244320。高等植物含有多不饱和脂肪酸，例如亚油酸(18:2化12)和亚麻酸(18:3A9'12，15)。ARA、EPA和DHA在高等植物的种子油中完全不含，或仅含极少量(E.Ucciani:NouveauDictionnairedesHuilesV6g6tales[NewDictionaryofVegetableOils].Technique&Documentation-Lavoisier,1995.ISBN:2-7430-0009-0)。然而，在高等植物、优选油料作物(例如油菜、亚麻籽、向日葵和大豆)中，LCPUFA的产量是很有利的，因为可以经济地获取大量高品质LCPUFA用于食品工业、动物营养和制药目的。为此，有利的是通过重组方法向油料作物中引入LCPUFA生物合成酶的基因并在其中表达这些基因。这些基因可编码例如A9-延伸酶、A8-去饱和酶和/或A5-去饱和酶。可以便利地从产生LCPUFA并将其结合在膜上或三酰甘油中的微生物和低等植物中获取这些基因。因此，已经可以从苔藓展叶剑叶藓(尸/z^ccw7z7re〃a;a&m)中分离A6-去饱和酶基因，并从展叶剑叶藓和线虫——秀丽新小杆线虫(Ce/ega"力中分离A6-延伸酶基因。含有和表达LCPUFA生物合成酶编码基因并且继而产生LCPUFA的第一种转基因植物首次描述于例如DE-A-10219203(在植物中产生多不饱和脂肪酸的方法)。然而，这些植物产生LCPUFA的数量需要进一步优化，以加工植物中存在的油类。如图1所示，使用合适的去饱和酶可修饰co6-途径的产物，并且在必要时使用延伸酶，得到co3脂肪酸。因此，在遗传修饰生物中开发可产生ARA的产物，将会是非常有价值的。牡蛎的原生动物寄生虫海生鞭孢簇虫CPwhVwi^wan'mw/)能通过△-8去饱和酶途径合成饱和及不饱和脂肪酸，包括必需脂肪酸花生四烯酸[20:4(n-6)。令人吃惊的是，本发明人发现海生鞭孢簇虫(尸.man'wim')含有A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶的编码核酸，其都转录为单一转录物。全长序列见SEQIDNO:1。因此，本发明第一方面，提供一种分离的核酸序列，其编码具有A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶活性的多肽并且其选自a)包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-12077或其同源物的核酸序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-12077的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶活性的多肽，其中所述多肽选自SEQIDNO:2、3和4;d)SEQIDNO:1核酸序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶活性。本发明核酸序列的优势是，尽管它编码3种不同的酶，但是它可转录为单一序列，这使得制备表达所有3种酶的克隆载体和表达载体简单得多。优选本发明的分离的核酸序列与SEQIDNo1(序列1047306867)本身不相同。就本发明而言，"在严格性条件下杂交"用于描述杂交和洗涤条件，在该条件下与另一序列具有至少60%同源性的核苦酸序列通常可以相互杂交。优选这样的条件使得与另一序列具有至少约65%、优选至少约70°/。、特别优选至少75%或更高同源性的序列通常能够相互杂交。这些严格性条件是技术人员已知的，可参见例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。优选的严格性杂交条件的非限制性实例是在以下条件下杂交6x氯化钠/柠檬酸钠^SSC),约45。C,接着在以下条件下进行一次或多次洗涤步骤0.2xSSC，0.1%SDS，50-65°C。技术人员知道，这些杂交条件因核酸种类不同而异，而且例如当存在有机溶剂时，与温度和緩沖液浓度有关。在"标准杂交条件"下，例如杂交温度根据核酸类型介于42。C和58。C之间，在含水緩冲液浓度为0.1-5xSSC(pH7.2)。如果有机溶剂，例如50%曱酰胺存在于上述緩冲液中，则标准条件下的温度为约42。C。DNA:DNA杂交的杂交条件，例如为O.lxSSC和20。C至45。C,优选30。C至45。C。DNA:RNA杂交的杂交条件为例如0.1xSSC和3(TC至55。C,优选45。C至55。C。举例来说，对于长度约100bp(-碱基对)、且G+C含量为50%的核酸，在不含曱酰胺的情况下，确定上述杂交条件。技术人员知道怎样根据上述教科书或例如以下教科书来决定所需杂交条件Sambrook等，"MolecularCloning",ColdSpringHarborLaboratory,1989;Hames和Higgins(编著)1985,"NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach",IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford;Brown(编著)1991,"EssentialMolecularBiology:APracticalApproach",IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford。此外，当本说明书涉及这样的核苷酸序列的分离的核酸分子其在严格性条件下与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3所示的核苷酸序列之一或其部分杂交，"其部分"的含义可理解为根据本发明，至少25碱基对(-bp)、50bp、75bp、100bp、125bp或150bp、优选至少175bp、200bp、225bp、250bp、275bp或300bp、特别优选350bp、400bp、450bp、500bp或更多石威基对用于杂交。就本发明而言，核酸序列与序列SEQIDNO:l的"同源物"是指例如与SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有至少约50%或60%、优选至少约60%或70%、更优选至少约70%或80°/。、90%或95%、甚至更优选至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性或同源性的等位变异体。"等位变异体"尤其包括功能变异体，其可通过目标序列的核苷酸缺失、插入或取代而得到，然而对于一个或多个基因的插入而言，所得合成蛋白质的酶活性可有利地保留下来"同源物"也指细菌、真菌和植物的同源物、截短序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA及其衍生物，例如启动子变异体。所述核苦酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸交换、插入和/或缺失来修饰，而没有对启动子功能性或活性造成不利影响。此外，启动子序列的》务饰还可提高其活性或者它们可#:更多活性启动子(包括来源于异源生物的启动子)完全取代。为了测定两个氨基酸序列的％同源性(=同一性)，将一个序列写在另一序列下面，用于优化比较(例如，可将空位引入蛋白质序列或核酸序列，以便得到与另一蛋白质或另一核酸的优化比对)。然后比4支相应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。如果序列中的某一位置被与另一序列相应位置上相同的氨基酸残基或相同的核苷酸占据，则分子在该位置上是同源的(即本文所用的氨基酸或核酸"同源性"相当于氨基酸或核酸"同一性")。两个序列间的％同源性^^列共享位置数的函数(即。/。同源性—目同位置銜位置总数x100)。因此，认为术语同源性和同一性是同义词。对整个氨基酸或核酸序列区计算同源性。技术人员可使用基于各种算法的一系列程序来进行各种序列的比较。在此，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman算法得到特别可靠的结果。程序PileUp(J.Mol.Evolution"25，351-360,1987,Higgins等，CABIOS，51989:151-153)或程序Gap和BestFit[Needl函n和Wunsch(J.Mol.Biol.48;443-453(1970)和Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981)]都是GCG软件包的组成部分[GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)]，都可用于序列比对。使用程序GAP和以下设定，对完整序列区测定在上文用百分率表示序列0gy值空位权重50，长度权重3，平均匹配10.000和平均错配0.000。除非另有说明，否则这些设置通常作为标准设置，用于序列比对。就本发明而言，"A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶活性"的含义可理解为与序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:1的核酸残基7668-12077所编码的蛋白质/酶相比，SEQIDNO:l或SEQIDNO:1的核酸残基7668-12077的衍生物所编码的蛋白质保留至少10°/。、优选20%、特别优选30%、非常特别优选40。/。的酶活性，因此可催化亚油酸转化为花生四烯酸。尽管通常将具有A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶活性的多肽的编码核酸转录为单一序列，但是在某些情况下优选使用编码单一酶(即A9-延伸酶、A8-去饱和酶或A5-去饱和酶)的核酸。因此，在本发明的第二方面中，提供一种分离的核酸序列，其编码具有A9-延伸酶活性的多肽并且其选自a)包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-9200、SEQIDNO:9或其中之一的同源物的序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的残基7668-9200或SEQIDNO:9的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A9-延伸酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:10;d)包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-9200或SEQIDNO:9的序列的^f汙生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:2或SEQIDNO:10具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶活性。在本发明的第三方面中，提供一种分离的核酸序列，其编码具有A8-去饱和酶活性的多肽并且其选自a)包含SEQIDNO:1的核酸残基9351-10724或其同源物的序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的残基9351-10724的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A8-去饱和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:3;d)包含SEQIDNO:1的核酸残基9351-10724的序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:3具有至少40°/。同一性；其中所述多肽具有A8-去饱和酶活性。在本发明的第四方面中，提供一种分离的核酸序列，其编码具有A5-去饱和酶活性的多肽并且其选自a)包含SEQIDNO:1的核酸残基10842-12077或其同源物的序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的残基10842-12077的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A5-去饱和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:4;d)包含SEQIDNO:1的核酸残基10842-12077的序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A5-去饱和酶活性。在本发明的再一方面，提供由本发明第一至第四方面中任一项的核酸序列所编码的多肽。有利的是，这些核酸分子所编码的多肽与SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:9所示的氨基酸序列具有至少约50%,优选至少约60%，更优选至少约70%、80%或卯％,最优选至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性。将该方法所用的核酸序列便利地引入表达盒，使得这些核酸在微生物或植物等生物中的表达成为可能。因此，在本发明的另一方面，提供基因构建体，该构建体包含编码一个或多个具有如上所述的A9-延伸酶、A8-去饱和酶和/或A5-去饱和酶活性的多肽的核酸序列，该核酸序列与一个或多个调节序列有效连接。在表达盒中，编码A9-延伸酶、A8-去饱和酶和/或A5-去饱和酶的核酸序列与一个或多个调节序列有效连接，便于增强基因表达。这些调节序列使特定基因和蛋白质的表达成为可能。根据宿主生物的不同，这意味着例如仅当发生基因引入之后，才会表达和/或过量表达该基因，或者立即表达和/或过量表达该基因。例如，这些调节序列呈现出这样的序列形式诱导物或阻遏物可与这样的序列形式结合，因而控制核酸的表达。除了这些新调节序列之外，或者替代这些序列，如果合适的话，在实际的结构基因经基因改造之前，这些序列的天然调节元件也可以存在，所述基因改造的方式消除了它们的天然调节，增强了基因表达。然而，表达盒(=表达构建体=基因构建体)在构建上也可以更简化，也就是说在核酸序列或其衍生物和具有其调节功能的天然启动子没有除去之前，不插入额外的调节信号。而天然调节序列的突变方式使得不再发生调节和/或增强了基因表达。这些修饰的启动子也可位于天然基因之前的它们本身的位置上，呈现部分-序列形式(=带有本发明所用的核酸序列部分的启动子)，以增强活性。此外，基因构建体还可有利地包含与启动子有效连接的一个或多个称为增强子序列的序列，使得核酸序列的表达增强成为可能。额外的有利序列，例如更多调节元件或终止子序列也可插入到DNA序列的3，端。也可存在一个或多个编码催化ARA转化为co3-不饱和脂肪酸(例如EPA或DHA)的酶的序列。因此，例如，编码A5-延伸酶、co3-去饱和酶和/或A4-去饱和酶的序列可存在于表达盒^基因构建体)的一个或多个拷贝中。优选每个表达盒中只存在一个拷贝的基因。这样的基因构建体可在宿主生物中一起表达。就这种情况而言，基因构建体可插入到一个或多个载体中并可以游离状态存在于细胞内，或者可插入到基因组内。对于更多基因插入到基因组而言，有利的是当有待表达的基因与一个基因构建体一起存在时。就这种情况而言，调节序列或调节因子可以如上所述地优选对所引入基因的基因表达具有正面效应，因而能增强它。因此，调节元件的增强作用(最好在转录水平上)可通过使用强转录信号(例如启动子和/或增强子)而发生。另外，然而，也可能通过例如提高mRNA的稳定性来增强转录。具体地讲，调节序列包括植物序列，例如启动子和终止子序列。在选择性条件下，构建体可在微生物(尤其是大肠杆菌(五.co")和根癌土壤杆菌(y^ra6"cfeW"mft/me/ac&ra))中稳定增殖，并能将异源DNA转入植物或微生物。有用的调节序列存在于例如启动子中，例如cos、tac、trp、tet、trp画tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、am、SP6、X-PR或X-PL启动子中，并且可有利地用于革兰氏阴性菌。更有利的调节序列例如存在于革兰氏阳性启动子amy和SP02中，存在于酵母或真菌的启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中，或存在于植物启动子CaMV/35S[Franck等，Cell21(1980)285-294]、PRP1[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或存在于泛蛋白或菜豆蛋白启动子中。就该情况而言，最好还有诱导型启动子，例如以下文献中描述的启动子EP-A-0388186(苯磺酰胺诱导型启动子)，PlantJ.2，1992:397-404(Gatz等，四环素诱导型启动子)，EP-A-0335528(脱落酸诱导型启动子)或WO93/21334(乙醇诱导型启动子或环己烯醇诱导型启动子)。更多合适的植物启动子是胞质FBPase启动子或马铃薯ST画LSI启动子(Stockhaus等，EMBOJ.8，1989，2445)、大豆(g/jc/"emax)磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶启动子(Genbank登录号U87999)或node特异性启动子(描述于EP-A-0249676)。特别有利的启动子是使在参与脂肪酸生物合成的组织中表达成为可能的启动子。非常特别有利的是种子特异性启动子，例如所述的USP启动子和其它启动子(例如LeB4、DC3、菜豆蛋白或油菜籽蛋白启动子)。更特别有利的启动子是种子特异性启动子，其可用于单子叶植物或双子叶植物，其描述于US5，608，152(油菜的油菜籽蛋白启动子)、W098/45461(拟南芥的油质蛋白启动子)、US5,504,200(菜豆(户/2ase0/wvw/gan'力的菜豆蛋白启动子)、WO91/13980(芸墨的Bce4启动子)、Baeumlein等，PlantJ.,2,2，1992:233-239(豆科植物的LeB4启动子)，这些启动子适用于双子叶#>物。适用于单子叶植物的启动子实例是大麦lpt-2或lpt-l启动子(WO95/15389和WO95/23230)、大麦的大麦醇溶蛋白启动子和其它合适的启动子(描述于WO99/16890)。从原则上说，可使用所有天然启动子以及它们的调节序列，例如上述那些。也可方便地使用合成启动子，无论是一起使用还是单独使用，尤其是当它们介导种子特异性表达时，例如WO99/16890中描述的那些。为了得到特别高的ARA含量，尤其是在转基因植物中，应当在油料作物中以种子特异性方式有利地表达所述基因。为此，可使用种子特异性启动子或在胚和/或胚乳中具有活性的启动子。从原则上说，种子特异性启动子既可从双子叶植物又可从单子叶植物中分离。优选的启动子列举如下USP(=未知种子蛋白)和豌豆球蛋白(蚕豆(F"/c/a/Wa))[Baumlein等，Mol.GenGenet"1991，225(3)]、油菜籽蛋白(油菜)[US5,608，152]、酰基载体蛋白(油菜)[US5,315,001和WO92/18634]、油质蛋白(拟南芥(JrahV/ojM/sAa"a朋))[WO98/45461和WO93/20216]、菜豆蛋白(菜豆)[US5,504,200]、Bce4[WO91/13980]、豆球蛋白B4(LegB4启动子)[B汪umlein等，PlantJ"2,2,1992]、Lpt2和lptl(大麦)[WO95/15389和WO95/23230],水稻、玉米和小麦的种子特异性启动子[WO99/16890]、Amy32b、Amy6-6和aleurain[US5,677,474]、Bce4(油菜)[US5，530，149]、大豆球蛋白(大豆)[EP571741]、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(大豆)[JP06/62870]、ADRUJ(大豆)[WO98/08962]、异柠檬酸裂合酶(油菜)[US5，689，040]或a-淀粉酶(大麦)[EP781849]。也可通过化学诱导型启动子促进植物基因表达(有关综述参见Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol"48:89-108)。化学诱导型启动子尤其合适，当希望基因表达以时间特异性方式发生时。这类启动子的实例是水杨酸诱导型启动子(WO95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等(1992)PlantJ.2,397-404)和乙醇诱导型启动子。为了确保生物合成基因在多次传代中稳定整合到转基因植物中，对于每个目标蛋白编码核酸而言，通常都必须在单独的启动子控制之下表达，优选所用启动子不同于其它启动子，因为重复序列基序可导致T-DNA不稳定或导致重组事件。这是本发明核酸之所以特别有利的一个原因，因为A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶的编码序列可作为单一单元而转录，仅需要一个启动子。当然，对于编码例如A5-延伸酶、co3-去饱和酶和/或A4-去饱和酶的其它基因而言，必须处于单独的启动子控制之下。在这种情况下，方便地构建表达盒，其方式使得启动子后面接合适的切割位点，最好在多聚接头中，用于插入有待表达的核酸，并且如果合适的话，将终止子序列放在多聚接头后面。该序列重复几次，优选3、4或5次，使得至多5个基因可结合在一个构建体中并导入转基因植物中，以便表达。有利的是，序列最多重复3次。为了表达核酸序列，通过例如多聚接头中的合适切割位点，将后者插入到启动子后面。有利的是，各核酸序列具有其各自的启动子，而且如果合适的话，其各自具有终止子序列。这样有利的构建体在例如以下文献中公开DE10102337或DE10102338。然而，也可以将多个核^列插入到启动子后面，而且如果合适的话，在终止子序列前面。在此，表达盒中插入核酸的插入位点或序列并非至关重要，也就是说，核酸序列可插入在表达盒的第一个或最后一个位置上，而其表达基本不受影响。有利的是，在表达盒中可使用不同启动子(例如USP、LegB4或DC3启动子)和不同终止子序列。然而，在表达盒中也可只用一种类型的启动子。但是，这可能导致不想要的重组事件。如上所述，最好应当由合适的终止子序列在所导入的生物合成基因的3'端(在终止密码子后面)终止所导入基因的转录。用于这种情况的序列的实例是OCS1终止子序列。就启动子而言，不同终止子序列应当用于各自的基因。本发明的基因构建体也可包含选自以下的脂肪酸或脂质代谢的生物合成基因酰基-CoA去饱和酶、酰基-ACP[-酰基载体蛋白]去饱和酶、酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基-CoA:溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰基-辅酶A羧化酶、酰基-辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸乙炔酶(fattyacidacetylenase)、脂肪氧合酶、三酰甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶(allenoxidesynthase)、氬过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶和去饱和酶，例如A4-去饱和酶、A5-去饱和酶、A6-去饱和酶、A8-去饱和酶、A9-去饱和酶、A12-去饱和酶或A6-延伸酶。可将这些额外核酸或基因克隆到表达盒中，然后借助于载体(例如土壤杆菌)，用于转化植物。在此，调节序列或调节因子可如上所述地优选对所^1入的表达基因具有正面效应，因而可增强表达基因。因此，通过使用强转录信号(例如启动子和/或增强子)可方便地在转录水平上发生调节元件的增强作用。然而，也可以通过例如提高mRNA的稳定性来增强翻译。原则上说，表达盒可直接用于引入植物或引入载体中。因此，在本发明的又一方面，提供包含本发明上述任一方面的核酸或基因构建体的栽体。在一个实施方案中，载体可以是克隆载体。本发明的核酸序列可单独引入，或优选与表达盒(核酸构建体)一起引入生物体内。为了引入核酸，可以用已知方法方便地扩增和连接后者。优选按照PfUDNA聚合酶或PfWTaqDNA聚合酶混合物方案所用的方法。选择引物时，考虑需要扩增的序列。应当方便地选择引物，其方式是扩增产物包含从起始密码子到终止密码子的完整密码基因股序列(codogenicsequence)。扩增后，方便地分析扩增产物。例如，可以进行凝胶电泳分离，再进行定量和定性分析。然后，按照标准方法(例如Qiagen)纯化扩增产物。等分的纯化扩增产物可用于其后的克隆步骤。合适的克隆载体是技术人员公知的。具体地讲，它们包括在微生物系统中能复制的载体，也就是说主要确保在酵母或真菌中有效克隆并可稳定转化植物的载体。特别要提到的载体是各种二元和共整合载体系统，它们适用于T-DNA介导的转化。原则上说，这类载体系统的特征在于，它们至少包含土壤杆菌介导的转化和T-DNA-边界序歹'J(T-DNA边界)所需的vir基因。这些载体系统最好还包含cis-调节区(例如启动子和终止子序列)和/或选择标记，这样的标记可用于鉴定适当转化的生物。尽管就共整合载体系统vir基因和T-DNA序列排列在同一载体上而言，二元系统基于至少两个载体，其中一个携带vir基因，但没有T-DNA,而第二个携带T-DNA，但没有vir基因。因为这个事实，最后提到的载体相当小，容易操纵并在大肠杆菌和土壤杆菌中都可复制。这些二元载体包括来自系列pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen的载体。根据本发明，优选使用Binl9、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。有关二元载体及其用途的概述可参见Hellens等，TrendsinPlantScience(2000)5，446-451。为了制备载体，可以先用限制性核酸内切酶将载体切为线状，再以合适方式酶促修饰。然后纯化载体，其等分试样用于克隆步骤。在克隆步骤中，将酶切后并纯化(如果合适的话)的扩增产物与用类似方式制备的载体片段使用连接酶克隆在一起。在这种情况下，特定的核酸构建体或载体或质粒构建体可具有一个或不止一个密码基因股基因区段。这些构建体中的密码基因股基因区段优选与调节序列有效连接。具体地讲，调节序列包括植物序列，例如上述启动子和终止子序列。在选择性条件下，构建体最好能在微生物(尤其是大肠杆菌和根癌土壤杆菌)中稳定增殖并将异源DNA转移至植物或微生物中。本发明的核酸可引入生物(例如微生物或最好是植物)中，最好使用克隆载体，并因而用于转化植物，所述植物例如以下文献中公开的和引用的那些PlantMolecularBiologyandBiotechnology(CRCPress,BocaRaton，Florida),第6/7章，第71-119页(1993);F.F.White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants;载于TransgenicPlants,第1巻,EngineeringandUtilization,Kung和R_.Wu编著，AcademicPress,1993，15-38;B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer,in:TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu编著，AcademicPress(1993)，128-143;Potrykus，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991),205-225。因此，所述方法所用的核酸、本发明的核酸和核酸构建体和/或载体可用于各种各样的生物(最好是植物)的重组修饰，使后者能更好和/或更有效地产生ARA。A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶蛋白质的修饰可能存在着一系列机制，使得这些修饰的蛋白质可以直接影响植物(优选油料作物或微生物)中ARA的产率、产量和/或生产效率。可增加蛋白质或基因的数量或活性，从而可以产生更多基因产物，最终产生更多通式I的化合物。在引入相应基因之前缺乏所述化合物生物合成活性和能力的生物中，也可以从头合成。这同样也用于更多去饱和酶或延伸酶或者更多脂肪酸和脂质代谢的酶的组合。在这种情况下，也可方便地使用各种分歧序列(即在DNA序列水平上不同的序列)，或使用启动子用于基因表达，这使得不同基因按照时间进程(例如随种子或贮油组织成熟度而进行)的表达成为可能。因为将A9-延伸酶、A8-去饱和酶和/或A5-去饱和酶的编码基因单独或与细胞中的其它基因一起引入生物中，所以不仅能增加朝向终端产物的生物合成通量，而且能增加或从头产生相应的三酰甘油组成。同样，可以增加参与营养输入(这些营养是一种或多种脂肪酸、油、极性和/或中性脂质的生物合成所必需)的其它基因的数量或活性，所以增加了这些前体、辅因子或中间体在细胞或贮存区室中的浓度，从而进一步提高了细胞产生如下所述的ARA的能力。通过优化参与ARA生物合成的A9-延伸酶、A8-去饱和酶和/或A5-去饱和酶的一个或多个编码基因的活性或增加其数量，或者通过破坏参与ARA降解的一个或多个基因的活性，可以提高植物的脂肪酸和脂质分子的产率、产量和/或生产效率。可以方便地用于本发明方法的核酸来源于细菌、真菌、硅藻类、动物(例如新小杆线虫(C"e"or/2a6Afe)或大麻p合鱼属("co^y"c/zws))或植物(例如藻类或苔藓类)，例如希瓦氏菌属(57^>^"6//力、剑叶藓属(尸/^cow/re〃a)、破嚢壶菌属(77zraw加c/z,/zw)、嫌孑包属(Fwsa尸/i/m)、疫霉属(尸一o/滅ora)、角齿藓属(Ceratoc/o")、Ma"to"/e〃"、O欲eococcws、等鞭金藻属(/soc/z，/s)、爿/ew7Ya、A/wsc'c^es、被孑包霉属(A/oWere〃a)、Borago、褐指藻属(尸/zaeot/ac^;/ww7)、隐曱藻属(C，决eco&"/,)，尤其是虹鳟((9"co/V^wc/2ws、非洲爪蟾(Xewopus/aev/力、玻璃海鞘(C7owa/她Wwafc)、假微型海链藻(772a/ow/os7,rajoyewcfowowa)、M"wtomW/as《wCa、(9欲eococcwssp.、Qs^eococcw/awn,、纤纟田净果条gracz7/s)、展叶剑叶薛(尸/z;^co附z7re〃a/ate"s)、致病疫審(尸/^fop/^onazV/^Wa"s)、禾本牙+镰孑包(Fksan.wwgra/m."aeww)、寇氏隐曱藻(Oy/tococZ/"/wwco/zw//)、角齿藓(Ceratodo"/wpwre—、绿光等鞭金藻(750。/7，&ga肠"a)、J/ewnYay^Wwasa、石皮嚢壶菌(772ra附toc/2,z,,sp.)、A/kscan'ozV/esWa〃"、高山爭皮孑包霉(A/oW^""/aa///"a)、琉璃苣(5orago。j^c/"afc)、三角褐指藻(尸/zaeoc/ac(y/wmfWcorwi^w附)、秀丽#斤小4干纟戋虫(Caewor/za6(iWse/ega"s)或者特别有利的是虹鳟(0"cor/^"c/7^wyhh)、纤细棵藻(五wg/e"agrac/to)、寸『支樣吏型海链藻(7Tza/ow/asz'rap"W(io"o"a)或寇氏隐曱藻在一个替代实施方案中，载体可以是设计用于转化生物的表达载体，其中表达核酸并将亚油酸转化为ARA。这些有利的载体(优选表达载体)包含A9-延伸酶、A8-去饱和酶和/或A5-去饱和酶的编码核酸，其在本发明的第一至第四方面有描述。本文所用的术语"载体"是指能转运它所结合的另一核酸的核酸分子。一类载体是"质粒"，是环状双链DNA环，其中连接有额外的DNA区段。另一类载体是病毒载体，它能够将额外DNA区段与病毒基因组连接。某些载体能够在导入它们的宿主细胞中自主复制(例如带有细菌复制起点的细菌载体)。其它载体当导入宿主细胞时，最好整合到宿主细胞基因组上并与宿主基因组一起复制。此外，某些载体可控制与之有效连接的基因的表达。这些载体在本文称为"表达载体"。通常，适用于DNA重组技术的表达载体呈质粒的形式。在本发明的描述中，当使用术语"质粒"时，应当理解，质粒可以被能发挥相似功能的其它类型的表达载体(例如病毒载体)替代。此外，术语"载体，，也包括技术人员熟悉的其它载体，例如噬菌体、病毒(例如SV40、CMV、TMV)、转座子、IS元件、质粒、粘粒、噬菌粒、线状或环状DNA。可方便地用于本发明方法的重组表达载体包括下述核酸或上述基因构建体，其形式适合于在宿主细胞中表达所用的核酸，也就是说，重组表达载体包含一个或多个调节序列，这些序列是根据用于表达的宿主细胞而选择的，这些调节序列与要表达的核酸有效连接。在重组表达载体中，"有效连接"是指目标核苷酸序列与调节序列的结合方式，这样的方式使核苷酸序列的表达成为可能，并且它们彼此结合的方式使这两个序列都可发挥序列本身的预期功能(例如在体外转录/翻译系统，或在宿主细胞中，如果载体引入宿主细胞的话)。术语"调节序列"包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。这些调节序列在以下文献中有描述例如Goeddel:GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，CA(1990)，或参见Gruber和Crosby,载于MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnolgy，CRCPress,BocaRaton,Florida,Glick和Thompson编著，第7章，89-108，包括其中引用的参考文献。调节序列包括在多种宿主细胞中控制核苷酸序列组成型表达的调节序列以及仅在特定宿主细胞中、在特定条件下控制核苷酸序列直接表达的调节序列。技术人员知道，可根据以下因素设计表达载体例如要转化的宿主细胞的选择、蛋白质的所需表达水平等。所用的重组表达载体可设计用于在原核细胞或真核细胞中表达A9-延伸酶、A8-去饱和酶和/或A5-去饱和酶。这是很有利的，因为为了简便的缘故，载体构建的中间步骤经常在微生物中进行。例如，A9-延伸酶、A8-去饱和酶和/或A5-去饱和酶的基因可以在以下细胞或生物中表达细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母和其它真菌纟田胞(参见Romanos，M.A.等(1992)"Foreigngeneexpressioninyeast:areview",Yeast8:423-488;vandenHondel,C.A.M丄J.等(1991)"Heterologousgeneexpressioninfilamentousfimgi",载于MoreGeneManipulationsinFungi，J.W.Bennet&L丄.Lasure编著，第396-428页AcademicPress:SanDiego;和vandenHondel，C.A.M丄J.，&Punt,P.J.(1991)"GenetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfUngi,载于AppliedMolecularGeneticsofFungi,Peberdy，J.F.等编著，第1-28页,CambridgeUniversityPress:Cambridge)、藻类(Falciatore等，1999,MarineBiotechnology.1,3:239-251)、纤毛虫类T/o/ofn'c/w'a、缘毛亚纲(尸eW/n'c/w,a)、旋毛亚纟冈(5^/ra^'c/z/a)、吸管亚纟冈(SwctoWa)、四膜虫属(7Wra/z;vwe"a)、草履虫属CParamecz'iwz)、豆形虫属(0///^//^)、瞬目虫属(G7awcowa)、匙口虫属(/Vayo//2^ya)、尸otomacw、Z)es^wnxsewdoco/zm7em6ws、游仆虫属(五w//ofey)、五"ge/wamW/a和棘尾虫属(5^/ow^c/h'")，尤其是5^/o"yc/7/a/em"ae,4吏用载体，采用WO98/01572所述的转化方法，优选在多细胞植物的细胞中(参见Schmidt,R.和Willmitzer，L.(1988)"HighefficiencyAgrobacteriumtumefaciens-mediatedTransformationofArabidopsisthalianaleafandcotyledonexplants"PlantCellRep.:583-586;PlantMolecularBiologyandBiotechnology,CPress,BocaRaton,Florida,第6/7章，第71-119页(1993);F.F.White,B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer载于TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu编著，AcademicPress(1993),128-43;Potrykus,Annu.Rev,PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)，205-225(和其中引用的参考文献))。合适的宿主细月包还可参见Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)。作为替代，可在体外转录和翻译重组表达载体，例如使用T7-启动子调节序列和T7-聚合酶。在大多数情况下，原核生物的蛋白质表达涉及使用载体，所述载体包含控制融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子。典型的融合表达载体尤其是pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，其中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖-E结合蛋白和蛋白A分别与重组靶蛋白融合。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例尤其是pTrc(Amann等，(1988)Gene69:301-315)和pETlid(Studier等，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(1990)60-89)。pTrc载体的靶基因表达基于通过宿主RNA聚合酶，自杂合trp-lac融合启动子进行转录。载体pETlid的靶基因表达基于T7-gnl0-lac融合启动子的转录，这是由共同表达的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介导的。该病毒聚合酶是由宿主菌林BL21(DE3)或HMS174(DE3)从驻留的X-原噬菌体提供的，其携带处于lacUV5启动子的转录控制之下的T7gnl基因。适用于原核生物的其它载体是技术人员已知的，这些载体是例如在大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系歹'J(例如pBR322)、pUC系歹'J(例如pUC18或pUC19)、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN画IIIl13-B1、Xgtll或pBdCI,在链霉菌中的pIJ101、pIJ364、p腦2或p腦l，在芽孢杆菌中的pUB110、pC194或pBD214，在棒状杆菌中的pSA77或pAJ667。在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。在酿酒酵母cs.ce"Ww'ae)中表达的载体实例包括pYeDesaturasecl(Baldari等(1987)EmboJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)Gene54:113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。适用于其它真菌(例如丝状真菌)的载体以及构建载体的方法详见文献vandenHondel，C.A.M.J丄,&Punt,P.J.(1991)"GenetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfUngi，载于AppliedMolecularGeneticsofflingi，J.F.Peberdy等编著，第1-28页，CambridgeUniversityPress:Cambridge或载于MoreGeneManipulationsinFungi[J.W.Bennet&L丄.Lasure编著，第396-428页AcademicPress:SanDiego]。更多合适的酵母载体是例如pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23。作为替代，使用杆状病毒载体，A9-延伸酶、A8-去饱和酶和/或A5-去饱和酶可以在昆虫细胞中表达。可用于在培养昆虫细胞(例如细胞)中表达蛋白质的杆状病毒表达载体包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.CellBiol..3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology170:31-39)。上述载体仅是可能的合适载体中的一小部分的概述。更多质粒是技术人员已知的，可参见例如载于CloningVectors(Pouwels,P.H.等编著，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444904018)。对于原核细胞和真核细胞中更多的合适表达系统而言，可参见Sambrook,J.,Fritsch，E,F.和Maniatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，第16和17章，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989。在本发明方法的另一个实施方案中，A9-延伸酶、A8-去饱和酶和/或A5-去饱和酶可在以下细胞中表达单细胞的植物细胞(例如藻类)(参见Falciatore等，1999,MarineBiotechnology1(3):239画251及其引用的参考文献)和高等植物(例如种子植物，例如适于耕作的作物)的植物细胞。植物表达载体的实例详见以下文献Becker,D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)"Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder",PlantMol.Biol.20:1195-1197;和Bev叫M.W.(1984)"BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation",Nucl.AcidsRes.12:8711-8721;VectorsforGeneTransferinHigherPlants;载于TransgenicePlants,第1巻，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu编著,AcademicPress,1993,第15-38页。植物表达盒优选包含调节序列，所述序列能控制基因在植物细胞中表达，并且与之有效连接，使得每个序列可完成其功能，例如转录终止，例如聚腺苷酸化信号。优选聚腺苷酸化信号是来源于根癌土壤杆菌T-DNA的信号，例如Ti质粒pTiACH5基因3(Gielen等，EMBOJ.3(1984)835etseq.)，它称为章鱼碱合酶或其功能等同物，但是在植物中具有功能活性的所有其它终止子序列也是合适的。因为植物基因表达并不经常限于转录水平，所以植物表达盒优选包含有效连接的其它序列，例如翻译增强子，例如超驱动(overdrive)序列，所述序列增强烟草花叶病毒5，-非翻译前导序列，这可提高蛋白质/RNA比例(Gallie等，1987，Nucl.AcidsResearch15:8693-8711)。如上所述，植物基因表达与合适的启动子有效连接，所述启动子在正确的时间或以细胞或组织特异性方式触发基因表达。可用的启动子是组成型启动子(Benfey等，EMBOJ.8(1989)2195-2202)，例如来源于植物病毒的启动子(例如35SCaMV(Franck等，Cell21(1980)285-294)、19SCaMV(另参见US5352605和WO84/02913))或植物启动子(例如Rubisco亚基启动子，参见US4,962,028)。用于有效连接在植物基因表达盒中的其它优选序列是打靶序列，这是引导基因产物进入其相应细胞区室所需的(有关综述参见Kermode，CritRev.PlantSci.15,4(1996)285-423及其中引用的参考文献)，所述区室例如液泡、核、所有类型的质体(例如造粉体、叶绿体、有色体)、细胞外间隙、线粒体、内质网、造油体、过氧化物酶体和其它的植物细月包区室。如上所述，植物基因表达也可由化学诱导型启动子启动(有关综述参见Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol"48:89-108)。当希望以时间特异性方式进行基因表达时，化学诱导型启动子特别合适。这类启动子的实例是水杨酸诱导型启动子(WO95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等(1992)PlantJ.2,397-404)和乙醇诱导型启动子。响应生物性或非生物性胁迫条件的启动子也是合适的，例如病原体诱导的PRPl基因启动子(Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、热诱导型番茄hsp80启动子(US5,187,267)、冷诱导型马铃薯a-淀粉酶启动子(WO96/12814)或创伤诱导型pinll启动子(EP-A-O375091)。特别优选的是在组织和器官中引起基因表达的启动子，其中在种子细胞(例如胚乳细胞和发育中的胚细胞)中进行脂肪酸、脂质和油的生物合成。合适的启动子是油菜的油菜籽蛋白启动子(US5,608,152)、蚕豆的USP启动子(Baeumlein等，MolGenGenet,1991，225(3):459-67)、拟南芥的油质蛋白启动子(WO98/45461)、菜豆的菜豆蛋白启动子(US5,504,200)、芸薹的Bce4启动子(WO91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4;Baeumlein等，1992,PlantJournal,2(2):233-9)和在单子叶植物植物(例如玉米、大麦、小麦、黑麦、水稻等)中引起种子特异性表达的启动子。合适的重要启动子是大麦lpt2或lptl基因启动子(WO95/15389和WO95/23230)或来自以下基因的启动子大麦的大麦醇溶蛋白基因、水稻的谷蛋白基因、水稻的水稻素(oryzin)基因、水稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因或黑麦的黑麦醇溶蛋白基因，参见WO99/16890。如上所述，表达盒中最好包含能够将ARA转化成w3-不饱和脂肪酸(例如EPA或DHA)的酶的编码核酸。因此，例如表达盒也可包含A5-延伸酶、co3-去饱和酶和/或A4-去饱和酶的编码核酸。可通过同时转化大量的单个表达构建体，或者优选通过将大量表达盒組合在一个构建体中，而引入这类表达盒。另外，在所有情况下，大量载体可以与大量表达盒一起转化并转移至宿主细胞中。同样特别合适的其它启动子是引起质体特异性表达的启动子，因为质体组成区室，其中合成前体和一些脂质生物合成的终端产物。合适的启动子例如病毒RNA聚合酶启动子可参见WO95/16783和WO97/06250，而来自拟南芥的clpP启动子可参见WO99/46394。通过常规转化或转染技术，可将载体DNA引入到原核细胞和真核细胞中。本文所用的术语"转化"和"转染"、接合和转导包括现有技术中已知的用于将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞的多种方法，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移、电穿孔或离子轰击。转化或转染宿主ALaboratoryManual.,第2版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)和其它实验室教科书，例如MethodsinMolecularBiology,1995,第44巻，Agrobacteriumprotocols,Gartland和Davey编著，HumanaPress,Totowa,NewJersey。在本发明的另一方面，提供转基因非人类生物，其包含至少一种本发明前述任一方面的核酸、基因构建体或载体。转基因非人类生物可以是微生物、非人类动物或植物。原则上适于引入本发明核酸、本发明基因产物或本发明载体的宿主细胞是所有的原核生物或真核生物。最方便使用的宿主生物是微生物(例如真菌或酵母)或植物细胞，优选植物或其组成部分。真菌、酵母或植物也优选使用，特别是植物，例如高脂质化合物的油料作物(例如白菜型油菜、月见草、大麻、大蓟、花生、甘兰型油菜(亦称双低油菜，canola)、亚麻籽、大豆、红花、向日葵、琉璃苣)或植物(例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、水稻、大麦、棉花、木薯、辣椒、万寿菊、茄科植物(例如马铃薯、烟草、茄子和番茄)、蚕豆、豌豆、苜蓿、灌木才直物(咖啡、可可、茶)、柳树(Salixspecies)、乔木(油棕、椰子)和多年生牧草和饲料作物。特别优选的本发明植物是油料作物，例如大豆、花生、白菜型油菜、甘兰型油菜、亚麻籽、大麻、月见草、向日葵、红花、乔木(油棕、椰子)。在一个有利的实施方案中，本文所用的术语"核酸(分子)"还包括在编码基因区3'端和5'端的非翻译序列编码区5'端上游的至少500、优选200、特别优选100个核苷酸的序列以及编码基因区3，端下游的至少100、优选50、特别优选20个核苦酸的序列。"分离的""分离的"核酸优选不含天然侧接其核酸来源生物基因组DNA中的核酸的序列(例如位于核酸5'端和3'端的序列)。在各种实施方案中，分离的A9-延伸酶、A8-去饱和酶或A5-去饱和酶分子可包含例如少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的天然侧接其核酸来源细胞基因组DNA中的核酸分子的核苷酸序列。这同样适用于包含在表达盒中的其它核酸序列，例如A5-延伸酶、①3-去饱和酶和/或A4-去饱和酶的编码序列。可用分子生物学标准技术和本文提供的序列信息，分离出本发明的核酸分子(例如具有SEQIDNO:1或其残基7668-12077或本发明第二至第四方面所述的部分SEQIDNO:1的核苷酸序列的核酸分子)。另外，借助于比较算法，可在DNA或氨基酸水平上鉴定出例如同源序列或同源的保守序列区。它们可用作杂交探针和标准杂交技术(例如参见Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual.第2版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)，用于分离更多可用于本发明方法的核酸序列。此外，可通过聚合酶链式反应，分离出来自海生鞭孢蔟虫并包含SEQIDNO:1完整序列或其部分的核酸分子，其中寡核苷酸引物基于该序列或其部分(例如通过聚合酶链式反应，使用基于该相同序列而产生寡核苷酸引物，可分离包含完整序列或其部分的核酸分子)。例如，可从细胞(例如通过硫氰酸胍提取法(Chirgwin等(1979)Biochemistry18:5294-5299))和cDNA(通过逆转录酶(例如MoloneyMLV逆转录酶(可得自Gibco/BRL,Bethesda,MD)或AMV逆转录酶(可得自SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg，FL))分离到mRNA。根据SEQIDNO:1所示序列之一或借助于SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的氨基酸序列，可产生用于聚合酴涟式反应扩增的合成寡核香酸引物。具体的合适引物见实施例中的SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。可通过标准PCR扩增技术，使用cDNA或者基因组DNA为模板(SEQIDNO9)并使用合适的寡核苷酸引物(SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)，扩增本发明的核酸。由此扩增的核酸可克隆到合适载体中，并通过DNA序列分析来表征。可通过标准合成方法，例如使用自动化DNA合成仪，产生去饱和酶或延伸酶核苷酸序列的相应寡核苷酸。上述核酸和具有A9-延伸酶、A8-去饱和酶和/或A5-去饱和酶活因此，在本发明的另一方面，提供在生物体内将亚油酸或其衍生物转化为花生四烯酸或其衍生物的方法，所述方法包括向含有亚油酸的生物中引入至少一个包含以下的核酸序列a)SEQIDNO:1(全序列1047306867)、包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-12077的序列或其中之一的同源物；b)在严格性条件下与SEQIDNO:1的核酸序列或包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-12077的序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶活性的多肽，其中所述多肽选自SEQIDNO:2、3和4;d)SEQIDNO:1的核酸序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶活性；并且表达所述核酸序列。就本发明而言，亚麻酸或花生四烯酸的"衍生物"是羧酸部分的OH被W部分置换的化合物，其中Ri为辅酶A(硫酯)、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血二磷脂酰甘油、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰肌醇、鞘碱(sphingobase)或下式II的基团<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>其中R2=氬、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血二磷脂酰甘油、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰肌醇或饱和或不饱和C2-C24-烷基羰基，R3=氢、饱和或不饱和(:2《24-烷基羰基，或者f和R"皮此独立地为下式Ia的基团<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>n=2、3、4、5、6、7或9,m=2、3、4、5或6，p-0或3;并且其中R1基团中的氧可以被硫置换，使得R1通过硫酯键与该分子的剩余部分连接。本发明的方法优选得到总ARA含量为转基因生物(优选转基因植物)的总脂肪酸重量的至少1%，最好至少3%。因为在本发明的方法中，自原料化合物亚油酸(18:2"'12)进行了大量反应步骤，所以没有得到纯品ARA(20:4A5，8，11，14》极少量前体通常存在于终产物中。也可通过上述方法合成化学纯的ARA。为此，按照已知方法(例如通过提取、蒸馏、结晶、色谱或这些方法的组合)，从生物例如微生物或植物或生物生长的培养基，或从生物和培养基中分离出ARA或其衍生物。这些化学ARA或ARA衍生物最好用于食品工业、化妆品工业，尤其是制药工业。本发明方法可包括将ARA转化为co-3脂肪酸的额外步骤，即通过将co-3去饱和酶和任选A5-延伸酶和/或A4-延伸酶和/或A4-去饱和酶的编码核酸《1入生物中。在本发明的另一方面包括将18:2A9，12(亚油酸)转化为20:2A"'"的方法，所述方法包括向含有亚油酸的生物中引入至少一种编码具有A9-延伸酶活性的多肽的核酸序列并且所述核酸序列包含a)包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-9200、SEQIDNO:9或其中之一的同源物的序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的残基7668-9200或SEQIDNO:9的核^列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A9-延伸酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:10;d)包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-9200或SEQIDNO:9的序列的^f汙生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:2或SEQIDNO:10具有至少40°/。同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶活性；并且表达所述核酸序列。在本发明的另一方面，提供将20:2A"'"转化为20:3AS'"'"的方法，所述方法包括向含有20:2An'"的生物或含有亚油酸和A9延伸酶的生物中引入一种分离的核酸序列，其编码具有A8-去饱和酶活性的多肽并且所述核酸序列选自a)包含SEQIDNO:1的核酸残基9351-l(T724或其同源物的序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的残基9351-10724的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A8-去饱和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:3;d)包含SEQIDNO:1的核酸残基9351-10724的序列的书于生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:3具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A8-去^^包和酶活性；和表达所述核酸序列。在本发明的另一方面，提供将20:3A8'1U4转化为20:4A5，8，u'14(ARA)的方法，所述方法包括向含有20:3a8'11'14的生物或含有20:2A1U4和A8-去饱和酶的生物，或含有亚油酸、A9延伸酶和A8-去饱和酶的生物中，引入一种分离的核酸序列，其编码具有A5-去饱和酶活性的多肽并且其选自a)包含SEQIDNO:1的核酸残基10842-12077或其同源物的序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的残基10842-12077的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A5-去饱和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:4;d)包含SEQIDNO:1的核酸残基10842-12077的序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A5-去饱和酶活性；并且表达所述核酸序列。本发明方法可包括将ARA转化为co-3脂肪酸的额外步骤，即通过向生物中引入co-3去饱和酶和任选A5-延伸酶和/或A4-延伸酶和/或A4-去饱和酶的编码核酸。对于上述方法，已经发现，用半乳糖诱导可最有效地进行表达。原则上说，按照本发明方法进行生产的合适生物是任何生物，例如微生物、非人类动物或植物。原则上说，合适的植物是能够合成脂肪酸的所有植物，例如所有双子叶植物或单子叶植物、藻类或莒藓类。最好植物选自以下科的植物J(ie/o^zec/aceae、漆树科(^4mcaW"ceae)、菊科(」他raceae)、伞形一牛(v4//aceae)、桦木科(5efw/aceae)、紫草一牛(iorag/打aceae)、十字花-牛(万ms57'c"ceae)、凤梨科(5ra膨/z'ace—、番木瓜科(Carz'c"ceae)、大麻科(Ca"""Z)aceag)、旋花科(Co"vo/vw/ac^3e)、藜科(C77e"o;Waceae)、隐甲藻科(Oyp^ecoWw.flceae)、葫芦科(C"cwA"aceae)、牛毛藓一斗(D/r/c/zaceae)、胡颓子科(五/aeagwace—、杜鹃花科(五n'c"ceae)、大戟科(5w//2oWaceae)、豆科(FaZ)"ceae)、維牛儿苗科(Geram'aceae)、禾本^f牛(Gra/m'"eae)、胡杉匕牙牛(Jwg7a"cfaceae)、樟-牛(丄awrace"e)、豆牙牛(丄eg訓/wos—、亚麻科(丄/"aceae)、棵藻科(五wg/e"ace—、绿枝藻纟冈CPraw'"op/2少ceae)或蔬菜植物或观赏植物例如万寿菊。可提及的实例是选自以下的植物爿tfe/o&ec/aceae，例如剑叶藓属(尸/7少scowzYre〃a),例如展叶剑叶藓(尸/z^com^e〃a/"fera),漆树牙牛(^"acan^aceae)，例如黄连木属(尸/Wacz'a)、芒果属(Afo"gz/era)、腰果属04wacan^'ww)，例^口P可月浑子(尸&toc/avera)、芒果(Afa"gi/^r/wZ/ca)或腰果04""cwWw附occ/<ie"fa/e);菊科(^4Weracefle)，例如金盞花属(C"/e"血/a)、红花属(Carthamus)、矢车菊属(Ce"towra^)、菊苣属(C7c/zoW麵)、菜蓟属(Qv"ara)、向日葵属(//e/z'a"f/z—、萬苣属(丄a"wca)、丄ocwsto、万寿菊属(7bgetes)、丝贞草属(Ka/en'a"o)，i"列^口金盞花(Ca/e"(iw/"c^c/"a,/j)、红花(Gar^2附^"'"cton.—、矢车菊(Ce齒weacy朋ws)、菊苣(C/c/zon',—、洋蓟(Qy"ara向曰蔡(//6//""^a朋w"、萬苣(丄a"wcas油'va)、缺叶莴苣(丄acfwcacn's/a)、芋(丄ad/ca&scw/ewto)、Z^"wcascan'o/a丄.ssp.sa"va、丄acfwcascaWo/a丄.v"t-./wfegraf"、丄acfwcascan'o/a丄./她gnyb/Za、丄a由cas加'vasubsp.ram朋a、丄ocw加com附wm's、沙拉菜(F"a/m'朋(3/ocusto)、香叶万寿菊(7bgetes/wc/(ia)、万寿菊(7bgetesg"ecto)或者非洲或法国万寿菊(7bgetesfe"wz》/Zfl);伞形牙牛(^(//aceae)，例如胡萝卜属(Z)awcw力，例如胡萝卜(Z)awci^;桦木科(Sdw/aceae)，例^口榛属(Cb/j/i^)，例^口欧洲榛(Cb/^/w^"ve〃a"")或榛子(Co7j/wsco/w"a);紫草一+(5orag/"aceae)，例如琉璃苣属(5orago),例如琉璃苣(5oragoo^7c/"afc);十字花一牛CSra^s/caceae),例如芸墨属(5raw/ca)、亚麻齐属(C画e/f"a)、Me/朋owV7a一、白芥属(;S7w，》、拟南芥属04rakwto/wh)，例如甘蓝型油菜(5rasw'cawa/w"、白菜型油菜(6ra咖'cara/assp.)、野欧白芥(57"—sarvem7's)、芥菜型油菜(5mw/ca、芥菜型油菜芥菜变种(万mw/c"/w"cea)、芥菜型油菜纟皮叶变种(5ras^'ca￡^&/^》/&)、芥菜型油菜大叶变种(份ass/cay""ceavar.yb/z'as")、黑芥(Braxsz'ca"/gra)、Sra咖'caw'"a/z'o^fes、亚麻齐(CamW"asWra)、齐菜(Me/"was7'""一com/ww"Z力、野甘蓝(Brasw'ca0/eracea)或4以南芥(Jra6/(io/w/sf/za//awa);凤梨一牛(5^^//"(^^)，例如凤梨属(Jw"wa)、(菠萝)，例如凤梨(y4wawaco附ayws)、^4wa"as或_Srome//acomosa['菠萝];番木瓜牙牛(Can'caceae)，侈寸^口番木瓜属(Can'ca)，^f列^口番木瓜(Carz'ca/apaya);大麻-牛(Caw7akceae),例如大麻属(Caw2aW力，例如大麻(Qmm^^■saWva);》走花牙斗(Cowvo/vw/"ce"e),例^口番薯属(^!cwefl)、-走花属(Co"vo/vw/ms)，例^口甘薯(^fomoea6atofus)、^omoea/a"(^wra;to、甘薯(Cowvo/vm/ms6atoto)、Cowo/vw/iwh7/aceus、i^omoeay^st/g/ata、^7Cwoea"7/"ce"、三裂叶箸(^o附oea/n7oZw)或红著(Cowvo/vw/uy/wwt/wafws;藜牙牛(C/ze"o/ocZ/aceae)，i"列长口甜菜属(5eto),例》口甜菜(J5eta或5etovw/gwnivan[话甘菜];隐曱藻^牛(CVy/^/zeco(iz'm'aceae)，例如隐曱藻属(07/^ecoc//m'wm),例如寇氏隐曱藻(CVypfeco&w/wwco/w//);葫,科(Cwcw^"aceae)，例如南瓜属(Cwcwr6/to)，例如夢瓜(Gwcwr6"a、灰子南瓜(Gwcwr6/fam/x^3)、西萌声(Cwcw^)zYa/epo)或南瓜(CwcMrZ,A3附osc/ato);桥弯藻牙牛(Cyw6e〃aceae)，i"列i口义又眉藻属(Jwp/zom)、桥弯藻属(Qw6e〃a)、(9A:ecfew'a、褐指藻CP/zaeotfoc0^m)、仰叶藓属(ie/weWa),例如三角褐指藻(尸/z(3gO(iac^/wm^7'cor"wfw附)、牛毛藓牙+(D/n'c/2aceae)，例^口牛毛藓-牛CD"n'c/wceae)的种属，高地藓属(Astomiopsis)、角齿藓属(Ceratoob")、C770^oWoste〃a、牛毛藓属(D〖Wc/zww)、对叶藓属(Z)/W/c/w'wm)、五ccrew/t/z'ww、Z/Op/wW/ow、/72///6eW/e〃a、丛毛藓属(^P/ewnW應)、石缝藓属(&e/aw/a)、毛齿藓属(7Wc/zocitow)、5feto6erg/a,例如南极角齿藓(Ceratodo"awtorWcMj)、哥伦比亚角齿藓(Cera/ocfo"co/,6/ae)、Ceratoctow、Ceratot/ow/wrpMmscew、角齿藓(Ceratot/ow/wr/wrew)、Ceratocfew/7w7wreMSssp.cowvo/wft^、Ceratot/owpi/r/wre船ssp.Wewocarpi^、角齿藓圆叶变种(Cerato^fow/wrpwrewsvot-.ra加w^yb//—、Ceratoafo"ratocfow、祝蒴角齿藓(Ceratot/ow他"ocarpw力、C7z，o6/a他〃ac/n7e,'s、D^/c/mwam6一謂、短齿牛毛藓(D"n'c/z,^eWsef謂)、皴波牛毛藓(Z)"n'c/zwwcn^/af&w'wM附)、巻pt牛毛薛(D"n'c/zwm、、牛毛薛(￡>/r/c/mm/zeferoma〃ww7)、D/fr/c/mm//weare、D/frv'c/zww、黄牛毛藓/7"〃zV/,)、￡>/Wc/zww/柳"w/aftwz、细叶牛毛藓(D"n'c/zww/tm7/ww)、纟田叶牛毛藓扭叶变种sc/w'wpen'、D"〃.c/zzw7toW/e、对叶藓(D/Wc/n'w附cap〖〃"cewm)、小7于叶薛(Z)^"c/n'i/附Aagew//)、杀牛萌只于pt薛(Z)/M/c/n'w附z>c/z>7a^ww)、w/zzYe/eggez.、丄o//z/c^owsr/d^、尖口十丛毛藓(/Vewn'(i/ww2(2cww/"o^ww)、尸/ewn,dz'wwa/fe7-"i/b/z'wm、/Vew/^VZ/wmZzo/t/nV/ge/、尸/ewnVZ/wwmex/cowwm、尸/ewnVZ/wmnave"e///、丛毛藓(尸/ei/nV^wmsw6w/她Aw)、石缝藓(iS"e/am'ag/awcescms)、Th'c/zocfow60m3fc、毛齿藓(7Wc/zocfowcy/zWWcw力或7Wc/zc^owcy/zWiT/cwsva八胡颓子科(￡/(3ea^2aceae),例如胡颓子属(￡/aeag"w"，例如橄才览(O/ea杜鹃花科(五Wcaceae),例如山月桂属(ATa/m^)，例如宽叶山月才圭(^a/w/a/a^/b//(3)、狭叶山月桂(Xa/m/aawgusfi/b/^f)、小叶山月才圭(《a/mfaw/cra_p/7_y〃a)、沼'泽山月才圭(Xa/m/a/o/zyb/z'a)、西洋山月才圭(Xa/m/aocc/cfewtafc)、C7s加c/zamaeWzcxiewt/ras或山月桂(Xa/m/a/wc/da);净果藻科CEwg/e""c^ae),例如嚢月包藻属(v4scog/e"a)、变月包藻属(/^tos/a)、柄棵藻属(Co/acfw附)、长梭藻属(Cyc/Wop^)、棵藻属(五wg/e"a)、拟棵藻属(五wg7e"o/w/s)、T^a/a//zotci^、卡克藻属(^/wwh'we")、鳞孑L藻属(丄e;o"力cfc)、扁棵藻属(尸/zacws)、陀螺藻属0^romZowowos)、嚢净果'藻属(7>ac/2e/omowos)，例^口纤纟田净果'藻gra"'fo);大戟科(五w//zor6/ace—，例如木薯属(M"w7zo/)、J^w妙"、麻风树属(Jia^—a)、荒麻属(Wc,"ws)，例如木薯(M麵'/zof、Jiaw一a膨m720/、Ja/ro/3/2awawz7zc^、甜木薯(Ma"//2。/m)//)、Mam7zc^、木著(AfomTzofwam7zof)、MamTzofwe/a"06as7i、木薯(Afaw7zofascw/e她)或荒麻油植物(Wc/wasco附wM"/力；豆牙牛(F"6aceae)，寸列^口3宛豆属(尸/swm)、合5!欠属(y4/6/z/a)、Ca^2omw,o"、Fewz7/ea、音力口属(/"gw)、围涎初于属(尸///2^0/06/"附)、阿拉伯胶属(jc"c/a)、含羞草属(M/mosa)、苜蓿属(Me&cq/0)、大豆属(G(y"力e)、镰扁豆属(Do/!'c/zcw)、菜豆属CF7iaseo/ws)、大豆，例如豌豆(jP&w附jaf/vw附)、々司津牛i宛豆(P&w附(3rvewse)、至宛豆(/Vsw附//wwz'/e)、爿/始/<36eWm'朋a、合欢(^4/始/aj'w说〃'肌'w)、山合欢(J/6/z/a/eZ)6ec&)、」c'a6e他n.a"a、Jca"'a//加rafc、爿/6iz/a6e他n'a"a、爿/6/zz/a6e/Yer/a"a、G^/zorw/o"ZeWer/"""、尸ew/〃e"Z>eWe〃'""<3、/"g"y^agraw51、尸"/2ece〃o6/ww76eWen'awww、尸"/zece〃o6/wmyhagra/w、7,"//6〃'肌'"、Jc"c/"weww、J/Z)/^,aweww、Fewz'〃ee"yW/Zn,肌'"、M/way"yw/z'Z〃.肌."、Miiwosas/ec/cwa、(Sm'cawrafaJw/z'6W肌'"、阔荚金合欢(jcac/a/e6Z>ec&)、大叶相思初于(^4c"c/a附acro/7/2;;〃a)、大叶合欢(J/Z)/z/a/e66ecA)、FeMz7/eea/e66ecA:、大叶含羞草(M/附oya/eZZecA:)、Mifmas"s/g"'osG、紫苜蓿(MWcagos加Va)、野苜蓿(MWcago々/cato)、杂交苜蓿(Afei/c"gov"Wflf)、大豆(G7ycz'"ewax)、镰扁豆(Z)o/z.c/zos宽叶蔓豆(G7yc/wegracz'fc)、G7戸'"e/H'—cb、大菜豆(P/7oseo/附mox)、5"q/"/n'5p/(i"或大豆(5byamax);葫芦藓一牛(FMwaWaceae),例^口^/z朋o;r/zegma、五"to威octo"、葫芦藓属CFw""W")、剑叶藓属(尸/^scom"re〃a)、立石宛藓属(/V7>\ycom/n'wm)，例J(口/^/rawo^r/zegwzaserrafwm、EWtosf/20(io打、五ntosf/iocfow6oZanofen.、c^wmcw必、五"加f/20ctow/am&yom'z'、五"tos^20cfow/e/6erg77、■spa^w/i/^/^、5"tost/zocfowfwcsow'、美国葫"藓(Fwwan,atamen'ca"a)、Fw"aWa6o/awcfen-、齿叶萌,薛(Fwwan'aca/cwea)、力口州葫,藓(Fw"an.(3ca/zybr"/cfl)、Fwwar/aca/v&scera、合生葫芦藓(Fw"w'aco"vo/wto)、Fw"a"'ay"v/cara、Fwwa〃,a、葫，藓(Fw"an'"/^gromefn'cfl)、葫,藓；)匕才及变种(Fw"ar/a/z_ygrc>we^-/cavar.orWca)、葫,藓暖地变种(Fw"an'a/2_ygroweWc<3var.ca/v&scms)、mwrafc、/^grom欲/cavar.wto/ze,S、小口葫芦藓(Fw加n'aw/cToWowa)、Fwwan'aw/crcMtowavar.o6fti/b//G、刺边葫,藓(尸M"ar/a鹏綠"6eirg//)、orcw船、p/awo-cowvexa、Fw"ar/apo/a/^s、Fw""Waravewe///、Fwwan'ara6nieto、Fw"ar/aserrato、wworae、Fwwan'aswMm6adFwrarz'a加csom'、力口州剑叶藓(尸/2"coAm'&e〃aca/i/^"/ca)、展叶剑叶藓(//^■scow/^W/a、尸/7>^(70附/&6//<3！reac/en'、南方立碗薛(尸/^scom/^7'wmawWra/e)、立石宛藓(尸/yAscom/^7',ca/^/bw/cwm)、P/7>wcow/Wwmcw/w/zy^rww、/Vzj^com"n'wwt/nw7mowt/z7、纟工蒴立碗藓(P/^scoAw/r/wmew/7sf0wwm)、户/2j^cowzYn'w/wy/ex7》/z'wm、尸/^scow"n'ww/200A;en'、P/z>wcom"n'wm/zoo&erz'var.serrafwm、R急、萌立石宛薛(P/zj^co附zYn'ww附ega/oca;77M附、梨萌立石宛薛(尸/2j^co附/Zr/w附^yn》rwe)、尸/zyscom/^7'wwS(3waf6e;-g"、尸/2jKscom"n'wm5:wZw/7/7aen'cwm、华盛牵页立石宛藓(P/2_>^ccAwYn,w/wwoy/n'"gtow/era^);雜牛JL苗牙牛(Gera77/ace"e),例^口天兰葵属(Pe/argom'訓)、椰子属(Cocos)、OZe,，例如椰子(Cocas"wci/^ra)、茶薦子天竺蔡CPg/argo",w附gras^w/an.o/cfes)或斗耶子(0/ewwcoco/力；禾本牙牛(GVv^w'"eae)，侈'J长口甘蔗属(Sacc/Mm/w)，侈寸i口甘濕(5^cc/araw(^c/wwwm);胡杉匕^牛(J^g/a"t/aceae),例如核才兆属(Jwg7a/w)、胡才兆属(『a〃/a)，例如核冲兆(Jwg7ara、Jwg7araa//aw//w》//<2、山核冲兆(Jwg7am1s/e6o/6feit"a)、灰核杉&(c/wg/am1c/werea)、灰胡$匕(『a〃/a、Jwg7ara6/xZ^'、力口州黑核杉匕(/wg/araca/i/brm'ca)、印度黑核冲兆(Jwg/am1Zn'"(is/0、中型核桃(Jiwg/aram/cracor/a、黑核杉匕(/wg/ara或黑胡杉匕(『a〃/am'gra);掉:f牛，例如聘梨属(尸ensea)、月桂属，例如月桂(丄awn^wo&fc)、聘梨(尸eraeaamen'ccma)、gra^s^ma或油聘梨(尸eraea/ersea);豆考牛(丄egiW2/"cw"e)，i"列^口花生属(^4ra;c/n'iS)，侈J^口花生(v4rafc/n's/^/ogaea);亚麻;f牛(Ziw"c^e)，i"列^口_<4(^"0//""附，i"列i口亚麻(Zi"wmus"a^s^/附wm)、Zi"ww、奥i也矛j亚麻(￡/"wwawWn'acwm)、丄/"ww6/ewwe、窄p十亚麻(丄/wwma"gws^/b/Zww)、5写亚麻(Zi"訓caf/zaWc)、金黄亚麻(丄/"wmyZaw附)、大花亚麻(丄/"wmgra"^yor腦)、gra"^/7orwm、刘易斯亚麻(丄/",/e>Ww'z')、那旁亚麻(Zi"wmwarZowe"se)、宿才艮亚麻(Zi"wm/e/-ewe)、宿才艮亚麻刘易斯变种(Zi"wwvw./eM^//)、Zi"wwprafe"se或亚麻子(Ii"ww^7'gy"ww);千屈菜-牛(Z^/zra〃,eae)，例如石榴属(尸ww'ca)，例Jt口石^留(尸wm'C(2graw"mw);4帛葵牙牛(TWla/vaceae)，例i口才帛属(Gossypium),例j(口陆i也才帛(Gos^少//i/m/h>si^waw)、木本才帛(Go^y//wmarZorewm)、海岛冲帛(Go^j^z'wm6ar6acferae)、草本才帛(Gos^y/j/wm/2er6acewm)或才帛花(Gas57//wm^wr6en');;也^i考牛CMaAr/zaw"aceae)，例^口i也4艮属(Aforc/fl"f，例i口Aforc/7"w^76e/-te/x>a"a、Aforc/zawW<3_/b/z'acea、大孑包i也^i(Aforc/za"^j！wacra/oraf);芭蕉详牛(A/ksaceae)，仿H口芭蕉属(A/ws")，例^口香蕉CMws""""a)、小果野蕉CMws""cwm/""to)、大;^(7W"w>ya/rarac//1s/aca)、香蕉(A/wsaspp.);杉卩p十菜-牛((9wagr"ceae),Y列^口Cam/^om'a、月见草属(C^wc^/zera)，例^(口月见草(Oe"o/Zzera6/em7/s)或夜来香(Own'^om.a6rev^&y)[月见草];棕冲闾牙牛(尸a/mae)，例力口油棕属(五/ae/s)，例如油才宗(五/aezigw/"eera&);婴粟牙牛(尸qpaveraceae),例如婴栗属(尸a/aver)，例如东方罂粟CPopavwon'ewto/e)、虞美人(尸apmwr/zoeos)、长荚翼粟(尸apaverc/w6/wm)[婴粟];胡麻-牛(尸￡^/"//"<^0^)，例^口芝麻属(5fesamwm)，i"列J(口芝麻(5kso附wm/"<i/cwm);胡祐又一牛(尸—raceae)，例如胡椒属(尸—r)、草胡椒属(尸e/ero柳'a)、Sf^bw/a，〈列^口杉于胡才杈(尸^eradw"cwm)、awa/(3go、狭p十胡裙又(尸—rG"gm咖//,)、大胡椒(P—r、萎叶胡椒(尸zj^r6ete/)、毕澄痴(P!》erci(6e6a)、Pz》er/owgwm、i^perm'gnwz、Pz)ere/o"gata、长胡椒(尸—re/o"g(^ww)、辣椒(;S^fe,'fife/o"gato);禾木科,例如大麦属(//on^wm)、黑麦属(5feca/e)、燕麦属(Jve—、高粱属(5brg/z,)、须芒草属04"t/ra/7ogo")、绒毛草属(//o/c—、稷属(尸薩'c)、稻属、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Th."cww)，i"列^口大麦(//orafew附vw/g"re)、芒l贞大麦草(T/oniew附、鼠大麦(//or(iew附/wwn'www)、4豆芒大麦草(7/orcfew附seca/z,wzw2)、栽培二梭大麦(Z/orc/ewm(i/Wc/zo")、//orafewmaeg/ceraw、//orafeww/zexos/ic/zo"、六歹1大麦(Z/orafeww/zexos^'c/zw附)、六才麦大麦不夫见贝'j大麦(Z/on/ew附z>regw/are)、大麦(Z/oniew附sgAVw附)、4豆芒大麦草(//orcfewmseca/z'wwm)[大麦]、，繁、麦(Seca/ecerea&)、麦(^4vewas加Va)、野燕麦(jvewa力她)、比赞燕麦(」ve加—"油>2<3)、jveway^wavw.s加'va、杂交燕麦(^ve"a/zj6Wt/a)、两色高粱(5brg/2訓6/co/or)、石茅高粱(5brg/z簡/za/e/erae)、甜高粱(5brg/zww■sacc/zaraf謹)、高粱(5brg/z,vw/gare)、Jwt/ra/wgow<irwmmoWz'、两色纟戎毛草(//0/(71Z/co/or)、i/o/cwssorg/2wm、5brg/zw附ae^2/op/cw附、5brg/zw附arwwc//wac6i/m、5brg/zwwcq^orwm、垂;^t'高梁草(^Sbrg/zw附c^7wwm)、工艺高粱(5brg/zwmcfoc/wza)、5brg/z訓cfr訓mo"必、硬高脉高粱草(5brg/zwm"ervosww7)、甜高粱(5"org7zwwracc/zara^/m)、苏丹草(5brg/zwm■swZg/aZ>/-&sce/)、垂卩十高梁草(5brg/zwwveW/c/〃i/7orww)、高粱(5brg/z,vw/gare)、石茅高粱(i/o/cws/za/e/em7\s)、Sorg/2訓w//z'ace,、粟(尸aw/cwz7/tocewm)、水稻(O，as加,va)、水稻(Oyza/a争/Za)、玉米(Zeawa^y力、普通小麦(7hY/cwwaeW/v,)、硬粒小麦(7Wricwmdwnwz)、圆斗主小麦(7Wn.cwmfwrg^ww)、Th'ricww/z少6e;-"wm、马卡'!、麦(7hY/cwmwac/za)、普通'■!、麦(JhY/cwms"Wvww)或d、麦(7>/"cvw/gare);紫球藻科(Porphyridiaceae)，例如C7wxx^/zece、、尸e&ovawe〃a、J求藻属(尸o/7/^nVZ/ww)、纟工藻属(i/zotfe〃a)、i/zo6tosorws、Fiaw/zoe,m'a，例如紫球藻(尸or//z,Wwwcn/e"fwm);山龙目艮一牛(iVoto3ceae),例长口澳洲坚果属(JWacacfa;w'a),例如澳洲坚果(M2C(3c/a附/az'"te^7》,/a);绿枝藻纲CPms/"qp/^ceae)，例^口肾》菓属(7Ve//^o化/附/力、/Vos7'"ococcus、ScAe^fe/z'"、四專便'藻属(7"e/rawe/m/力、Afowtow'e〃a、OWreococcws，<列长口纟录肾藻(7Ve//zrose/w/51。//vacea)、尸ms/"ococc^ca戸w/a加、iSb/2e;^fe//a^Z)/a、周氏四鞭藻(re^-ose/mkc/z"0、四孝便'簾(refrase/m/sswec/ca)、A/awfowz'e〃as《wawato、(9s^reococcMstown';萏草牙牛(T^6/aceae),例^口咖叫卜属(Co#ea)，例如咖啡(Co^^a^p.)、阿拉伯咖啡(G^eaflra6/co)、中果咖p非(Co,ac"we//zora;)或大果咖叫—(Cb,a/f6er/ca);玄参-牛OScro//zw/"Waceae)，例如毛蔬花属(F"er6ascwm),例如毛瓣毛蔬花(Ke^ascwwZ/a"an,")、东、方毛JI花(「(2WascMmc/za/jc/z')、密p十毛,M:花(F"er6osc謹(imsi/7or謂)、F"er6osc/agwms、长叶毛蔬花(Fer6oscww/owgi/b//wm)、F"e/^oscwm(vc/7w/^s、f^r6oscwmw/gn/m、奥4木匹克毛'H花(Ker6oscwmo/_ymp/cwm)、F"er6asc廳//z/owo/t/es、紫毛蔬花(P^r6aycww//oewz,cww)、rer6aycw/wpw/venz/ewft/m或毛，露花(F^Wasciw2//za/ww力；痴牙牛(5b/"w"ceae)，例^口夢束祐又属(C"/w'cwm)、烟草属(jV/co"Vma)、痴属(5b/a"wm)、番痴属(Z^copera/co")，<列J(口l束才杈(Ca/w/ca""www)、Ca戸/cg/a6z-^cw/w/77、小米椒(Ca/w/cwmyh^esce/w)、#束对权(C"opw'cwm、烟草(/V/co"awa励"cww)、花烟草(Wc加.a"aa/ato)、长头烟草(Mcori朋a加e做ato)、光烟草(Mco/""ag/awc")、iV/co^3"a/a"g^o^z'、Mcof/a""o^i^i/b/Za、《W(2t/n'va/v/s、A7cof/a"are/a"t/a、黄花^因草(Mcorifl"ar组/cfl)、烟草(Mcof/""a^/vesrz》、马铃薯(5b/a"w附fw6eras画)、痴子(5b/aw,me/owgewa)、番痴(Z^coperafco"escw/e齒w)、Z^cc;/em'cci"/少co/em'c、梨形番恭(Z^co/erw.ccw/"ybr膨)、红痴(5b/a",或番痴(5"o/a"w附/少co/en7,cww);>^#);f+OS/e/rw//aceae),例^口可可属(772eoZ^owo),例:i口可可(T7zeo6romacacao);或山茶-牛(77e"ceae)，Y列^口山茶属(C"we〃/a)，i"列^口茶(Came〃/a。最好微生物是例如选自以下科的真菌毛壳科(Ozaetow/aceae)、笄霉科(C/zoawe//zoraceae)、隋J求酵母一牛(Oy/^ococcaceae)、小克4艮汉霉(Cw"w'7g/2a附e〃acgae)、暗梗孑包牙+(Z)emeriaceae)、丛梗孑包-牛(Mo"/Z/"ceae)、被孑包霉科(MoWere〃aceae)、毛霉科(Mwcoraceae)、腐霉科(i^/z/aceae)、酵母科(&c/(3rowjFc加ceae)、水霉科(Sa/ro/eg"/ace—、裂殖酵母科(5"c/zizasac/zarowjv"cetoce"e)、5bcbn'aceae或瘤座孢科(亦称结节菌科，rwZe/rw/aWacefle)。可提及的微生物的实例如下笄霉科(Ctoan印/zoraceae)，例如布拉霉属(说d^s/ea)、笄霉属(C/2oa"ep/zora),例如三孢布拉霉(j5/"^s/eaWs/ora)、瓜笄霉(C/20a"e//20racwcwr6/torw附)、漏斗并霉瓜变种(C7zo朋e/7/zoraf"/ww<i/Wi/^ravar.cwcw/^tor謂)；被孑包霉科(AfoW/ere〃aceae)，例如浮皮孑包霉属(AfoWere〃a)，例如深黄#皮孑包霉(Mort7,e/"e〃a/sa6e〃/—、多头被孑包霉(M0Were〃ap0/yce;7/7a/a)、拉曼被孑包霉(AfoWere〃arama""/""")、葡酒色浮皮孑包霉(AfoWere〃aW""ce")、环带被孢霉(肘^"6"//<3腐霉科CP"/2/aceae)，例如腐霉属(尸;^/ww)、疫霉属CP/2_ytop/^ora)，例如德巴利腐霉(/y/z/wwdeZ)(3，w,)、间型腐霉(尸yf/n',/"ter附W,)、畸雄腐霉(i^/n'i/mparoec"W(irw附)、户;^/n'w/wsy/varicw附、终才及腐審(/y^H'www/W附w附)、,恶、橘生疫霉(尸/^op/^orac"Wco/a)、柑橘褐腐疫霉CP/z7top/2^0rac/的p涵謹)、隐地疫霉CP一o卢/zorac，to炉)、德雷疫霉(尸/2少to;/^/zora公ecfo/en')、红腐疫霉(尸/^to;/^/orae^y决rase;^/C(3)、侧生疫霉(i%fop/zf/zora/aferafc)、大雄疫霉CP/7,卢/20ramegaspenwa)、》因草疫霉(尸/i;vto//zf/zoraw'cof/awae)、烟草疫霉寄生变种(尸/,/滅oram'c加'a""ev"r./arawY/c")、棕榈疫霉(尸一o/杨ora/(3/脂Vora)、寄生疫霉(尸一o/她orapamszY/cfl)、丁香疫霉(_P/i!_ytop/^/oras少n'"gae);酵母牙牛(S"cc/7atromycetoceae),侈'^口、)又逊酵母属(/7a"se"w/a)、毕赤酵母属Wc/z/a)、酵母属(5""cc/z"rawyces)、类酵母属(&cc/^w^co&力、西洋蓍霉属(7aATovWa)，例如异常汉逊酵母(//a"化"w/aawom"/a)、力口州汉逊酵母(/f"raeww/aca/zybm/ca)、力口拿大汉逊酵母(//ara^2w/aca"油"—、碎嚢汉逊酵母(//ara^"w/aca;ra/"to)、西弗汉逊酵母(//aw""w/a"y^r/0、葡糖酶汉逊酵母(//(mse"w/<2g/wcc^wa)、亨利汉逊酵母(Z/imsg""/"/ze"W"7)、//arae"w/a/zo/W"小汉逊酵母(7/a"""w/aAm>wfa)、不发酵汉逊酵母(//om^"w/a"o"y^7we"to"力、//arae"w/a、多形汉逊酵母(//"""■se""/"po/，o^/za)、土星汉逊酵母(^mse"w/as齒;-"附)、亚膜汉逊酵母(i/"wse"w/asw^pe/Z/c"/osa)、威克汉逊酵母(ifa"se"w/aw/cA:er/za柳7)、温奇汉逊酵母(//a聰"w/awz'"gez')、嗜酒毕赤酵母(尸/c/w.aa/co/zo/qp/n'/a)、尸/c/z/aa"gw加、异常毕赤酵母朋owa/a)、双孢毕赤酵母(尸/c/2z'aZ^/ora)、伯顿毕赤酵母CPz'cWa6wWom7)、力口拿大毕赤酵母(尸/c/w'aca"a^"w》、碎嚢毕赤酵母(尸/c/z/aca戸w/"to)、卡氏毕赤酵母(P/c/w'acamm7)、聚纤维二糖毕赤酵母(尸/c/n'"ce〃oZnVw(3)、西弗毕赤酵母(尸/c/^ci/br//)、粉状毕赤酵母(尸/c/^/an'"OM)、发酵性毕赤酵母(尸k/n'a/erme"tora)、芬兰毕赤酵母(尸/c/z/ayw/朋d/ca)、葡糖酶毕赤酵母(户/c/^g/wcc^yma)、季也蒙毕赤酵母(尸/c/h'"、曱虫毕赤酵母(尸/c/wV3/2"//o//n7a)、亨利毕赤酵母(P/c/n'aAe肌'"'0、■fVc/n'a/zo/st"、/^c/H.ay"ci/m7、尸z'c/n'a//"t/"en7、膜醭毕赤酵母(户/c/w."附eAw6rG"fl咖c/e"s)、曱酉孚毕赤酵母(/Vc/z/amef/2<a"o//cfl)、小毕赤酵母小变种(P/c/zz'am/"wfav"r.脂'"齒)、小毕赤酵母不发酵变种(i^'c/n'ami'"wtovar.now/enwewfara)、扭P威毕赤酵母(尸/c/z/a"orvege"w》、奥默毕赤酵母CPz'c/z/ao/zww/)、巴斯德毕赤酵母(尸z'c/n'apostor&)、i^c/H'a;/n',o<^e"c/n'、松毕赤酵母(尸z'c/n'ap一、多形毕赤酵母(尸z'c/H'apo(ymo77/2a)、栎毕赤酵母(P/c/7/agwerc柳m)、罗丹毕赤酵母(尸/c/w'ar/zo^3"ms7'力、i^'c/n'asorge"fe"^、树干毕赤酵母(尸z'c/^W—to)、斯地毕赤酵母(尸/c/^Wra^wge"w》、亚膜毕赤酵母s咖e〃/cw/麵)、帽孢毕赤酵母(尸油'ato/eto"a)、喜海藻糖毕赤酵母(尸/c/2/fit^/za/o//w7")、尸/c/h'"vz'"/、木糖毕赤酵母CP/c/z/a"/osa)、酸酒酵母(iSacc/zor麵;Kc&sac幼〕、拜耳酵母(&cc/z"ra附yc^s6az7")、贝酵母(Sacc/zaramycesfeaycwMs)、双孑包酵母(Sacc/zaramyces6/5pora力、好望角酵母OSacc/zaroT^ycascape"w'5)、卡斯伯酵母(5Wcc/z"ra/wycascm7s6e;^era&)、酉良酒酵母(iSacc/zaromyc^scerevz'w'"e)、酉良酒酵母摘圆变种(iSacc/zorom_yc&scerev/sz'aee〃扭o/c/ew力、薛瓦酵母(5"acc/z"ra，cesc/ev"//m.)、德尔布酵母(iSacc/zflro，cas必6n^c嗣、糖化酵母(&cc/zarawjKcesc/z.os她'c—、/Sacc/narowycesc/mso/Man/m、雅致酵母(&cc/z"ra附yc^se/egara)、椭圓酵母(5"acc/zaramycese/一oz'c/ews)、发酵性酵母(iS"(3cc/2aramyc&s^rmewta")、弗罗棱酵母(<Sacc/iarow_ycesy/orew""ws)、脆壁酵母(Sacc/7"ro附ycwyhargifo)、异质酵母0S"cc/2"ra附ycas/7e敏oge"/c—、椒揽油酵母(;S"cc/zoramycesZ^"z)/ms7》、荷兰酵母(&cc/zara，c^/",'to加)、意大利酵母(iSflcc/zarow;/ces/to/z'cw力、克鲁弗酵母(Sacc/7flra考c^sA:/w;/ver,)、克鲁斯酵母(iSacc/7"ramjcasAtt^0、乳酸酵母(5^cc/2"ramycey/ac嗣、马克斯酵母(&ccAaro"casmaoiaww力、小椭圓酵母(5^cc/^ramyc^y附/crae仏)wozVfes)、摩拿酵母(5^cc/zara附ycesmo打to"—、诺地酵母(Sacc/zaramyces"or6ms&)、椒榄酵母(Sacc/zflramyces。/eacews)、奇异酵母(iSacc/zaram少ces、巴斯德酵母OSflcc/zaramyc&y/oston'fl"—、普地酵母(Sacc/zarawyc^s/reton-ms/力、罗斯酵母(&cc/wra附少cesmsez〕、鲁酵母(&cc/wra考casro腿7)、葡萄汁酵母(5"acc/z"romjKceswvar簡)、路德类酵母(iSacc/"nw7ycoafey/w血妙)、解月旨西洋蓍霉(Tamw/a/—/,'c");裂殖酵母科(5b/^os"c/zaromyc"aceae)，例如裂殖酵母属CSc/z/zosacc/zarcwjc&y)，例^口日本裂歹直酵母日本变种(Sc/zizcwocc/z"raw少cas7'"/0Wcwsvar.y,a/ow,cas)、曰本裂殖酵母易变变种(5b/H,zo犯cc/zaramj;cesy'a/o"/cusvera加'fc)、解苹果酸裂殖酵母(5"c/z/zc^cc/2ara附;;casma/^vorara)、八孑包裂殖酵母(5"c/z/zc^"cc/7(^omycayo"osporw力、粟酒裂歹直酵母解苹果酸变种(iSc/zizas"cc/2aromycas/ow6evor.ma/zV/evoraw力、粟酒裂歹直酵母粟酒变种(iSc/2/zosacc/^ra附少c&s/om6evar./om6e);破嚢壶菌科(7T7ra;w5toc/^n'aceae)，<列长口v4/^zo/-"/<3、jp/awoc/z^^n'ww、0/i3/o"oc/2,/画、裂殖壶菌属(5b/^oc一n'w附)、破嚢壶菌属(7Tzra^stoc/^r/ww)，侈J长口聚集裂歹直壶菌(5"c/z/zoc/2少fn'wmaggreg^ww)、5"c/zizoc/z;Kfr7'w附/zVwac/ww附、纟工树沖木裂歹直壶菌(Sc/z/zoc/z;^〃'w附附awgrove/)、、裂歹直壶菌(《Sc/2/zoc/z_yfr7'MWm/"wfwm)、/\孑包裂歹直壶菌(5b/^oc/,/訓octos/or謂)、聚集破嚢壶菌(77zraw加c—n'訓aggregart/w)、7T2raw"oc/2j^n'M附amoeZo/cfewm、南才及石皮囊壶菌色石皮囊壶菌(72raustoc/2j^n.w柳awrew附)、7TwawWoc/y^WwwZe"^n'co/a、J求形破囊壶菌(77zrai^oc/z_yr/M2g/060sw附)、7Tzn3wsfoc/y^n'Mm动破嚢壶菌(7T7rawWoc/^〃'w附/wo"vww)、多初级石皮嚢壶菌(7TzraM5toc/^fn'wmmw/^'n/c^wewfa/e)、厚皮石皮囊壶菌(7TzrowWoc/zj^Wwm/ac/7_y<ierwww)、i曾歹直石皮囊壶菌(77z厂awWoc/z;^rzYw2/ro/zy^rwm)、粉乡工破囊壶菌(772n3"Woc/z;^n.Mmroseww)、罗氏石皮囊壶菌(TTznafwWoc/^fn'ww更多有利的微生物是例如选自以下科的细菌芽孢杆菌科(5a"7/aceae)、肠4干菌科(五"&ra6ac^7'acae)或才艮瘤菌科(//zizo6/ace"e)。可提及的实例是选自以下的孩史生物芽孢杆菌科(5""7/aceae)，例如芽孢杆菌属(万"cz'〃w)，例如酸热芽孢杆菌(Sac/〃wsac〖cfoo7/c/an'w力、酸土芽孑包杆菌(5flcz7/wsflc/cfo^resWs)、嗜碱芽孑包杆菌(6ac/〃ws"/ca/o//7z7w力、解淀4分芽孑包#干菌C6ac/〃wsamy/o/Z^wey^c/ewshf定4分芽孑包4干菌(5ac/〃i^amy/o/^^cw力、4豆芽孑包4干菌(5acz7/ws6reW力、蜡样芽孑包杆菌(5acz'〃wscerew力、环状芽孑包杆菌(B"",〃ws">cw/(ms)、凝结芽孑包杆菌(Sa"7/wscoagw/mw)、球形芽孑包軒菌梭形亚种CSa"7/ws—am'固subsp.yki/bnmX)、嗜乳糖芽孑包杆菌(Bac/〃usga/a"o//w7ws)、圓孑包芽孑包牙干菌(S"cz'〃usg/o6/spon^)、圆孑包芽孑包杆菌海生亚种(5a"'肠g/oZ^pomssubsp.,W"—、嗜盐碱芽孑包杆菌(5ac/〃us/7a/op/w7us)、纟爰病芽孑包杆菌(Ba"7/iAs/e"^mo^ws)、迟緩芽孑包杆菌C8fl"7/附/e"加)、地衣芽孑包軒菌C8flc/〃ws//c/zew》m/s)、巨大芽孑包杆菌(5"c/〃wsmegafeWwAw)、多粘芽孑包杆菌(5ac/〃ws、冷解糖芽孑包杆菌(5ac/〃w戸;;c/zrasacc/zara/;;"cw力、短小芽孑包杆菌(Sac/〃tw;wm7w"、3求形芽孑包4干菌(8ac/〃z^s//z(3en'cws)、斗古草芽孑包才干菌斯氏亚种(5acz'〃wswto'fcsubsp.>5;&&6"//)、枯草芽孢杆菌枯草亚种(5a"'〃wss由/fcsubsp.Sw6"fc)或苏云金芽孑包杆菌(5acz.〃ws^2wn'"g/em/s);肠杆菌科(五"fera^"er/ac"e),例如4宁才蒙酸牙干菌属(C/化o6acfer)、爱德华氏菌属CEdwanis/e〃a)、肠杆菌属(五"ferate敏)、欧文氏菌属(五削'"/a)、埃希氏菌属(Esc/2m'c/n'a)、克雷伯氏菌属(尺/eZwW/a)、沙门氏菌属(Sa/wcwe〃")或沙雷氏菌属(5W"ra"a),例如无丙二酸柠檬酸杆菌(CzYraZja"erama/owa"cw力、差异柠檬酸杆菌(Cz>o6a"erWveraw)、弗氏柠檬酸杆菌(C7fro6acfer戶ewm///)、C7&o6acfergewcwospec/es、C7fra6a"erg7'〃em7、中间4宁才蒙酸杆菌(C^o6a"er、合适柠檬酸杆菌(C"ra6acferA:osen')、C7fraZac^mz^7/"fae、梓樣酸軒菌(C7fra6acfersp.)、保科氏爱德华氏菌(￡^vraniszW/a/os/z/"ae)、给鱼爱德华氏菌(五cwanis/e〃(3/cto/wn')、迟钝爱德华氏菌CE<iwflniszW/a、赤扬欧文氏菌(五rvv/"/(3a/"/)、解淀4分欧文氏菌(5Wv/"/aa^y/ovora)、菠萝欧文氏菌(EWv/m.aa"朋加's)、五rvW"/aqp/z/血o/a、五rw/w'a6/〃/"g/"e、灭仙人掌欧文氏菌(五rvW"/"cac"'c/(ia)、生癌欧文氏菌(五rvWm'acfl"cerage"")、大仙人掌欧文氏菌(五rw/"/acameg/eaw")、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐亚种(五rw/m'acarofovorasubsp.afro"/"ca)、胡萝卜寿欠腐欧文氏菌维管束亚种(五rw/m'acorotovorasubsp.6etovoscw/or謂)、胡萝卜软腐欧文氏菌臭味亚种(5nv/w'(3caratovorasubsp.oc/on;/^ra)、胡萝卜4欠腐欧文氏菌山葵亚种(五nW"/"caratovorasubsp.丽涵〖ae)、菊欧文氏菌(jBrvWm'ac/wysa"欲e附/)、毛芍兰才艮欧文氏菌(五rvv/"/ac^/n^7gd//)、溶解欧文氏菌(五rvW"/a(ii^o/vms)、草生欧文氏菌(五rwz'"/a/zer6/co/a)、野梧桐欧文氏菌(五nWm'ama〃o"vora)、小米欧文氏菌(五rvWm'a附/〃幼'ae)、流黑欧文氏菌CEnW"/aw'grzyZwe"s)、超压欧文氏菌(五nWm'arn'mz^pms^wra/^h^i色欧文氏菌(五rvWm'a/era/c/wa)、番石榴欧文氏菌(五rwz'm.a/w淑)、五rvW"z'ap"》/Zae、栎欧文氏菌(5rvWw'o《wwc/"")、大黄欧文氏菌(五rv^m'aAa/70"ricz')、生红欧文氏菌(五rwz'm'arwZ)咖"'，)、柳欧文氏菌CE環,"/ara/Zc/力、斯氏欧文氏菌(EWW"/aWew"W//)、嗜管欧文氏菌CEm/m'a/rac/2ez>/w7")、嗜夏孢欧文氏菌(EnWw'awmsfovora)、非脱欲埃希氏菌(jEsc/zm'c/2/aacfecw6ca7/ato)、不产。引"朱埃希氏菌(Esc/ze〃'c/2/aaw/"<io//ca)、金色埃希氏菌(jEsc/zm'c/^"wmscms)、蟑螂埃希氏菌(Esc/^r/c/H'a6/a加e)、大肠埃希氏菌(^Esc/zen'c/2/aco/z')、大肠埃希氏菌共生变种(Esc/zm'c/n'aco//vor.commwm'or)、大肠可变埃希氏菌(^sc/2m'c/z,aco/"臓toMe)、弗氏埃希氏菌(Eyc/^〃.c/w.ay^g^yom力、赫氏埃希氏菌(&c/^〃'c/w'fl/7erm"""/z')、埃希氏菌(Eic/zen'c/n'asp.)、伤口埃希氏菌(_Eyc/ze/-/c/w'avw/"m》、产气克雷伯氏菌(《/eZwW/a^rag^7M)、爱德华克雷伯氏菌亚特兰大亚种(《/eZw/e〃aedwanis//subsp.W/a"toe)、解鸟氨酸克雷伯氏菌(A7eZw'e〃aor""/n'"o/;^'ca)、产酸克雷伯氏菌(〖/^^/"o"toca)、才直生克雷伯氏菌(X7血/e〃a//a油'co/a)、肺炎克雷伯氏菌(A7血/e〃a/"e画ow'ae)、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(^7eZw.e〃ap"g,o"z'"esubsp.p"ewwom'—、克雷伯氏菌(尺/eZwW/asp.)、土生克雷伯氏菌(尺/eZw'e〃"^r&e"")、特氏克雷"f白氏菌(A7e6sz'e//afrev&am'z')、奥1"粵尼妙、门氏菌(Sa/附owe〃aa6ow力、亚利桑那沙门氏菌(&/mo"e//aw&o"ae)、邦戈尔沙门氏菌0Sa/mo"e〃a6owgoW)、猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种0S"/wo"e〃ac/o/era&sw^subsp."Wzo"ae)、猪霍话L沙门氏菌邦戈尔亚种(5^/mowe〃ac/2o/erar&yw^subsp.Zowgon')、猪霍舌L;少门氏菌猪霍舌L亚种(iS"/;wo"e〃ac/zo/era&sz^subsp.c/zo/emaww&)、猪霍乱沙门氏菌双亚利桑那亚种(Sa/wo"e〃flc/zo/eraasw"subsp.d/aWzo"ae)、猪霍^U少门氏菌豪牵页亚种(iSa/w2owe〃"c/zo/era^sw/ssubsp./owfewae)、猪霍舌U少门氏菌印度亚种0Sa/mwxe〃ac/zo/erafesw!'ssubsp.z'm^ca)、猪霍^U少门氏菌萨^立姆亚种(5W/wo"e〃ac/w/eraesw/ssubsp.sa/a附"e)、达累斯萨拉姆沙门氏菌(iSa/wo"e〃a(iare^fl/a"附)、肠炎沙、门氏菌豪牵页亚种(5"a/附o"e〃"e"fen'casubsp.、肠炎沙门氏菌萨拉姆亚种(iSa/mowe〃(3subsp.sfl/fl麵e)、肠炎沙门氏菌(5W,"e〃a、鸡沙门氏菌(iSa/wowe/Zaga//z>MTwm)、、海^^、堡沙、门氏菌(Sa/mo"e/Za/ze〖Gfe/Zerg)、巴拿马沙、门氏菌0SW/wowe〃a/awama)、森夫牵页沙、门氏菌(Sa/mowe〃a化"ye"6erg)、鼠4另寒沙门氏菌(Sa/附owe〃a/);//7/wwr/ww)、口耆虫沙雷氏菌(5Wrra"'ae"to附o/M")、无花果沙雷氏菌(5ferra"a，an'a)、居7良沙雷氏菌(5fe冊^3yb""'co/a)、葛氏沙雷氏菌(5Wra^3gW附e^')、变形斑沙雷氏菌(5fe/r加'a/—咖c/e"力、複色沙雷氏菌(5fe/r加V3marcescms)、褪色沙雷氏菌褪色亚种OSerra"awarcasce;wsubsp.附orc&sce"力、海红沙雷氏菌(i9ema^/a/war/"orMZra)、气味沙雷氏菌(/Sferra""oc/w^ra)、普城沙雷氏菌0Serraf/apfymow^era/s)、普利茅斯沙雷氏菌OSerrafz'a//jwwf/z/ca)、变形斑沙雷氏菌(5ferra"a/rofe"附acw/ara)、变形斑沙雷氏菌食酉昆亚种(5fe;ra"a/^ofeawofciz/flMSsubsp.《w/"ovon3)、食酉昆沙、雷氏菌(5"erraH"《wz'"/vorara)或^果红沙雷氏菌OSerraWan^j/c/aga);才艮瘤菌科，例如土i裏杆菌属(^graZ)acten'Mm)、嗜碳菌属(CaAop/H7w力、螯合杆菌属(C/ze/"to^"er)、剑菌属(五"w/er)、才艮瘤菌属(i/2izoZ/wm)、中华根瘤菌属(5V"or/z&o6/wm),i"列^口大西洋土i裏4干菌(^groZ""e〃'wwaf/awdcww)、锈色土i裏才干菌(y4gro6a"en,wm々m^/"eww)、食明月交土》裏土i襄^干菌(/igro6acfen'w附、i文射形土^裏4干菌(^4gro6"cfen'w附raWo/acfer)、发根土壤軒菌(々ra6acfen'wmr/^oge"e力、悬钩子土壤4干菌(Jgro6flcfen'wwrwZ/)、星J趕土》裏4干菌(^4gro6acfeWw附ste〃w/a加w)、才艮癌土i裏4干菌(JgraZacfen'wm加m咖c/era)、葡萄土i裏4干菌(^ro6"c&n'w附W嗣、碳酸嗜碳菌(Gar6o/Mwscar6ox油力、何氏螯合杆菌(C7^/atoZa"er/2e/"te")、粘着剑菌(五"w，a(i/2aerms)、栖树剑菌(五rai/b"or6oni)、弗氏剑菌(五"57y^户e(&')、五rai/^Aas打'e"wi、鸡目艮草&J菌(E"w^ferAwwwerowz'"e)、草木樨^1〗菌(五"si/^rwe&c"e)、苜蓿剑菌(￡"7^we///o&')、萨赫勒剑菌(五"wy^sa/;e//)、适宜剑菌(五ra7y^"fera"gae)、達斤疆剑菌(五m7y^x/"力'a"ge"w》、鹰"觜豆才艮瘤菌(A/zizo6/wmc/cen')、豆才艮瘤菌(i^/zoZ)z'wmef//)、弗氏才艮瘤菌(i/^oZ/wmy^e<i/0、山羊豆才艮瘤菌(7/z/zo6z'w附g"/egae)、高卢才艮瘤菌(及/^zo6fw附g"〃/cww)、贾氏根瘤菌(i/^o6z'wmg7'ani/"z7)、海南才艮瘤菌(i/n!zo6/ww/2"/"朋erae)、华癸才艮瘤菌(A/^o6/m附/maA:w//)、华特拉才艮瘤菌(i/z/zo6/wm/mawf/era^)、木兰才艮瘤菌(//z/zo6/wm/"d/go^rae)、日本才艮瘤菌(//z/zo6/wm乂a/om'cwm)、3宛豆才艮瘤菌(i/z/zo6/wm/egwm'"osan/w)、黄土根瘤菌(7/z/zoZ/ww/oawerae)、百脉根根瘤菌(//z&o6/wm/ori)、羽扇豆根瘤菌(i/7/zoWwm/w;z'w')、地中海才艮瘤菌(7/7&o6/wm、苜蓿才艮瘤菌(W/w!zoZj/m;w、内蒙古才艮瘤菌(i/7izoWi/附mo"go/erae)、菜豆才艮瘤菌(i/z/zo6/"w//7似eo//)、i文射形才艮瘤菌(//7/zo6/wmrad/o6acfe"、发才艮才艮瘤菌(i/z/zo6/wmr/z/zogewas)、悬钩子根瘤菌(//^o6/wmn/6/)、黄芪根瘤菌(及/^zo6/wwsw〃ae)、天山才艮瘤菌(i/w'zoWwnf/ara/zflwerae)、三叶草才艮瘤菌(//7Z,zo6/wwfn》/〃)、热带才艮瘤菌(i/z/zo6/wm"o//c()、i/z/zoZz'wmwwc^co/"、葡萄才艮瘤菌(i/2/zo6/wmvfto)、粘着中华根瘤菌(5V"or/H'zo&wm"c/zaerem1)、栖树中华才艮瘤菌(5Vwor/7&o6/MmaAcW力、弗氏中华才艮瘤菌OSVwor/z&oZn'wmWewe、鸡目艮草中华根瘤菌(5Vww/w'zo6z'wmA:wmweraw/ae)、草木樨中华根瘤菌(iS/"oWz/zo6/wmme&cae)、苜蓿中华才艮瘤菌0S/"oA&o6/i^me/z7o")、莫雷兰中华才艮瘤菌(5V"or/zz:zoZH'wwwore/eme)、萨赫勒中华根瘤菌(&力or/i/zoWwwsa/7e")或新疆中华根瘤用于本发明方法的有利微生物的更多实例是选自以下的原生生物或石圭条类沟萆便藥纟冈(Dz'"o//^ce"e)、Twram'e〃/(iae或QxjKn'c/nWae,例如寇氏隐曱藻(O7/^/2ecoG^w'wwco/zm7)、三角褐指藻(尸/zaeoc/ac(y/wm/n'cor"wfww)、贝台贝棘尾虫(5^/o"_yc/H'<3mj^z7w力、氳棘尾虫(5^/o"少c/w'a/wWw/ato)、腐生净束尾虫0S^/o7^c/n'"pw^/wa)、背一大净束尾虫(5^/o"yc/w'awotop/zora)、棘尾虫(《S^/o"_yc/z/asp.)、弯曲豆形虫(Co/;/(^w附caw/少/wm)或豆形虫(Cb/p/t/z'wmsp.)。方便地用于本发明方法的生物是转基因生物，例如真菌(例如被孢霉属或破嚢壶菌属、酵母(例如酵母属或裂殖酵母属)、苔藓类(例如剑叶藓属或角齿藓属)、非人类动物(例如新小杆线虫(CaewoAaZxi/to))、'藻类(<列^口P/z;^scow/^"e〃a、尸seMcfc^cow^/e/c/a、/Vos7'"ococcws、Sc/^^^feZ/a、四鞭藻属(71欲0^//&)、Afo"/omW/a、Qs/mcoccw51、隐甲藻属或褐指藻属)或植物(例如双子叶植物或单子叶植物)。特别方便用于本发明方法的生物是属于产油生物类的生物(既用于生产油的生物)，例如真菌(例如被孢霉属或破嚢壶菌属)、藻类(例如尸/y^com/Zre〃a、尸化W(iayco"/yeA^"、7Voy/wococcm1、&/ze/^//a、四鞭藻属(7^^0^/附/5)、AfowtowW/a、(95treococcw、隐曱藻属、褐指藻属)或植物，尤其是植物，优选含油种子或油料作物，其含有大量脂质化合物，例如花生、白菜型油菜、甘兰型油菜、向日葵、红花(a^/2"wmsa"ctor/a)、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻油植物、橄榄、芝麻、金盏草、石榴(Punica)、月见草、毛蕊花、大蓟、野玫瑰、榛子、杏仁、澳洲坚果、鲟梨、月桂、西葫芦/南瓜、亚麻籽、大豆、阿月浑子、琉璃苣、乔木(油棕、椰子或核桃)或适于耕作的作物例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、水稻、大麦、棉花、木薯、辣椒、万寿菊、茄科植物(例如马铃薯、烟草、茄子和番茄)、蚕豆、豌豆、苜蓿或灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳树和多年生牧草和饲料作物。本发明优选的植物是油料作物，例如花生、白菜型油菜、甘兰型油菜、向日葵、红花、翼粟、芥菜、大麻、蓖麻油植物、橄榄、金盏草、石榴(Punica)、月见草、西葫，/南瓜、亚麻籽、大豆、琉璃苣、乔木(油棕、椰子)。用于本发明方法的特别优选的植物是C18:2-脂肪酸含量高的植物，例如向曰葵、红花、烟草、毛蕊花、芝麻、棉花、西葫芦/南瓜、罂粟、月见草、核桃、亚麻籽、大麻或大蓟。非常特别优选的植物是红花、向日葵、罂粟、月见草、核桃、亚麻籽或大麻等植物。对上述本发明的方法有利的是，除了本发明第一至第四方面的核酸之外，还向生物中引入脂肪酸或脂质代谢的酶的编码核酸。这类核酸最好来源于植物，例如藻类，例如绿枝藻纲(/Vos7'"o//z_ycefle),寸列^口异毛藻属(//efero附osf/x)、Afa附附e〃a、Afo"tomW/a、Mfcromo"os、肾藻属(7Ve//zmye/附/s)、O欲eococcus、绿枝藻属(尸ms/"oc/ac/w力、尸ms/"ococcw51、尸"wcfoscow/ye/ca、/yc"ococcws、尸,aw/wowos、iSc/ze^fe//"或四鞭藻属(7^rase/w/s)，例Mz,crawo"ow/w"〃a、绿肾藻(iVe//zrase/w^o//vace")、梨形肾藻(A^p/zrase/m/s/_yn》nw/s)、圆形肾藻(iYe//zT-ose/m^ra加wc^2)、O欲eococcws、Qs^mcoccwssp.、尸ms/woc/at/wsoscws、sp.、r欲ose/附^a//cw/她、7fefrase/附/scorten.q/bnm^、周氏四鞭藻(reraje/m/51c/z"0、7i^raye/wz'scowvo/wfae、refrase/w/scfes/^ac/za;^/、r欲ose/mz,sgracz,fe、r欲ose/m^/zazem'、T^mse/m^/wpe〃wc油、re^rase/wziswec/ca、T^^rose/w/sfe^""Zn3c/n'a、四肩哭四孝便'菜(7V^ose/w7^fefra仏e/e)、J"erase/柳'sverwcosa、r掛ase/柳iverwcosaiw6ms或re^ose/附"sp.或净果'藻牙牛(五wg7e打aceae)的'藻类，侈1^口嚢月包'藻属(^scog/e"")、变胞藻属(血az'a)、柄棵藻属(Co/""'w附)、长梭藻属(Qyc/zWo/w&)、棵条属(五wg/e"a)、才以净果藥属(Ewg7e"o/w&)、外a/0/7/2acws、卡克藻属(A7/awA7'"efl)、鳞孑L藻属(i^po""cfo)、扁净果藻属(尸/2acw力、陀螺藻属(5Vram6omowa5)或嚢棵藻属(rrac/ze/omo"os),例如梭形棵藻(五wg/e"fl、膝曲棵藻(五wg7e"age"/cw/ato)、纤细棵藻grac/to)、五wg/ewam/xoqy/zWracea、五wg/ewams//^ra、绿色棵藻v/n'cfc1)、Go/ac/w附ste"^rz'ww、圆斗主囊净果'蓬(7Vac/2e/o附o"oscW"t/n'c")或旋转嚢棵藻(rrac/7e/owo"osvo/vo"."")。所用的核酸最好来源于棵藻属(五wg7e"")、Mi"tom'e〃a或(9sfreococcus。更多有利的植物是藻类(例如等鞭金藻属或隐甲藻属)、藻类/硅藻类(例如海链藻属(77^/osw'ow'ra)或褐指藻属(尸/^eodac/y/wm))、莒藓类(例如剑叶藓属或角齿藓属)或高等植物(例如报春花科CFWww/ace"e)，例如J/ewnY/a、C"/e"dw/"他〃"to、(9他as^emww一"eyce附或C^teos/emmw7Zz;;aserazVfey)、樣i生物(例如真菌，例如曲霉、破嚢壶菌、疫霉、虫霉、毛霉或被孢霉，细菌(例如希瓦氏菌、酵母)或动物(例如线虫，例如新小杆线虫、昆虫、蛙、鲍鱼或鱼)。本发明分离的核酸序列最好来源于脊推动物门。优选的核酸序列来源于脊推动物纲；五w化/easto附/,辐鳍亚纟冈(Jc"w0p&;7g");伟斤鳍亚纟冈(iVeo;^eo^");石更骨鱼纲(7WeosfeO;五wfe/eos的'、原鳍鱼总目CPrataccmf/zop&o^")、鲑形目(Sa/,wybr膨s);鲑科(&/附0"油6)或大麻哈鱼属(0""0咖"^—或脊推动物亚门(J^We6rato)、两栖纲(Jm/9/w力/a)、无尾目(^"wra)、负子蟾科(/V/cfae)、爪蟾(xe"opw力或无脊推动物(五veWe6rato)例如原索动物门(尸ratoc/on/ato)、4皮嚢亚门(r"m'cato)、》每参纲(7i/o/(^/mro/dea)、；每革肖牙牛(CVomV^ae)例如星座歹l)4青海革肖(^附arawc/w附c<myfe〃a,ww)、史氏菊海鞘(5o吵〃船sc/z/o5^eW)、玻璃海鞘(C7cwaz'她幼'wafc)、Mo/gw/acz7r/wa、曼哈顿皮海革肖(Mo/gw/a,"/z""ms7》、连茎海鞘(尸era//zora由'cfo)或裂柄海鞘(5^e/a/aW/to)。核酸特别有利的是来源于真菌、动物或植物(例如藻类或苔藓类)，优选来源于鲑形目(&/mo"z/o/7was),例如鲑科例如斑鳟属(Sa/mo),例如虹鳟(O7cor/2y"c/7usw;;Hs^)、欧鳟(7Vw加？rw"a)或河鳟(亦称亚东鲑，5"a/mo/a〃'o);藻类，例如Afo"/o"zW/a或Os/reococcw;或石圭藻类(例如海链藻属或褐指藻属)或藻类(例如隐曱藻属)。在一个优选的实施方案中，方法还包括得到包含获取方法所用核酸序列的细胞或完整生物的步骤，其中用本发明的核酸序列、如上所述的基因构建体或载体，单独或与更多的脂肪酸或脂质代谢的蛋白质的编码核酸序列一起转化细胞和/或生物，其中本发明的核酸序列编码A9-延伸酶、A8-去饱和酶和/或A5-去饱和酶。在另一个优选的实施方案中，该方法还包括从生物或培养物中获取油、脂质或游离脂肪酸的步骤。培养物可以例如是发酵培养物，例如是微生物培养物(例如被孑包霉、海链藻、她wto"/e〃a、O欲eococ譜、酵母或破嚢壶菌)或者是温室栽培的植物或大田栽培的植物。由此产生的细胞或生物最好是产油生物的细胞，所述产油生物例如油料作物，例如花生、白菜型油菜、甘兰型油菜、亚麻籽、大麻、花生、大豆、红花、大麻、向日葵或琉璃苣。就植物细胞、植物组织或植物器官而言，"生长"的含义可理解为例如完整植林生长在营养培养基上，或生长在基质上，例如生长在水培营养液中、盆栽土上或可耕土上。对于本发明的目的，"转基因"或"重组"是指例如核酸序列、表达盒(=基因构建体)或包含核酸序列的载体或由本发明核酸序列、表达盒或载体转化的生物，所有这些都通过重组方法而构建，其中a)本发明的核酸序列，或b)与本发明核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或c)a)和b)并非位于其天然遗传环境中或者以通过重组方法而修饰，其可能的》务饰形式为例如一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境的含义可理解为在原始生物中的天然基因组或染色体基因座或存在于基因组文库中。就基因组文库而言，优选保留、至少部分保留核酸序列的天然遗传环境。环境至少在一侧邻接核酸序列并且其序列长度为至少50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp。天然存在的表达盒-例如核酸序列的天然启动子与相应的A5-去饱和酶基因的天然组合-成为转基因表达盒，当该表达盒经诱变处理等非天然的合成("人工，，)方法修饰后。合适的方法可参见例如US5,565,350或WO00/15815。因此，用于本发明目的的转基因生物或转基因植物的含义可如上所述地理解为方法所用的核酸不在其生物基因组的天然基因座上，它可能与要表达的核酸同源或异源。然而，如上所述，转基因也意味着，尽管本发明核酸位于生物基因组的天然位置上，但相对于天然序列而言，其序列已经^务饰，和/或天然序列的调节序列已经》f饰。转基因的源表达)，或者优选该核酸发生异源表达。优选的转基因生物是真菌(例如被孢霉或疫霉)、莒藓类(例如剑叶藓)、藻类(例如M""tomW/a、棵藻、隐曱藻或a^eococcw"、硅藻类(例如海链藻或褐指藻)或植物(例如油料作物)。原则上说，用于本发明方法所用的核酸、表达盒或载体的生物或宿主生物最好是能合成脂肪酸、尤其是不饱和脂肪酸和/或适于重组基因表达的所有生物。可提及的实例是植物，例如拟南芥04ra&Wop^)、菊科(例如金盏草)或栽培植物(例如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻、白菜型油菜、椰子、油棕、红花(CaW/zawmsWwctoh附)或可可豆)；微生物，例如真菌，例如被孢霉属、破嚢壶菌属、水霉属(5"apra/egw'a)、疫霉属或腐霉属)；细菌(例如埃希氏菌属或希瓦氏菌属)；酵母，例如酵母属；蓝细菌属(Qva"o6a"eWa);纤毛虫；藻类(例^口^Wa"tomW/a、净果藻属、海链藻属或Os^reococcw力；或原生动物，例如沟鞭藻(&"0^^^//"^),例如隐曱藻。优选的生物是能天然合成大量油的生物，例如真菌(例如高山被孢霉(Mo^ere/Zaa//z>za)、间型腐霉(尸;^/z/ww/"^7we&wm)、致病疫霉(尸/z少top/ztora/"7festa"力或才直物(例如大豆、白菜型油菜、椰子、油棕、红花、亚麻、大麻、蓖麻油植物、金盏草、花生、可可豆或向日葵)、或酵母(例如酿酒酵母)，其中特别优选大豆、亚麻、白菜型油菜、红花、向日葵、金盏草、被孢霉或酿酒酵母。原则上说，除了上述转基因生物之外，宿主生物也是转基因动物，最好是非人类动物，例如秀丽新小杆线虫(C.e/egara)、玻璃海孝肖(CVo"az'"加""afe)或非洲爪蟾(Ze"o/ms/aev&)。更多可用的宿主细胞详见Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，CA(1990)。可以使用的表达抹系例如具有较低蛋白酶活性的那些，详见Gottesman,S.，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，California(1990)119-128。它们包括呈所有表型形式的植物细胞和植物的某些组织、器官和部分，例如花药、纤维、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶(cotelydon)、叶柄、收获材料、植物组织、繁殖组织和细胞培养物，其来源于真正的转基因植物和/或可用于产生转基因植物。包含由本发明方法合成的多不饱和脂肪酸的转基因植物最好是直接上市，而无需分离其合成的油、脂质或脂肪酸。列举的用于本发明方法的植物可以是完整植物和所有植物部分、植物器官或植物部分，例如叶、茎、种子、根、块茎、花药、纤维、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获材料、植物组织、繁殖组织和细胞培养物，其来源于真正的转基因植物和/或可用于产生转基因植物。在这种情况下，种子包含种子的所有部分，例如种皮、表皮细胞、种子细胞、胚乳或胚组织。然而，也可从生物、最好是植物中分离出由本发明方法产生的化合物，其形式是油、脂、脂质和/或游离脂肪酸。可通过从生长的庄稼或从大田收获生物来获取该方法产生的多不饱和脂肪酸。可以通过压搾或提取植物部分(优选植物种子)来获取多不饱和脂肪酸。在这种情况下，可以通过无需加热的冷轧法或冷榨法，而获取油、脂、脂质和/或游离脂肪酸。为了更容易地破碎植物部分(尤其是种子)，可以先对其进4于4分碎、蒸煮或焙烤。然后，对经该方式预处理的种子进行压榨或用溶剂(例如热己烷)萃取。之后去除溶剂。就微生物而言，在收获后，后者无需进一步加工步骤而直接提取，或者在》皮碎后用才支术人员熟悉的各种方法进行提取。按照该方式，可以分离出超过96%的该方法所产生的化合物。然后，对所得产物进行进一步加工，即精制。在该方法中，先除去植物粘液和悬浮物等物质。通过添加磷酸等酸，可以经酶促或理化反应达到被称为脱泥(desliming)的目的。然后，用氢氧化钠溶液等碱处理，除去游离脂肪酸。所得产物用水充分洗涤以除去产物中残留的^5成，然后干燥。为了除去产物中残留的色素，将产物漂白，例如使用填充土(filler，searth)或活性炭。最后，用蒸汽使产物脱臭。可从生物中分离出本发明方法产生的脂肪酸，其形式是油、脂质或游离脂肪酸。合适的生物是例如上述生物。优选的生物是转基因植物。因此，本发明的一个实施方案是经上述方法产生的式I的油、脂质或脂肪酸或其片段，特别优选包含式I的化合物并且来源于转基因植物的油、脂质或脂肪酸组合物。本发明的另一个实施方案是油、脂质、脂肪酸和/或脂肪酸组合物在饲料、食品、化妆品或药品中的用途。本发明的油、脂质、脂肪酸或脂肪酸混合物可以技术人员熟悉的方式用于与动物来源的其它油(例如鱼油)、脂质、脂肪酸或脂肪酸混合物混合。这些由植物或动物成分组成的油、脂质、脂肪酸或脂肪酸混合物也可用于制备祠料、食品、化妆品或药品。术语"油"、"脂质"或"脂"的含义可理解为包含不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸、优选酯化脂肪酸的脂肪酸混合物。油、脂质或脂优选含大量的多不饱和游离脂肪酸、最好是酯化脂肪酸、尤其是亚油酸、？亚麻酸、二高-y-亚麻酸、花生四烯酸、a-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。不饱和酯化脂肪酸含量优选达约30%,更优选含量为50%,甚至还更优选含量为60%、70%、80°/。或更高。对于分析而言，可以通过例如气相色谱，通过转酯作用将脂肪酸转化为甲基酯，来测定脂肪酸。油、脂质或脂可包括各种其它饱和或不饱和脂肪酸，例如桐油酸(calendulicacid)、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸等。油脂中的各种脂肪酸含量各不相同，尤其因起始生物不同而异。本发明方法产生的ARA可以如上所述地呈脂肪酸衍生物的形式，例如神经鞘脂(sphingolipid)、磷酸甘油酯、脂质、糖脂、磷脂、单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油或其它脂肪酸酯。可通过例如碱(例如含水KOH或NaOH)处理或酸水解，最好在甲醇或乙醇等醇存在下，或通过酶切，释放ARA和存在的其它多不饱和脂肪酸，并且通过相分离等方法而分离，然后用H2S04等进行酸化。无需以上处理步骤也可释放脂肪酸。将本发明方法所用的核酸引入生物(最好是植物细胞或植物)之后，其可存在于分离的质粒上，或者最好整合到宿主细胞基因组上。就整合在基因组上而言，整合可以是偶然的，或者通过重组使天然基因被引入的拷贝替代而达到，因此细胞产生所需混合物的产量可以调节，或者通过使用基因(反式)，使基因与功能表达单元有效连接，所述单元包含至少一个确保基因表达的序列和至少一个确保功能性转录基因聚腺苷酸化的序列。核酸最好通过多表达盒或构建体？1入到生物中，可进行多平行表达，最好是引入植物中，进行基因的多平行的种子特异性表达。如果酵母(例如酵母属或裂殖酵母属)、真菌(例如被孢霉属、曲霉属、疫霉属、虫霉属、毛霉属或破嚢壶菌属)、藻类(例如等鞭金藻属、Ma"to"/e〃a、净果藻属、a^reococcws、褐指藻属或隐曱藻属)等樣丈生物作为本发明方法所用的生物，则这些生物最好生长在发酵培养物中。如果微生物作为本发明方法所用的生物，则它们生长或培养的方式是技术人员熟悉的，这取决于宿主生物。通常，微生物在液体培养基中培养，其中含有碳源(通常是糖形式)、氮源(通常是酵母膏等有机氮源形式，或硫酸铵等盐形式)、微量元素(例如铁、锰和镁的盐)和维生素(如果合适的话)，温度介于(TC-10(TC之间，优选介于10°C-60°C之间，同时通入氧气。液体培养基的pH可保持恒定(即在培养期间进行调节)或不保持恒定。培养可以是分批、半分批或连续培养。可以在发酵开始提供营养，或者以半连续或连续方式加料。如上所述，可通过提取、蒸馏、结晶、盐沉淀(如果合适的话)和/或色谱等技术人员已知工艺，从生物中分离所产生的多不饱和脂肪酸。为此，最好事先破碎生物。如果宿主生物是孩i生物，本发明的方法最好在介于0。C-95。C之间的温度进行，优选介于1(TC和85。C之间，特别优选介于15。C和75。C之间，非常特别优选介于15。C和45。C之间。在该方法中，pH值最好保持在pH4-12，优选pH6-9，特别优选pH7-8。本发明的方法可分批、半分批或连续才喿作。有关已知培养方法的概述可参见以下教科书Chmiel(Bioprozei3technik1.EinfUhrungindieBioverfahrenstechnik[Bioprocesstechnology1.IntroductiontoBioprocesstechnology](GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991》或Storhas(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen[Bioreactors和peripheralequipment](ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994》。所用的培养基必须适当地满足所用菌株的需要。各种微生物培养基的介绍可参见以下教科书"ManualofMethodsftirGeneralBacteriology".AmericanSocietyforBacteriology(WashingtonD.C.，USA，1981)。如上所述，可用于本发明的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无^l盐、维生素和/或;微量元素。优选的碳源是糖，例如单糖、双糖或多糖。非常好的碳源的实例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。也可通过复杂化合物(例如糖蜜或糖精制过程的其它副产品)将糖添加到培养基中。最好也添加不同碳源的混合物。其它可能的碳源是油和脂(例如豆油、向日葵油、花生油和/或椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和/或亚油酸)、醇和/或多元醇(例如甘油、曱醇和/或乙醇)和/或有机酸(例如乙酸和/或乳酸)。氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的材料。氮源的实例包括液态或气态形式的氨或铵盐(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵)、硝酸盐、尿素、氨基酸或复杂氮源(例如玉米浸膏、大豆粉、大豆蛋白、酵母膏、肉膏等)。氮源可单独使用或混合使用。培养基中可含有的无机盐化合物包括钾、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐和硫酸盐。无机含硫化合物(例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物)或有机硫化合物(例如硫醇类(mercaptans)和硫醇类(thiols))都可用作疏源，用于产生含硫精细化学品，尤其是甲硫氨酸。磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可用作磷源。螯合剂可添加到培养基中，以维持溶液中的金属离子。特别合适的螯合剂包括二羟基苯酚(例如邻苯二酚或原儿茶酚)和有机酸(例如柠檬酸)。本发明所用的用于培养微生物的发酵培养基通常还包含其它生长因子，例如维生素或生长促进剂，其包括例如生物素、核黄素、疏胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐通常来自复合培养基成分，例如酵母膏、糖蜜、玉米浸膏等。而且，可以将合适的前体添加到培养基中。培养基化合物的准确组成极大地取决于具体实验，每次具体情况都要分别确定。培养基优化的信息可参见教科书"AppliedMicrobiol.Physiology,APracticalApproach"(P.M.Rhodes,P.F.Stanbury编著，IRLPress(1997)第53-73页，ISBN0199635773)。生长培养基也可得自供应商，例如Standard1(Merck)或BHI(脑心浸汁，DIFCO)等。通过加热(20min,1.5bar和121。C)或过滤除菌，将所有培养基组分灭菌。各组分可以一起灭菌，或者视需要分开灭菌。所有培养基组分可以在培养开始时就存在，也可以视需要连续或分批添加。培养温度通常介于15。C-45。C之间，优选25。C-40。C,并可维持恒定，或在实验期间变温。培养基的pH范围应当在5-8.5，优选在7.0左右。在培养期间可以通过添加石威性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨、氨水)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)，来控制培养pH。通过使用消泡剂(例如脂肪酸聚乙二醇酯)控制泡沫。为了维持质粒稳定性，可向培养基中添加具有选择性效应的合适物质，例如抗生素。通过向培养物内通入氧气或含氧的混合气体(例如周围空气)，维持需氧条件。培养物的温度通常为20°C-40°C，优选25。C-4(TC。持续培养，直到形成的所需产物达到最大值。在10-160小时内通常都能达到该目的。按照该方法得到的发酵肉汤、尤其是含多不饱和脂肪酸的肉汤，通常含有7.5-25%干物质(重量)。发酵肉汤还可进一步处理。按照需要，可以通过离心、过滤、倾析或这些方法的组合等分离方法，从发酵肉汤中完全或部分除去生物量，或将其完全留在所述肉汤中。最好在分离后处理生物量。然而，也可用已知方法浓缩发酵肉汤，例如借助于旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器、反渗透或纳米过滤。最终，可以处理该浓缩发酵肉汤，获取其中存在的脂肪酸。从该方法得到的脂肪酸也适合作为原料，用于更多目标产物的化学合成。例如，它们可组合或单独用于制备制备药品、食品、动物饲料或化妆品。本发明方法所用的所有核酸序列最好都来源于真核生物，例如植物、孩i生物或动物。核酸序列优选来源于鲑形目(Sa/wow/orm&y)，藻类(例如AfowtowW/a、隐甲藻属、净果藻属或Os^eococcw力，真菌(例如疫霉属)或硅藻类(例如海链藻属或褐指藻属)。参考以下实施例和，可以更详细地介绍本发明，其中图1显示-6和(o-3脂肪酸生物合成的各种合成途径。图2是气相色谱图，显示在经半乳糖(图2A)或葡萄糖(图2B)诱导的酵母中，通过海生鞭孢簇虫A9-延伸酶序列(SEQIDNO:1，残基7668-9200)的异源表达，将A9，12-18:2(亚油酸)转化成A11,14-20:2。实施例1-来源于海生鞭孢簇虫的FAE1延伸酶的克隆海生鞭孢蔟虫是牡蛎的原生动物寄生虫，它能合成饱和和不饱和脂肪酸，包括必需脂肪酸花生四烯酸[20:4(w-6)]。海生鞭孢簇虫使用△-8(delta-8)去饱和酶途径合成花生四烯酸。材料与方法海生鞭孢蔟虫的生长和收获在28°C，在按照LaPeyre等(JEukaiyotMicrobiol1993;40:304-10)所述制备的培养基中培养海生鞭孢簇虫分裂体，所述培养基含有氨基酸、核苦酸、碳水化合物和维生素，不含胎牛血清。核酸操作和基于PCR的克隆用DNeasyDNA小型试剂盒(minikit)(Qiagen)从细胞中提取DNA。用对A5去饱和酶基因具有特异性的引物，按以下步骤扩增DNA:将反应物加热至95。C2min,再在95°C1min、52。C2min和72。C4min进行35次循环，然后在72°C5min—次。将PCR扩增产物克隆到TOPO载体(Invitrogen)中，经过测序而"^正实。用"&计用于编码区5'和3'端的基因特异性引物(表I)扩增FAE延伸酶基因，其限制位点便于克隆到酵母载体中(表I)。经设计，用于克隆到酵母表达载体pYES2(Invitrogen)中的正向引物在位置-3含有G/A，而在位置+4含有G，以便改进在真核细胞中的翻译起始。用于该项研究的寡核苷酸引物用逆转录酶PCR(RT-PCR)分析海生鞭孢簇虫的转录物。用RNeasy植物小型试剂盒(plantminikit)(Qiagen)，从细胞中提取总RNA。按照制造商的使用说明，用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒(Amplificationkit)(BD画Clontech,Basingstoke,UK)，自总RNA合成cDNA的第一条链。用以下引物扩增单链cDNA。FAE操纵子正向5，-GGAATTCGAGGAGTAGGATCTTATCTGAGGATAGTCACACTAGTCGTACT-3'FAE操纵子反向5，-CATCTGCGAATACTAACCATACATT将反应物加热至95。C2分钟，再在94。C30秒，55-72。C的温度范围30秒(按照引物设计)和72°C2分钟进行35次循环，然后在72°C10分钟一次。将PCR扩增产物克隆到TOPO载体(Invitrogen)中，经过测序而证实。令人吃惊的是，A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶的转录物显示出都存在于同一mRNA上。这是显示PUFA基因组织在操纵子样结构中的第一个实例。在另一项研究中，分析了A9-延伸酶的特异性。为了该目的，通过如上所述的RT-PCR，用以下引物扩增该基因的编码序列。Elo2正向5，-ATGCAAGTTCCCGCGGAGCATCACTCC-3'Elo2反向5，-CGTTACGCATCAATATTATGCATAGCCAACC-3'按照制造商(Stratagen)的推荐，将扩增的PCR产物再克隆到pCRscript载体中。在第二个PCR步骤中，用以下引物引入修饰的序列，用于酵母表达。酵母表达KpnElo2正向5，-TTGGTACCATGGGATTTCCTGCGGAG-3'SacElol反向5，-GGGAGCTCTTACGCATCAATATTATGCATAGC-3，所给出的引物序列是从5，至3'方向用于克隆的限制位点用粗体字显示。结果从海生鞭孢簇虫中分离FAE1延伸酶.使用来自TIGR所进行的海生鞭孢簇虫基因组测序计划的公众可得的数据(http://www.tigr.org/tdb/e2kl/pmg/),我们鉴定了一个重叠群(contig)(1047306867),其显示出与已知延伸酶的显著同源性，其耙序列(称为ElolFor,SEQIDNO:9)由511个残基的可读框组成，没有内含子。由把序列获得的推定氨基酸是SEQIDNO:10。酿酒酵母的功能特性将对应于推定A9脂肪酸延伸酶(SEQIDNO:9)的全长cDNA克隆到酵母表达载体pYES2中，得到称为pYPmFAE的构建体。用pYPmFAE或空载体作为对照，转化酿酒酵母(51.ce"v^ae)菌林W303-1A。将转化细胞培养在含棉子糖的基本培养基中并用2°/。半乳糖进行诱导。培养48小时后，提取总酵母脂肪酸，用GC分析所得FAME。GC分析(图2)表明，用pYPmFAE转化的酵母细胞产生额外的脂肪酸，经鉴定为二十碳二烯酸，这表明我们克隆的基因编码A9脂肪酸延伸酶。表达海生鞭孢簇虫A9脂肪酸延伸酶的酵母细胞能够识别C18:2(c9,12)底物，其转化率为8.2%。表1显示用pYPmFAE(+)或空载体pYES2(-)转化并用2%半乳糖诱导的酵母细胞的脂肪酸含量。通过例如下列公式计算出18:2化12转化为20:2^'14的转化百分率转化率(％)=[18:2,]+[20:严]<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>表1所示的结果表明没有检出20:4A"'u'"的延伸酶活性，而对于18:3"，9，12有最小活性(1°/。转化)。由此看来，A9脂肪酸延伸酶对亚油酸具有选择性，而并不延伸其它PUFA。权利要求1.一种分离的核酸序列，其编码具有Δ9-延伸酶、Δ8-去饱和酶和Δ5-去饱和酶活性的多肽并且其选自a)包含SEQIDNO1的核酸残基7668-12077或其同源物的核酸序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO1的核酸残基7668-12077的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有Δ9-延伸酶、Δ8-去饱和酶和Δ5-去饱和酶活性的多肽，其中所述多肽选自SEQIDNO2、3和4；d)SEQIDNO1的核酸序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO2、SEQIDNO3和SEQIDNO4具有至少40％同一性；其中所述多肽具有Δ9-延伸酶、Δ8-去饱和酶和Δ5-去饱和酶活性。2.—种分离的核酸序列，其编码具有A9-延伸酶活性的多肽并且其选自a)包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-9200、SEQIDNO:9或其中之一的同源物的序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的残基7668-9200或SEQIDNO:9的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A9-延伸酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:10;d)包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-9200或SEQIDNO:9的序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:2或SEQIDNO:10具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶活性。3.—种分离的核酸序列，其编码具有A8-去饱和酶活性的多肽并且其选自a)包含SEQIDNO:1的核酸残基9351-10724或其同源物的序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的残基9351-10724的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A8-去饱和酶活性的多肽，其中所迷多肽包含SEQIDNO:3;d)包含SEQIDNO:1的核酸残基9351-10724的序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:3具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A8-去饱和酶活性。4.一种分离的核酸序列，其编码具有A5-去饱和酶活性的多肽并且其选自a)包含SEQIDNO:1的核酸残基10842-12077或其同源物的序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的残基10842-12077的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A5-去饱和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:4;d)包含SEQIDNO:1的核酸残基10842-12077的序列的书f生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所迷多肽具有A5-去饱和酶活性。5.由权利要求1-4中任一项的核酸序列编码的多肽。6.—种基因构建体，其包含权利要求1-4中任一项的核酸序列及与之有效连接的一个或多个调节序列。7.权利要求6的基因构建体，其还包含一个或多个编码酶的序列，所述酶催化ARA转化为co3-不饱和脂肪酸。8.权利要求7的基因构建体，其包含编码A5-延伸酶、co3-去饱和酶和/或A4-去々包和酶的序列。9.权利要求6-8中任一项的基因构建体，其还包含一个或多个选自以下的脂肪酸或脂质代谢的生物合成基因酰基-CoA脱氢酶、酰基-ACP[=酰基载体蛋白]去饱和酶、酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基-CoA:溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰-辅酶A羧化酶、酰基-辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸乙炔酶、脂肪氧合酶、三酰甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶和去饱和酶。10.—种载体，其包含权利要求1-4中任一项的核酸或权利要求6-9中任一项的基因构建体。11.一种转基因非人类生物，其包含至少一种权利要求1-4中任一项的核酸、权利要求6-9中任一项的基因构建体或权利要求10的载体。12.权利要求11的转基因非人类生物，所述生物是微生物、非人类动物或植物。13.权利要求22或12的转基因非人类生物，所述生物是植物。14.一种在生物体内将亚油酸或其^"生物转化为花生四烯酸或其衍生物的方法，所述方法包括向含有亚油酸的生物中引入至少一个包含以下的核酸序列a)SEQIDNO:1(全序列1047306867)、包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-12077的序列或其中之一的同源物；b)在严格性条件下与SEQIDNO:1的核酸序列或包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-12077的序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶活性的多肽，其中所述多肽选自SEQIDNO:2、3和4;d)SEQIDNO:1的核酸序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶、A8-去饱和酶和A5-去饱和酶活性；并且表达所述核酸序列。15.权利要求14的方法，所述方法还包括将ARA转化为Q)-3脂肪酸的额外步骤，即通过向所述生物引入①-3去饱和酶和任选A5-延伸酶和/或A4-延伸酶和/或A4-去饱和酶的编码核酸。16.—种将18:2維12(亚油酸)转化为20:2眠14的方法，所述方法包括向包含亚油酸的生物引入至少一个编码具有A9-延伸酶活性的多肽的核酸序列并且其包含a)包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-9200、SEQIDNO:9或其中之一的同源物的序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的残基7668-9200或SEQIDNO:9的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A9-延伸酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:10;d)包含SEQIDNO:1的核酸残基7668-9200或SEQIDNO:9的序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:2或SEQIDNO:10具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶活性；并且表达所述核酸序列。17.—种将20:2A"'"转化为20:3AS'"，"的方法，所述方法包括向包含20:2A1U4、或包含亚油酸和A9延伸酶的生物引入一种分离的核酸序列，所述核酸序列编码具有A8-去饱和酶活性的多肽并且选自a)包含SEQIDNO:1的核酸残基9351-10724或其同源物的序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的残基9351-10724的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A8-去饱和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:3;d)包含SEQIDNO:1的核酸残基9351-10724的序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:3具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A8-去饱和酶活性；和表达所述核酸序列。18.—种将20:3A8'1U4转化为20:4a5'8'11'14(ARA)的方法，所述方法包括向包含20:3純11，14、或者包含20:2Au'"和A8-去饱和酶、或者包含亚油酸、A9延伸酶和A8-去饱和酶的生物引入一种分离的核酸序列，所述核酸序列编码具有A5-去饱和酶活性的多肽并且选自a)包含SEQIDNO:1的核酸残基10842-12077或其同源物的序列；b)在严格性条件下与包含SEQIDNO:1的残基10842-12077的核酸序列杂交的核酸序列；c)一种分离的核酸序列，其编码具有A5-去饱和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:4;d)包含SEQIDNO:1的核酸残基10842-12077的序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A5-去饱和酶活性；并且表达所述核酸序列。19.权利要求18的方法，所述方法还包括将ARA转化为co-3脂肪酸的额外步骤，即通过向所述生物引入co-3去饱和酶和任选A5-延伸酶和/或A4-延伸酶和/或A4-去饱和酶的编码核酸。20.权利要求14-19中任一项的方法，所述方法还包括用半乳糖诱导的步骤。21.权利要求14-20中任一项的方法，其中所述生物是微生物、非人类动物或植物。全文摘要本发明涉及来源于海生鞭孢簇虫(Perkinsusmarinus)的核酸，其编码9-延伸酶、Δ8-去饱和酶和Δ5-去饱和酶。所有这些编码序列都可转录为单一转录物。文档编号C12N15/53GK101421399SQ200780013148公开日2009年4月29日申请日期2007年2月13日优先权日2006年2月16日发明者J·纳皮尔,M·贝内加斯卡莱伦,O·萨亚诺瓦申请人:罗塔姆斯特德研究有限公司