专利名称：用于处理生物体试样的处理液和用处理液的核酸检测方法
技术领域：
本发明涉及通过处理生物体试样(biological sample)制备得到用于靶核酸扩增反应的试样液(sample solution)的处理液(treatment solution)。此外，本发明涉及使用处理液来制备用于核酸扩增反应的试样液的方法。此外，本发明涉及使用处理液检测靶核酸(target nucleicacid)的方法。此外，本发明涉及在扩增靶核酸的方法中使用的试剂盒。
背景技术：
聚合酶链反应(polymerase chain reactionPCR)是通过DNA链中一条链的解离、相对DNA链中特定区域的引物的结合、由DNA聚合酶进行重复的DNA合成反应而使目的DNA片段指数级扩增的核酸扩增方法。此外，除了PCR方法以外，还有RT-PCR(ReverseTranscriptase-polymerase chain reaction)、NASBA(nucleic acidsequence based amplification)、LAMP(loop medited isothermalamplification of DNA)、TMA(Transcription MediatedAmplification method)和3SR(Self-Sustained SequenceReplication)等核酸扩增方法。
在所述核酸扩增方法中的核酸扩增反应容易受到生物体试样中含有的蛋白质等抑制核酸扩增反应的物质(下面，简称为“抑制物质”)的影响，这种抑制物质抑制核酸的扩增反应。所以，通常用核酸扩增方法检测核酸时，必需进行从生物体试样中提取或纯化所谓的DNA或RNA核酸成分的操作。可是，这种提取或纯化核酸成分的操作烦琐而且费时。作为省略提取或纯化核酸成分的操作、可以扩增靶核酸的方法，已知有在美国专利申请公开2005/008987号的说明书中记载的方法或在国际公开第00/08136号小册子中记载的方法。
美国专利申请公开2005/008987号的说明书中记载了通过用含有与抑制物质相互作用的盐的溶液处理生物体试样，降低抑制物质的影响、扩增靶核酸的方法。
此外，在国际公开第00/08136号小册子中记载了对存在于如粪便试样中的微生物的核酸进行扩增的方法，其中用有机溶剂洗涤试样去除抑制物质。具体而言，其中记载着当试样为粪便时，首先将粪便重悬到适当的缓冲液中，为去除大的固体物质而进行离心悬浊液，分离获取上清。然后，对离心分离得到的上清进行离心分离，舍弃上清，向残留的沉淀中加入有机溶剂，再次离心分离，实施洗涤，将微生物制备成沉淀回收，将其用作核酸扩增的试样。在国际公开第00/08136号小册子中，记载了作为有机溶剂可以利用乙醇、甲醇、2-丙醇、丙酮、乙腈(acetonitrile)、二甲亚砜(DMSO)等亲水性有机溶剂或丁醇、2-丁醇、醋酸乙酯等两性有机溶剂。此外，在国际公开第00/08136号小册子中记载了试样也可以是外科性地从生物中采取到的组织，当是组织这种固体的试样时，为了有助于洗涤而希望进行匀浆，对作为扩增对象的核酸是病原性微生物的基因或来自生物的基因等没有特别的限制。
不过，在国际公开第00/08136号小册子的方法中，想要扩增的并非是存在源于生物的组织(tissue)的微生物的核酸，而是要扩增来自生物的组织的核酸时，用所述有机溶剂洗涤匀浆后的组织之际，存在将抑制物质连同靶核酸一起除去而使能够回收的核酸减少的问题。
发明内容
本发明的第1个方面涉及用于制备处理生物体试样、通过使生物体试样中含有的核酸成分转移到处理液中的、用于核酸扩增反应的处理液，该处理液含有二甲亚砜和水系溶剂。
本发明的第2个方面涉及制备用于核酸扩增反应的试样液的方法，其包括下述工序供给含有二甲亚砜的用于处理生物体试样的处理液工序；和使用所述处理液处理生物体试样，使生物体试样中含有的核酸成分转移到处理液中，由此制备用于核酸扩增反应的试样液的工序。
本发明的第3个方面涉及核酸检测方法，其包括下述工序以含有二甲亚砜的用于处理生物体试样的处理液处理生物体试样，使生物体试样中含有的核酸成分转移到处理液中，由此制备用于核酸扩增反应的试样液的工序；扩增用于核酸扩增反应的试样液中含有的靶核酸的工序；和检测所扩增的靶核酸的检测工序。
本发明的第4方面涉及在扩增靶核酸的方法中使用的试剂盒，其中包括用于处理生物体试样，使生物体试样中含有的核酸成分转移到处理液中，由此制备用于核酸扩增反应的试样液的处理液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、和至少一种引物；所述处理液中含有二甲亚砜。
图1是表示实施例1的结果的图。
图2是表示在实施例2中用淋巴节作为生物体试样时的结果的图。
图3是表示在实施例2中用卵巢作为生物体试样时的结果的图。
图4是表示在实施例2中用肾脏作为生物体试样时的结果的图。
图5是表示在实施例2中用肺作为生物体试样时的结果的图。
图6是表示在实施例2中用肝脏作为生物体试样时的结果的图。
图7是表示在实施例2中用心脏作为生物体试样时的结果的图。
图8是表示在实施例2中用脾脏作为生物体试样时的结果的图。
图9是表示在实施例2中用胃作为生物体试样时的结果的图。
图10是表示在实施例2中用结肠作为生物体试样时的结果的图。
具体实施例方式
为了降低抑制物质的影响，用于处理生物体试样的处理液含有二甲亚砜。将通过该处理液处理生物体试样来制备的试样液用于核酸扩增反应，能够高效地回收既使是来自组织的核酸，并且能够有效地降低抑制物质在核酸扩增时的影响。
用于处理生物体试样的处理液是在水性溶剂中溶解了二甲亚砜的溶液。处理液中含有的DMSO的浓度优选1～50％(v/v)、更优选5～30％(v/v)、进一步优选10～25％(v/v)。使用含有所述浓度DMSO的处理液处理生物体试样，制备用于核酸扩增的试样液，通过将该试样液用于核酸的扩增反应，可以减少在核酸扩增反应中酶活性降低的危险，并且能够有效地减小核酸扩增时的抑制物质的影响。此外，为了防止用于核酸扩增反应的试样液中所含的核酸的分解，优选使用酸性的处理液。使用酸性的处理液时，处理液的pH值优选2.5～5.0、更优选3.0～4.0。
作为水性溶剂，可列举水或缓冲液。例如使用酸性的处理液时，作为水性溶剂，可以使用保持处理液的pH值为酸性的缓冲液。
此外，为了使用于核酸扩增反应的试样液中含有的核酸的量增加，优选处理液还含有表面活性剂。此处，作为处理液中含有的表面活性剂，优选非离子性表面活性剂。此外，非离子表面活性剂中优选聚环氧乙烯类非离子表面活性剂。特别优选下述通式所示的聚环氧乙烷类非离子表面活性剂R1-R2-(CH2CH2O)n-H(式中，R1是碳原子数10～22的烷基、烯基、炔基、异辛基；R2为-O-或-(C6H4)-O-；n是8～120的整数)。作为这种活性剂，可列举聚环氧乙烷十二烷基醚、聚环氧乙烷鲸腊醚、聚环氧乙烷油醚、聚环氧乙烷肉蔻醚、聚环氧乙烷十八烷醚、聚环氧乙烷壬基苯基醚、聚环氧乙烷异辛基苯基醚等。并且，希望处理液中含有的表面活性剂的浓度对应与所用的表面活性剂的种类而适当选择浓度。例如处理液中含有的非离子性表面活性剂的浓度优选0.1～6％(v/v)、更优选1～5％(v/v)。此外，处理液中还可以同时含有表面活性剂和消泡剂。
作为生物体试样，只要是从生物体中采取的试样即可，没有特殊的限定，例如可以列举从人或动物中采取的淋巴节等组织、全血、血浆、血清、尿、唾液、体液、分泌物等，此外，可列举从人或动物采取到的组织或细胞经培养得到的培养组织或培养细胞。此外，可列举来自植物或微生物等的非动物的试样。
用于核酸扩增反应的试样液是指生物体试样和用于处理生物体试样的处理液混合得到的溶液，包括在核酸的扩增反应中作为模板的核酸。将试样液和用于核酸扩增反应的试剂混合，用于核酸的扩增反应。在用于核酸扩增反应的试剂中含有脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶或RNA逆转录酶等酶、至少一种引物、能提供适合酶反应的条件的缓冲液等。将生物体试样和用于处理生物体试样的处理液混合，以此制备用于核酸扩增反应的试样液时，对含有靶核酸的细胞进行破碎或溶解等，使细胞内的核酸成分转移(Transfer)到处理液中。特别是，将以组织等固体试样作为生物体试样使用时，当将生物体试样和处理液混合制备试样液时，希望能通过匀浆或搅拌等使试样液均匀化。此外，为了去除细胞破碎物等比较大的夹杂物，在制备试样液时，也可以根据需要对均匀化的试样液实施过滤或离心分离等。
作为靶核酸，对其没有特殊限制，可列举来自生物体的DNA和RNA、微生物的DNA和RNA、来自植物的DNA和RNA等。
抑制物质是指抑制核酸的扩增反应的物质，例如可列举生物体试样中含有的蛋白质、脂质、糖类等。并且，从生物体试样中制备的用于核酸扩增反应的试样液中一旦含有抑制物质，就会使核酸扩增反应受到抑制物质的影响，进而受到抑制。
通过使用于核酸扩增反应的试样液中含有的抑制物质的浓度降低，能够使抑制物质的影响降低。作为使抑制物质的浓度降低的方法，可列举稀释用于核酸扩增反应的试样液。可是，稀释试样液也会使试样液中含有的靶核酸的浓度降低。特别是，生物体试样中的靶核酸的量少时，高倍率稀释会使用于核酸扩增反应的试样液中含有的核酸的浓度到达微量的程度。其结果导致扩增核酸需要长时间，低于核酸的扩增量的检出限度，不能扩增核酸等问题。所以，通过采用含有DMSO的用于处理生物体试样的处理液，即使不高倍率地稀释用于核酸扩增反应的试样液，也能降低试样液中含有的抑制物造成的影响。另外，通过有效地降低抑制物质的影响，用于扩增核酸的最佳的稀释倍率根据所用的生物体试样的量或种类而有所不同。所以，使用处理液从生物体试样中制备试样液时，希望根据所使用的生物体试样的量或种类的不同选择适当的稀释倍率。另外，可以用处理液进行稀释。
使用用于处理生物体试样的处理液从生物体试样中制备的用于核酸扩增反应的试样液可以用于公知的核酸扩增方法。例如可列举PCR(Polymerase Chain Reaction)、RT-PCR(ReverseTranscriptase-Polymerase Chain Reaction)、LAMP(loop mediatedisothermal amplification of DNA)、RT-LAMP(ReverseTranscriptase-loop mediated isothermal amplification of DNA)、TMA(Transcription Mediated Amplification method)、NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)、3SR(Self-Sustained Sequence Replication)、SDA(StandardDisplacement Amplification)、ICAN(Isothermal and Chimericprimer-initiated Amplification of Nucleic acids)等核酸扩增方法。此外，还可列举RCA(Rolling Circle Amplification)、INVADER、CPT(Cycling Probe Technology)、PALSAR(Probe Alternation LinkSelf-Assembly Reaction)等信号扩增方法。信号扩增方法是核酸扩增方法的一种。以信号扩增方法并不是扩增靶核酸，而是扩增与靶核酸互补的特定的碱基序列。另外，作为核酸扩增方法，优选PCR、RT-PCR、LAMP、RT-LAMP，此外，从迅速扩增核酸的观点出发，特别优选LAMP、RT-LAMP。
对检测所扩增的靶核酸的方法没有特别的限制，可以根据公知的方法检测。例如可以采用琼脂糖凝胶电泳法、采用荧光标记探针检测的实时检测法、检测DNA合成时产生的副产物的浑浊度进行检测的方法等。此外，根据需要可以使用确认经酶处理得到的核酸的切断后的条带来检测靶核酸的方法、或序列分析等测定碱基序列来检测靶核酸的方法以及其他的多种方法。此外当因为非特异的条带多而难以判断靶核酸的条带时，可使用与靶核酸所对应的探针，以Southern印记法等确认靶核酸条带。从快速检测核酸的观点出发，作为检测靶核酸的方法，特别优选通过使用的荧光标记的探针进行检测的实时检测方法，或检测合成DNA时生成的副产物的浑浊度的方法。
用于处理生物体试样的处理液可在利用核酸的扩增方法来判断疾病有无的临床检查中得到广泛的应用。作为这种疾病，可以列举感染性疾病、基因相关疾病、癌等。
癌细胞离开原发病灶部位，经过血流或淋巴系统转移到全身。在癌手术中，因为需要尽可能确实地摘除病灶，需求正确地检测出转移并根据转移的情况相应地采取适当的处置措施。所以，在手术中对向淋巴节的癌症转移诊断是具有非常重要的意义的。例如乳癌等，为了提高QOL(生活质量Quality of life)，希望尽可能地缩小手术中淋巴节的清除范围。此外，在食道癌中，根据淋巴节转移的部位需要对开腹、开胸、颈部切开进行选择。在前列腺癌中，如果存在淋巴节转移，会终止摘除手术，进行激素治疗之后再决定继续进行手术还是终止手术。此外，在胃癌中，根据有无向淋巴节的癌转移，其清除范围会有所不同，手术方式会有很大的变动。还有在胃癌中，有无向淋巴节的转移可作为术后治疗方针的指导，例如作为给予抗癌药物或放射治疗选择的指导。所述情况下，如果能够用手术中获取到的生物组织迅速诊断癌症的转移，即使在短时间的手术中也能判断淋巴节的清除范围、手术方式的变更、辅助疗法的选择等。对于患者而言，能够接受到最佳的治疗。此外，还可能减轻手术中患者的负担。
如果使用所述用于处理生物体试样的处理液，能够不进行核酸的抽提或纯化，迅速地从生物体试样中制备得到用于核酸扩增反应的试样液。所以，在对手术中使用核酸扩增方法的对诊断癌转移的快速性有要求的诊断时，使用用于处理生物体试样的处理液能特别有效。
作为癌指标的核酸，可列举细胞角质蛋白18、细胞角质蛋白19、细胞角质蛋白20等细胞角质蛋白类的核酸、CEA(癌胚抗原)、PSA(前列腺特异性抗原)、CA15-3(carbohydrate antigen 15-3)等肿瘤标记物。
(实施例1)在本例中，对用于处理生物体试样的处理液中含有的DMSO的效果进行了讨论。在本例中，使用含有DMSO的用于处理生物体试样的处理液，制备从生物体试样中用于核酸扩增反应的试样液，使用制备的试样液和用于核酸扩增反应的试剂进行RT-LAMP。
作为生物体试样，可以使用市售的培养细胞Molt-4细胞。Molt-4细胞是来自急性淋巴细胞白血病人的传代肿瘤细胞。
作为用于处理生物体试样的处理液，可以使用DMSO的浓度为0％(v/v)、5％(v/v)、10％(v/v)或20％(v/v)这4种不同的处理液。处理液的组成如下所示。处理液中含有作为表面活性剂的聚环氧乙烷(23)十二烷基醚的Brij35(Sigma-Aldrich Japan公司制造)。此外，还含有作为消泡剂的KS-538(信越化学工业公司制造)。试剂组成(用于处理生物体试样的处理液)甘氨酸缓冲液(pH3.0)200mMDMSO 0～20％(v/v)Brij35 5％(v/v)KS-53 80.05％(v/v)用β-肌动蛋白的RNA作为靶核酸，通过RT-LAMP扩增核酸。β-肌动蛋白在整个细胞中的表达量是一定的。
使用含有反应液、酶制剂以及序列号1～6所示的6种引物的引物试剂作为用于核酸扩增反应的试剂。各试剂的组成如下所示。试剂组成(反应液)750mM Tris缓冲液(pH8.0) 2.00μl
10×Thermopol缓冲液(New England Biolabratory公司制) 2.50μl10mM dNTPs2.00μl100mM MgSO40.75μl100mM二甲亚砜 1.25μl2％Tergitol(Sigma-Aldrich Japan公司制)2.50μlH2O 3.97μl总量 13.97μl试剂组成(酶试剂)10U/μl AMV反转录酶(Promage公司制)0.14μl8U/μl Bst DNA聚合酶(New England Biolabratory公司制) 2.27μlRNase inhibitor(Promage公司制)0.63μl总量 3.04μl试剂组成(引物试剂)80pmol/μl forward inner primer(序列号1) 1.00μl80pmol/μl reverse inner primer(序列号2) 1.00μl5pmol/μl forward outer primer(序列号3) 1.00μl5pmol/l reverse outer primer(序列号4) 1.00μl60pmol/μl forward loop primer(序列号5) 1.00μl60pmol/μl reverse loop primer(序列号6) 1.00μl总量 6.00μl(1)制备用于核酸扩增反应的试样液向300mg Molt-4细胞中加入4mL处理液，使用Microtech·nition公司制造的匀浆器，以25000rpm，破碎细胞90秒，使之均匀化。并且，离心分离均匀化的溶液(10000×g，1分钟)，得到上清。将得到的上清稀释1倍后，用作核酸扩增反应的试样液，用处理液再次稀释已经一倍稀释的试样液，制备2倍稀释、4倍稀释、8倍稀释、10倍稀释以及16倍稀释和稀释倍率不同的用于核酸扩增反应的试样液。
(2)RT-LAMP扩增核酸用β-肌动蛋白的RNA作为靶核酸，用RT-LAMP扩增核酸。首先，将13.97μl反应液、3.04μl酶试剂、6.00μl引物试剂混合，制备试剂混合液。然后相对于(1)中制备的各试样液2μl，各混合23μl试剂混合液，在65℃反应30分钟。使用TERAMECS公司制的Loopamp实时浑浊度测定装置(LA-200)检测扩增的核酸。该装置，在预先设定的温度下进行核酸扩增反应，通过同时检测扩增副产物的焦磷酸镁的白色浑浊，实时地检测核酸扩增反应。在本例中，设定温度为65℃，在混合用于核酸扩增反应的试样液和用于核酸扩增反应的试剂后测定30分钟内的吸光度。
图l是针对各试样液，用柱状图表示吸光度到达0.1时的时间。纵轴表示吸光度(Abs 650nm)到达0.1时的时间(分钟)。柱状图上部附有的涂黑的三角形标记表示反应时间(30分钟内)吸光度未到达0.1。横轴表示稀释倍率。各个稀释倍率的柱状图，从左侧开始分别为使用DMSO浓度为0％的处理液时、使用DMSO浓度为5％的处理液时、使用DMSO浓度为10％的处理液时、使用DMSO浓度为20％的处理液时的情况。
在图1中，在稀释倍率比较低的试样液(1倍稀释、2倍稀释、4倍稀释)中，与使用不含DMSO的处理液时(DMSO的终浓度为0％时)相比，使用含有DMSO的处理液(即DMSO的终浓度为5％、10％和20％时)的情况下，吸光度到达0.1的时间变短。此处，稀释倍率越低，试样液中的抑制物质的含量越高。由此可知通过向用于处理生物体试样的处理液中添加DMSO，能够降低试样液中的抑制物质的影响。
此外，分别比较DMSO的浓度为5％、10％和20％时吸光度到达0.1的时间，DMSO的浓度为20％时，低稀释倍率所用的时间最短。特别是，即使在1倍稀释倍率时，吸光度到达0.1时的时间大约为22分钟，非常短。由此可知，在DMSO的浓度为20％时，能够更有效地降低试样液中抑制物质的影响。
在图1中，在稀释倍率比较高的试样液(8倍稀释、10倍稀释、16倍稀释)中，即使是使用不含DMSO的处理液时，吸光度到达0.1的时间与含有DMSO时的缩短程度相同。认为是因为高倍率的稀释能使试样液中含有的抑制物质的浓度降低，所以降低了与之相伴的抑制物质的影响。
(实施例2)在本例中，以多种组织作为生物体试样，使用含有DMSO的用于处理生物体试样的处理液，进行RT-LAMP。
作为生物体试样，使用从1只小鼠中摘取的9种组织(淋巴节、卵巢、肾脏、肺、肝脏、心脏、脾脏、胃、结肠)。
作为用于处理生物体试样的处理液，使用如下所示组成的含有20％(v/v)DMSO的缓冲液。
试剂组成(用于处理生物体试样的处理液)甘氨酸缓冲液(pH 3.0) 200mMDMSO 20％(v/v)Brij355％(v/v)KS-5380.05％(v/v)以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的RNA作为靶核酸，以RT-LAMP扩增核酸。GAPDH在整个细胞中的表达量是一定的。
使用在实施例1中使用的反应液、在实施例1中使用的酶试剂、以及含有如下所示组成的序列号7～12所示的6种引物的引物试剂作为用于核酸扩增反应的试剂。
试剂组成(引物试剂)80pmol/μl forward inner primer(序列号7) 1.00μl80pmol/μl reverse inner primer(序列号8) 1.00μl5pmol/l forward outer primer(序列号9) 1.00μl5pmol/μl reverse outer primer(序列号10) 1.00μl60pmol/μl forward loop primer(序列号11) 1.00μl60pmol/μl reverse loop primer(序列号12) 1.00μl总量 6.00μl(1)制备用于核酸扩增反应的试样液向300mg的各组织中分别加4mL处理液，使用Microtech·nition公司制造的匀浆器，以25000rpm，破碎细胞90秒，使之均匀化。并且将均匀化的各溶液离心分离(10000×g，1分钟)，得到各上清。将得到的上清用处理液分别稀释10倍，将其用作核酸扩增反应的试样液。
(2)RT-LAMP扩增核酸在本例中，用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的RNA作为靶核酸，以RT-LAMP扩增核酸。首先，将13.97μl反应液、3.04μl酶试剂、6.00μl引物试剂混合，制备试剂混合液。然后相对于(1)中制备的各试样液2μl，各混合23μl试剂混合液，在65℃反应30分钟。使用TERMECS公司制的Loopamp实时浑浊度测定装置(LA-200)检测扩增的核酸。在本例中，设定温度为65℃，在将试样液和用于核酸扩增反应的试剂混合后，测定30分钟内的吸光度。此外，用ApplideBiosystems公司制的Rodent Total RNA代替试样液作为阳性对照，用处理液代替试样液作为阴性对照。
图2～图10表示扩增各组织的GAPDH cDNA的图。在任意一个图中，纵轴表示吸光度(Abs 650nm)，横轴表示时间(分钟)。图2是用淋巴结、图3是用卵巢、图4是用肾脏、图5是用肺、图6是用肝脏、图7是用心脏、图8是用脾脏、图9是用胃、图10是用结肠作为生物体试样时的结果。在各图中，黑色圆形表示各组织的图，空心的圆形表示阳性对照的图，黑色三角形表示阴性对照的图。
从图2～图10可知，在用作生物体试样的任一组织中，其cDNA扩增的上扬时间或扩增的cDNA量和阳性对照具有类似的结果。在阳性对照中不含有抑制物质。综上所述，可知通过使用用于处理生物体试样的处理液，能够降低抑制物质对任一组织的影响，可以扩增靶核酸。
(实施例3)在本例中，使用含有20％(v/v)DMSO的用于处理生物体试样处理液从生物体试样中制备用于扩增核酸反应的试样液，用制备得到的试样液和市售的试剂进行RT-PCR。
作为生物体试样，使用临床上确认癌转移的人淋巴节(A)、(B)、(C)、(D)以及(E)。此外，作为阳性对照使用正常的人淋巴节(F)、(G)和(H)。
作为用于处理生物体试样的处理液，使用和实施例2相同的处理液。
用细胞角质蛋白19(CK19)的RNA作为靶核酸，通过RT-PCR法扩增核酸。CK19表达于上皮细胞中，在确认癌转移的淋巴节等组织中也有表达，此外，已知在正常组织和癌组织中CK19的表达量存在差异。在本例中使用序列号13～15所示的3种引物。
使用Applied biosystems公司制的TaqMan One-step RT-PCRMaster Mix Reagents和Applied biosystems公司制的实时定量PCR装置(ABI PRISMR 7700)进行RT-PCR。TaqMan One-step RT-PCR MasterMix Reagents是由2×Master Mix与40×RNase inhibitor Mix组成的用于RT-PCR的试剂盒。此外，预先设定温度和时间，用ABI PRISMR7700进行核酸扩增反应，通过检测伴随核酸扩增而增大的荧光强度，可以对扩增的核酸进行定量。
(1)制备用于核酸扩增反应的试样液向300mg生物体试样(A)～(H)中加入4mL处理液，使用Microtech·nition公司制的匀浆器，在25000rpm下破碎细胞90秒，使之均匀化。然后，将均匀化的各溶液离心分离(10000×g，1分钟)，用处理液10倍稀释得到的上清，将其作为粗制的mRNA试样液(A)～(H)。然后，用QIAGEN公司制的Rneasy Mini试剂盒从所述上清中纯化mRNA，将其作为纯化mRNA试样液(A)～(H)。从所述上清中纯化mRNA制备纯化mRNA试样液所需要的时间大约为60分钟。
(2)通过RT-PCR扩增核酸在本例中，将(1)中制备的粗制mRNA试样液(A)～(H)以及纯化mRNA试样液(A)～(H)用作核酸扩增反应的试样液进行RT-PCR。RT-PCR反应如下在48℃下进行30分钟的反转录反应，在95℃下保持10分钟后，然后进行40个循环的在95℃下15秒和在60℃下1分钟的操作。将含有Master Mix、RNase inhibitor Mix以及3种引物的反应液与用于核酸扩增反应的试样液混合后，制备成最终组成为1×Master Mix、1×RNase inhibitor Mix、300nM forward primer(序列号13)、300nM reverse primer(序列号14)、200nM Taq Man Probe(序列号15)。
表1
表1表示在各试样中通过扩增反应扩增得到的CK19的cDNA量(拷贝/反应)。表中的cDNA量(拷贝/反应)表示扩增反应结束后混合液中含有的CK19的cDNA拷贝数。此外，表中的ND表示cDNA量不足102(拷贝/反应)，cDNA的量为这种程度时，可以认为未扩增出靶核酸。
从表1可知，比较使用粗制mRNA试样液(A)时和使用纯化mRNA试样液(A)时由RT-PCR扩增得到的CK19的cDNA量，各自具有非常相似的结果。此外，在(B)～(E)时也和(A)的情况一样，使用粗制mRNA试样液时和使用纯化mRNA试样液时，各自扩增的CK19的cDNA量表现出非常相似的结果。由此可知，将粗制mRNA试样液用作扩增核酸反应试样液，能够得到与使用纯化mRNA试样液相同量的扩增产物。对于用作阴性对照的试样液(F)～(H)的任何一个均未检测到CK19的cDNA扩增。
(实施例4)在本例中，使用含有表面活性剂的用于处理生物体试样的处理液从生物体试样中制备用于核酸扩增反应的试样液，测定制备得到的试样液中含有的RNA量。
从同一种属的4只小鼠(MRL小鼠)中采取淋巴节分别用作生物体试样。此外，作为用于处理生物体试样的处理液，使用含有DMSO以及表面活性剂的(I)～(IV)处理液。用于处理生物体试样的处理液的组成如下所示。各处理液中含有的表面活性剂的种类或浓度有所不同。处理液(I)含有1％(v/v)的聚环氧乙烷(9)异辛基苯基醚的Nonidet P-40。处理液(II)含有1.5％(v/v)聚环氧乙烷(23)十二烷基醚的Brij35。处理液(III)含有3％(v/v)Brij35。处理液(IV)含有5％(v/v)Brij35。
试剂组成(用于处理生物体试样的处理液)甘氨酸缓冲液(pH3.0) 200mMDMSO20％(v/v)表面活性剂 1～5％(v/v)KS-538 0.05％(v/v)(1)制备用于核酸扩增反应的试样液向各小鼠淋巴节中加入处理液(I)、(II)、(III)以及(IV)，使用Microtech·nition公司制的匀浆器，在25000rpm下破碎细胞90秒，使之均匀化。然后，将均匀化的各溶液离心分离(10000×g，1分钟)，将得到的各上清用作核酸扩增反应的试样液。在本例中，按照相对0.075mg的生物体试样加入大约1μL的处理液的比例，制备各试样液。
(2)RNA提取使用QIAGEN公司制造的Rneasy Mini试剂盒提取在(1)中得到的用于核酸扩增反应的试样液中含有的RNA。
(3)RNA的定量用处理液10倍稀释由所述方法得到的RNA提取液，通过测定该稀释试样的吸光度(Abs 280nm)定量RNA量，其结果如表2所示。
表2
表2表示将各淋巴节(mg)和各处理液(μL)混合时，最终得到的各试样中的RNA量(μg/mL)。表中分别用(I)表示使用处理液(I)、(II)表示使用处理液(II)、(III)表示使用处理液(III)、(IV)表示使用处理液(IV)时的情况。
由表2可知，使用处理液(I)时，RNA量为71μg/mL、使用处理液(II)时，RNA量为122μg/mL、使用处理液(III)时，RNA量为97μg/mL、使用处理液(IV)时，RNA量为115μg/mL，任一个核酸扩增反应均含足够量的RNA。
序列表<110>Sysmex公司<120>用于处理生物体试样的处理液和用处理液的核酸检测方法<130>2004-075JP<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据β-肌动蛋白基因设计的DNA<400>1tgaaggtagt ttcgtggatg cctgaggcac tcttccagc39<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据β-肌动蛋白基因设计的DNA<400>2tgaagtgtga cgtggacatc cagggtacat ggtggtgc 38<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据β-肌动蛋白基因设计的DNA
<400>3tggcaatgag cggttcc17<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据β-肌动蛋白基因设计的DNA<400>4tccttctgca tcctgtcg 18<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据β-肌动蛋白基因设计的DNA<400>5acaggactcc atgccc 16<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据β-肌动蛋白基因设计的DNA<400>6tgtacgccaa cacagtgc 18<210>7<211>38<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根据GAPDH基因设计的DNA<400>7cagaaggggc ggagatgatg caccaccatg gagaaggc38<210>8<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据GAPDH基因设计的DNA<400>8tgatgggtgt gaaccacgag gcaggatgca ttgctgac 38<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据GAPDH基因设计的DNA<400>9tgtcgtggag tctactgg 18<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据GAPDH基因设计的DNA<400>10gggggctaag cagttgg17
<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据GAPDH基因设计的DNA<400>11tggctccacc cttcaagtg 19<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据GAPDH基因设计的DNA<400>12aatatgacaa ctcactcaag a 21<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据CK19基因设计的DNA<400>13cagatcgaag gcctgaagga 20<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据CK19基因设计的DNA
<400>14cttggcccct cagcgtact 19<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据CK19基因设计的DNA<400>15gcctacctga agaagaacca tgaggaggaa 30
权利要求
1.一种处理液，用该处理液处理生物体试样，使生物体试样中含有的核酸成分转移到处理液中，由此制备用于核酸扩增反应的试样液，该处理液中含有二甲亚砜和水系溶剂。
2.权利要求1的处理液，其中，所述二甲亚砜的浓度为1～50％(v/v)。
3.权利要求1的处理液，其中还含有表面活性剂。
4.权利要求3的处理液，其中，所述表面活性剂为非离子性表面活性剂。
5.权利要求4的处理液，其中，所述非离子性表面活性剂为聚环氧乙烷类非离子性表面活性剂。
6.权利要求1的处理液，其中，所述水系溶剂是缓冲液，所述缓冲液保持处理液的pH值为酸性。
7.权利要求6的处理液，其中，所述pH为2.5～5.0。
8.权利要求1的处理液，其中，所述生物体试样是淋巴节。
9.制备用于核酸扩增反应的试样液的方法，其包括下述工序供给含有二甲亚砜的用于处理生物体试样的处理液的工序，和使用所述处理液处理生物体试样，使生物体试样中含有的核酸成分转移到处理液中，由此制备用于核酸扩增反应的试样液的工序。
10.权利要求9的制备试样液的方法，其中，所述处理液中含有的二甲亚砜的浓度为1～50％(v/v)。
11.权利要求9的制备试样液方法，其中，所述生物体试样为淋巴节，用所述处理液进行的处理是使淋巴节均匀化到处理液中。
12.一种核酸检测方法，其中包括下述工序用含有二甲亚砜的用于处理生物体试样的处理液处理生物体试样，使生物体试样中含有的核酸成分转移到处理液中，由此制备用于核酸扩增反应的试样液的工序；扩增用于核酸扩增反应的试样液中所含靶核酸的工序；和检测扩增得到的靶核酸的工序。
13.权利要求12的核酸检测方法，其中，所述的处理液中含有的二甲亚砜的浓度为1～50％(v/v)。
14.权利要求12的核酸扩增方法，其中，所述的扩增靶核酸的工序是将用于核酸扩增反应的试样液、和脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶以及至少一种引物混合，扩增靶核酸。
15.权利要求12的核酸检测方法，其中，所述的扩增靶核酸的工序是将用于核酸扩增反应的试样液、和脱氧核糖核苷三磷酸、RNA逆转录酶、DNA聚合酶以及至少一种引物混合，扩增靶核酸。
16.权利要求12的核酸检测方法，其中，所述的扩增靶核酸的工序是通过PCR(Polymerase Chain Reaction)、RT-PCR(ReverseTranscriptase-polymerse chain Reaction)、LAMP(Loop mediatedisothermal amplification of DNA)或是通过RT-LAMP(ReverseTranscriptase-loop mediated isothermal amplification of DNA)扩增靶核酸。
17.权利要求12的核酸检测方法，其中，所述的制备用于核酸扩增反应的核酸工序不提取或纯化核酸成分，制备用于核酸扩增反应的试样液。
18.一种在扩增靶核酸方法中使用的试剂盒，其中含有用于处理生物体试样，使生物体试样中含有的核酸成分转移到处理液中，由此制备用于核酸扩增反应的试样液的处理液；脱氧核糖核苷三磷酸；DNA聚合酶；和至少一种引物；所述处理液含有二甲亚砜。
19.权利要求18的试剂盒，其中还含有RNA逆转录酶。
全文摘要
本发明的目的是提供新型的生物体试样处理液，该处理液能够有效地回收来自组织在内的核酸，并且能有效地降低核酸扩增时抑制物质的影响；还提供使用该试剂制备用于核酸扩增反应的试样液的方法以及检测靶核酸的方法。本发明提供用于制备使生物体试样中含有的核酸成分转移到核酸扩增反应用试样的生物体试样处理液，其中含有二甲亚砜。此外，提供使用所述生物体试样处理液制备核酸扩增反应用试样，另外，还提供了使用所述生物体试样处理液检测靶核酸的方法。
文档编号C12P19/34GK1978666SQ200510128769
公开日2007年6月13日 申请日期2005年12月6日 优先权日2004年12月7日
发明者大友泰裕, 武田和彦, 阿部滋树, 中林一树 申请人:希森美康株式会社