专利名称：鼠源IgG核酸适配子及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及利用分子生物学技术--一系统进 化指数富集技术设计和制备一组与鼠源IgG高特异性和高亲和力结 合的鼠源IgG核酸适配子及其应用。背景技术：
鼠源IgG是用于抗原检测的单抗的主要种类，广泛应用于实验室 和临床诊断领域。其高特异性、高亲和性的配体，对于鼠IgG的分离 纯化以及检测具有重要意义，可替代生物医学研究中广泛使用的二 抗。SELEX技术(系统进化指数富集技术)是90年代初研制的一种 新的组合化学技术，其利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随 机寡核苷酸文库，其中随机序列一般长度在20 40bp左右，文库容 量在10" 1015之间，由于单链随机寡核苷酸片段特别是RNA易形成 发卡、口袋、假节、G-四聚体等二级结构，故能与蛋白质、小肽，甚 至金属离子结合，形成具有很强结合力的复合物。这种方法具有简便、 快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体 表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的核酸适配子具有许多 优势a.本身是寡核苷酸，分子量较小可以化学合成，节约成本；b. 具有比抗体更高的亲和性和特异性；c.便于标记，在不同部位有选择 性的标记；d.稳定性好，重复性好，易于保存，对高温和剧烈条件 不敏感。因此，寡核苷酸适配子在临床检测及诊断中具有良好的应用 前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种鼠源IgG核酸适配子，它通过SELEX技 术筛选鼠IgG的核酸适配子，与现有鼠IgG的特异性抗体相比，本发 明中的核酸适配子具有更高的特异性、亲和力，因此可替代抗体，用 于简洁快速、高灵敏度、高特异性的鼠IgG检测及分离纯化方法的建本发明的第二个目的是提供一种鼠源IgG核酸适配子替代抗体在鼠源 IgG检测上的应用或用于鼠源IgG的分离纯化。本发明的第三个目的是提供第二种鼠源IgG核酸适配子。本发明的第四个目的是提供第二种鼠源IgG核酸适配子在鼠源IgG检 测上的应用或用于鼠源IgG的分离'纯化。本发明的技术方案 一种鼠源'IgG核酸适配子，其特征在于，它是具 有序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18的核苷酸序列之一。上述所述的SEQ IDNo.l SEQ ID No.18的核苷酸序列具有下述结构之一<image>image see original document page 7</image>上述所述的核苷酸序列也可以是与SEQ.一种鼠源IgG核酸适配子的核苷酸序列之一相同功能。上述所述的核苷酸序列也可以是与SEQ 一种鼠源IgG核酸适配子的核苷酸序列之-有相同功能。上述所述的核苷酸序列也可以是用SEQ 一种鼠源IgG核酸适配子的核苷酸序列之一上述所述的核苷酸序列的不少于一个位 有碱基甲基化嘌呤或二氢尿嘧啶或次黄嘌呤ID No. 1 SEQ ID No. 18'中的 同源序列占60%以上，使其具有ID No. 1 SEQ ID No. 18中的 -杂交的寡核苷酸序列，使其具ID No. 1 SEQ ID No. 18中的 转录的RNA序列。 置的A或G或C或T或U被稀 置换后，使其具有相同功能。上述所述的核苷酸序列的不少于一个位置进行磷酸化或甲基化 或氨基化或巯基化或同位素化或结合生物素或结合地高辛或结合荧 光物质或结合纳米发光材料或酶标记修饰，使其具有相同.功能。一种鼠源IgG核酸适配子的筛选制备方法，其特征在于，它是由以下步骤构成(1) 用PCR制备ssDNA文库；文库扩增方案一 采用对称PCR扩增得到5'端带有生物素的dsDNA文库，后者以链亲和素磁珠为基质进行分离并变性解链，磁分离后经乙醇沉淀得到 后续筛选的ssDNA文库。 文库扩增方案二采用不对称PCR，获得ssDNA文库。(2) 反筛与筛选 "以Protein A—琼脂糖为基质,反筛去掉ssDNA文库中的非特异 结合部分，筛选得到与鼠源IgG特异结合的ssDNA;(3) 克隆及阳性克隆的序列测定扩增数轮筛选后所得次级文库，回收目标片段，经连接、转化， 挑取单克隆白斑，对PCR反应鉴定的阳性克隆进行序列测定。一种鼠源IgG核酸适配子的应用，其特征在于在实验室、临床及 工业化的应用，包括用于鼠源IgG的检测、鼠源IgG的分离纯化。上述所述的鼠源IgG核酸适配子的应用，其具有序列表中SEQ ID No. 19 SEQ ID No. 36的核苷酸序列之一，用于实验室、临床及工业 化，包括鼠源IgG的检测和/或鼠源IgG的分离纯化。本发明的优越性在于具有简便、快速、经济等特点，与其他组 合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷 酸文库中筛选出的适配子具许多优势1)本身是寡核苷酸，分子量 较小，可以化学合成，节约成本；2)具有比抗体更高的亲和性和特 异性；3)便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；4)重复性和 稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感。因此，SELEX 技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。
图1为检测一种鼠源IgG核酸适配子与鼠源IgG特异性结合的 点杂交实验结果。图2为一种鼠源IgG核酸适配子检测鼠源IgG的Western Blot 实验结果(其中图2-a为核酸适配子检测鼠源IgG的实验结果，图2- b为抗体检测鼠源IgG的实验结果)v图3为一种鼠源IgG核酸适配子检测鼠源IgG的組织化学实验结 果(其中图3-a为核酸适配子检测鼠源IgG的组织化学实验结果，图3- b为鼠源IgG组织化学检测的空白对照)。具体实施例方式
实施例l一种鼠源IgG核酸适配子，其特征是具有序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18所述的核苷酸序列之一。 SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列'5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCAGTCACTC TGTGTTTMG CCCAGTACCC 50 TCTTCAACTT GAGCAAMTC ACCTGCAGGG''G 3' 81SEQ ID No.2所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCCCTMCGC ACGCATGTCA ACAGACGTCC 50 GCTGCACTTG AGCAAMTCA CCTGCAGGGG 3， 80SEQ ID No. 3所述的核苷酸序列V5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGTAGCGACA GACGCMTCC CCACGCGCAT 50 CGAGGCACTT GAGCAAMTC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No.4所述的核苷酸序列5' ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGACCCAAGA GCTGCCTGTG ATTACCCTTC 50 CCCGCMCTT GAGC嵐ATC ACCTGCAGGG G 3, 81SEQ ID No.5所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGCGGCAGCG ATAGAGCCAT CATCCCCCCC 50 CACCCACTTG AGCAAMTCA CCTGCAGGGG 3， 80SEQ ID No. 6所述的核苷酸序列5' ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCCCTCACAC CGTCATTGAT CCTCCGACAC 50 AAGCTAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 7所述的核苷酸序列 ，5' ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTCCCTCAGC ACCCAGACCC CGCTTCTCCC 50ACATTCACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No.8所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TACCCGTTAC CCMCCGATT TCCTTACGCC 50 GCMTTACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No.9所述的核苷酸序列5' ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCGCCCCACA ACACACTGTC CCGCTGCCAT 50 CCCGTCAACT TGAGCAAAAT CACCTGCAGG GG 3' 82SEQ ID No. IO所述的核苷酸序列:'"5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGTGGCCCCG CTCTCTCCTA CCTCTTTCAC 50 CACGACACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 11所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTGTATGCTG AGTGTACCAG CCCTTCTCTC 50 ACCCTAACTT GAGCAMATC ACCTGCAGGG G 3' 81SEQ ID No. 12所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGCGCCGMC CATCTCGATC CCCAGCTGGG 50 ACTACACTTG AGCAAAATCA CCTGCAGGGG 3' 80SEQ ID No. 13所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCCMCATCC GGCTTCCCGC GTACGCGCGT 50TGTGACACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3, 81 SEQ ID No. 14所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGACCCM《A GCTGCCTGTG ATTACCCTTC 50 CCCGCAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 15所述的核苷酸序列 ''5, ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTGCCMTCC CCCMGGTTC CTCCATTACA 50TCCGACACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 16所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TC雄CGCCC CATACCGTCT TCACCCATCC 50 GCCCTCACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 17所述的核苷酸序列''5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTGAGCCCAT CACCTGCAGG GGACCCCGGA 50 TTCACTTGAG CA嵐TCACC TGCGGGGG 3， 78SEQ ID No. 18所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGCACCTGGA AAAGCATAGC TTG嵐CATC 50 GCACAAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81 本发明中用于SELEX筛选的单链DNA随机库及引物由 irwitrogen公司合成，两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序 列5， CCCCTGCAGGTGATTTT GCTCAA GT- ( N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3，，库容量为10"以上，引物l: 5' CCCCT GCAGGTGATTTTGCTCMGT 3，，引物2: 5， -biotin-ATCCGCCTGA TTAGCGAT ACT 3，，引物3: 5， biotin-CCCCTGCAGGT GATTTTGCTCMGT3，，引物 4: 5' -ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3'。鼠源IgG购于天津华生生物技术 有限公司，硝酸纤维素滤膜购于MiriiPore公司，寡核苷酸的纯化试 剂购于北京天为时代公司，PCR试剂盒和T载体购于Promega公司。实施例2一种鼠源IgG核酸适配子的筛选制备方法，其特征在于，它是由以下步骤构成(l)用PCR制备ssDNA文库文库扩增方案一PCR反应体系为 IOX扩增缓冲液 10 ul 4种dNTP混合物各200 u mol/L引物l 100pmo1(5， CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCMGT 3，)引物2 lOOpmol (5， biotin-ATCCGCCTGATTAGCGAT ACT3，)模板DNA lug (5， CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCMGT- (N35)-AGTATCGCTMTCAGGCGGAT 3')Taq DNA聚合酶 2. 5UMg2+ 1.5ramol/X加双或三蒸水至 100 ulPCR反应条件为94'C预变性3min,然后94'C变性lmin， 65°C 退火45sec， 72。C延伸30sec，循环30次,最后72。C延伸5min。将PCR扩增得到5'端带有生物素的dsDNA文库，dsDNA产物经 分离纯化，与链亲和素磁珠结合；然后用0. 15mol/L的Na0H使dsDNA 变性解链，磁分离；液体经乙醇沉淀，溶于TE缓冲液中。98° C加 热2 min，冰上1 min，室温5 min，测定吸光度(A)值，作为筛选 的ss靈文库。 "''文库扩增方案二利用引物l、引物2扩增单链DNA文库采用不对称PCR，引物 1/引物2浓度比100: 1,扩增条件为94。C预变性3min，然后94°C 变性30s， 65""C退火45s， 72'C延伸lmin，循环35次，最后72。C延 伸7min。将获得的产物(主要为ssDNA)于95。C作用3min,于冰中 2min，室温放置10min,即为ssDNA文库。(2)反筛与筛选100pmo1随机ssDNA文库和5nmo1 (tRNA+鲑鱼精DNA)加入10 n 1 Protein A—琼脂糖反筛，在100ul结合缓冲液中室温孵育lhr;然后转移液体，与鼠源IgG—Protein A—琼脂糖25。C结合lhr，用冲 洗缓冲液洗6次，洗去未结合的ssDNA，再加洗脱缓冲液于8(TC作用 10min，洗脱下与鼠源IgG结合的ssIJNA,经酚一氯仿抽提、乙醇沉 淀。将ssDNA溶解于20pl TE缓冲液中，用作扩增的模板，进行下 一轮筛选，重复筛选20轮。— (3)克隆及阳性克隆的序列测定以第20轮筛选所得文库为模板，以引物1和引物^进行PCR，琼 脂糖电泳后回收81bp处片断，与T载体4'C连接过夜，转化DH5 a感 受态细胞，涂板(Amp+， IPTG诱导，X—gal为底物)，37'C培养16h 后，挑取单克隆白斑，置Amp+液体培养基摇菌过夜，提取质粒，如 图l所示质粒电泳图。以质粒为模板，以引物l，引物4扩增，如图 2所示在81bp左右处有扩增出的目标条带，将有目的条带的阳性克隆进行序列测定。 实施例3点杂交实验检测一种鼠源IgG核酸适配子与鼠源IgG的结合将不同量鼠源IgG (0， 1， 2， 3， 4ng;体积均为10ul)点在硝 酸纤维素膜上，待吸收完全，将膜以3%BSA和100 ix 1鲑鱼精DNA室 温封闭l一l. 5h，然后将获得的5'标记生物素的一种鼠源IgG核酸 适配子lOOpmol以TBS稀释至适当体积，与膜杂交，室温lh, TBST 洗后杂交辣根过氧化酶标记的键亲和素，发光显迹，结果阳性，并呈 现梯度。表明筛选得到的一种鼠源IgG核酸适配子与鼠源IgG存在特 异性结合。实施例4 Western Blot法测定鼠源IgG将Hs578T细胞裂解液与加样缓沖液混合，采用Bio-rad的 mini-VE电泳系统进行蛋白质SDS-PAGE电泳，分离胶浓度12%，浓縮 胶5%，将胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜上。用鼠源抗GSTn抗体与 膜孵育，洗涤后用5，标记生物素的一种鼠源IgG核酸适配子与生物 素标记的抗鼠IgG的特异性抗体分别痴交，继而与辣根过氧化酶标记 的链亲和素孵育，洗涤后用发光显迹液发光，暗室内X光片曝光，X光片显影定影。结果均显示明显的条带，表明一种鼠源IgG核酸适配 子可替代抗体用于鼠源IgG的检测。 实施例5组织化学法检测鼠源IgG以 筛 选 的 阮，观U 序 列 为 ATCCGCCTGATTAGCGATACTCAGTCACTCTGTGTTTMG板，以引物3和引物4进行不对称PCR，引物3 (lOOpmol) /引物4 浓度比200: 1,扩增条件为94。C预变性3min,然后94。C变性30s， 65。C退火45 s， 72。C延伸lmin,循环35次，最后72°。延伸7min。 反应产物主要为5'生物素标记的DNA适配子，将其于95'C作用3min， 于冰中2min，室温放置10min，'作为检测试剂备用。人乳腺癌病理切 片常规脱蜡至水，0. 3%仏02-甲醇溶液作用30min封闭内源性过氧化物 酶，TBS洗5min，与鼠源抗GSTn抗体孵育后再与制备好的DNA适配 子室温孵育lh，设立空白对照组，TBS洗3X5min。切片与辣根过氧 化物酶标记的亲和素(1: 1000稀释)孵育30min, DAB显色液(50mg 溶于100ml TB液中，临用前加入10pl 30% H202)中显色5-10min, 镜下观察控制显色程度。结果空白对照组无明显棕黄色沉淀，而与鼠 源IgG核酸适配子孵育的乳腺癌组织显示明显的棕黄色沉淀，表明筛 选得到的核酸适配子能与鼠源IgG特异结合，从而可用于鼠源IgG的 检测和分离纯化。 ' 实施例6 …一种鼠源IgG核酸适配子，具有序列表中SEQ ID No. 19 SEQ ID No. 36所述的核苷酸序列之一。SEQ ID No. 19所述的核苷酸序列.5'CAGTCACTCT GTGTTTAAGC CCAGTkcCT CTTCA 3， 35SEQ ID No. 20所述的核苷酸序列5，CCCTMCGCA CGCATGTCM CAGACGTCCG CTGC 3' 34SEQ ID No. 21所述的核苷酸序列5'GTAGCGACAG ACGCMTCCC CACGCGCATC GAGGC 3' 35SEQ ID No. 22所述的核苷酸序列5'GACCCAAGAG CTGCCTGTGA TTACCCTTCC CCGCA 3， 35 SEQ ID No. 23所述的核苷酸序列^ 5'GCGGCAGCGA TAGAGCCATC ATCCcfccCCC ACCC 3， 34 SEQ ID No. 24所述的核苷酸序列 5'CCCTCACACC GTCATTGATC CTCCGACACA AGCTA 3， 35 SEQ ID No. 25所述的核苷酸序列 ， 5'TCCCTCAGCA CCCAGACCCC GCTTCTCCCA CATTC 3， 35 SEQ ID No. 26所述的核苷酸序列 5'ACCCGTTACC CMCCGATTT CCTTACGCCG CMTT 3， 35 SEQ ID No. 27所述的核苷酸序列 5，CGCCCCACM CACACTGTCC CGCTGCCATC CCGTCA 3， 36 SEQ ID No. 28所述的核苷酸序列 5，GTGGCCCCGC TCTCTCCTAC CTCTlltACC ACGAC 3' 35 SEQ ID No. 29所述的核苷酸序列 5，TGTATGCTGA GTGTACCAGC CCTTCTCTCA CCCTA 3， 35 SEQ ID No. 30所述的核苷酸序列 5，GCGCCGAACC ATCTCGATCC CCAGCTGGGA CTAC 3' 34 SEQ ID No. 31所述的核苷酸序列 5'CCMCATCCG GCTTCCCGCG TACiXGCGTT GTGAC 3， 35 SEQ ID No. 32所述的核苷酸序列 5'GACCCMGAG CTGCCTGTGA TTACCCTTCC CCGCA 3， 35 SEQ ID No. 33所述的核苷酸序列 5，TGCCMTCCC CCMGGTTCC TCCA竹ACAT CCGAC 3， 35 SEQ ID No. 34所述的核苷酸序列 5'CAMCGCCCC ATACCGTCTT CACCCATCCG CCCTC 3， 35 SEQ ID No. 35所述的核苷酸序列 5，TGAGCCCATC ACCTGCAGGG GACCCCGGAT TC 3， 32 SEQ ID No. 36所述的核苷酸序列 5'GCACCTGGM MGCATAGCT TGAAACATCG CACAA 3， 35 SEQ ID No. 19所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 1所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。SEQ ID No. 20所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 2所述的核苷酸 序列第22至55的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。 #SEQ ID No. 21所述的核苷寧序列% SEQ ID No. 3所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一遂，这两个序列所示的^种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。 'SEQ ID No. 22所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 4所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。SEQ ID No. 23所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 5所述的核苷酸 序列第22至55的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。SEQ ID No. 24所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 6所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一致，这两'个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。力" ？SEQ ID No. 25所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 7所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。SEQ ID No. 26所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 8所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一恶这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。SEQ ID No. 27所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 9所述的核苷酸 序列第22至57的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。 "SEQ ID No. 28所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 10所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。SEQ ID No. 29所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 11所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一致,这两'个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。SEQ ID No. 30所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 12所述的核苷酸 序列第22至55的碱基顺序一致，这裔个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。SEQ ID No. 31所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 13所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。 ，SEQ ID No. 32所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 14所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。SEQ ID No. 33所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 15所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。
；、、.SEQ ID No. 34所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 16所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。SEQ ID No. 35所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 17所述的核苷酸 序列第22至53的碱基顺序二致，这^个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。SEQ ID No. 36所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 18所述的核苷酸 序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核 酸适配子具有相同的功能。SEQUENCE LISTING<110>国家纳米技术与工程研究院<120>鼠源IgG核酸适配子及其制备方法和/^用<130> 2007101880615<140> 2007101880615 <141> 2007-U-23<150> 200610130352.4 <151> 2006-12-15<160> 36< 170> Patentln version 3.4<210> 1<211> 81<212> DNA<213> 人.r序列<400> 1atccgcctga ttagcgatac tcagtcactc tgtgtttaag cccagtaccc tcttcaactt 60gagcaaaatc acctgca鹏g 81<210> 2<211> 8'0<212> DNA<213> 人工序列<400>. 2atccgcctga ttagcgatac tccctaacgc acgcatgtca acagacgtcc gctgcacttg 60 agcaaaatca cctgcagggg 80<210> 3<211> 81<212> DNA<213> ^工序列<400> 3atccgcctga ttagcgatac tgt^cgaca gacgcaatcc ccacgcgcat cgaggcactt 60gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 4 <211> 81 <212> DNA<2i3>人i:序列<400> 4atccgcctga ttagcgatac tgacccaaga gctgcctgtg attacccttc cccgcaactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 5<2U> 80<212> pNA <213>人工序列<400> 5atccgcctga ttagcgatac tgcggcagcg atagagccat catccccccc cacccacttg 60 agcaaaatca cctgcag^g 80<210> 6<211> 81<212> DNA <213>人工序列<40O> 6atecgc魄a ttagcgatac tccctcac^;敏cattgat cctccgacac aagctaactt 60gagcaaaatc acctgcaggg g<210> 7<211> 81<212> DNA <213>人.l:序列81<400> 7atccgcctga ttagcgatac ttcccte^c acccagaccc cgcttctccc acattcactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 8<211> 81<212> DNA<213> 人丄序列<400> 8atccgcctga ttagcgatac tacccgttac ccaaccgatt tccttacgcc gcaattactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 9<211> 82<212> DNA <213>人工序列<400> 9atccgcctga ttagcgatac tcgccccaca acacactgtc ccgctgccat cccgtcaact 60 ,tgagcaaaat cacctgcagg gg 82<210> 10<211> 81<212> DNA <213>人工序列<400> 10atccgcctga ttagcgatac tgtggccccg ctctctccta cctotttcac cacgacactt 60 gagcaaaatc acctgc^gg g 81'<210> 11<211> 81<212> DNA <213>'人工序列<400> 11atccgcctga ttagcgatac ttgtatgctg agtgtaccag cccttctctc accctaactt 60gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 12 <2U> 80<212> DNA <213> 人工序列<400> 12atccgcctga ttagcgatac tgcgccgaac catctcgatc cccagctggg actacacttg 60 agcaaaatca cctgcagggg 80<210> 13<211> 81<212>' DNA <213>人T序列<400> 13atccgcctga ttagcgatac tccaacatcc ggcttcccgc gtacgcgcgt tgtgacactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 14<211> 81.<212> DNA <213>人工序列<400>' 14atccgcctga ttagcgatac tgacccaaga gctgcctgtg attacccttc cccgcaactt 60 g堪caaaate acctgcaggg g 81<210> 15<2H> 81<212> DNA <213>人工序列<400> 15atccgcctga ttagcgatac ttgcc幼tcc ccca^gttc ctccattaca tccgacactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 16<211> 81<212> DNA <213>人工序列<400> 16atccgcctga ttagcgatac tcaaacgccc cataccgtct tcacccatcc gccctcactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 17<211> 7.8<212> DNA.<213> 人工序列<400> 17atccgcttga ttagcgatac ttgagcccat cacctgcagg ggaccccgga ttcacttgag 60 caaaatcacc tgcggggg 78<210> 18<211> 81<212> DNA <213>人工序列<400> 18.atccgcctga ttagcgatac tgcacc^ga aaagcatagc ttgaaacatc gcacaaactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 19<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 19cagtcactct gtgtttaagc ccagtaccct cttca 35'<210> 20<211> 34<212> DNA <213>人工序列<400> 20ccctaacgca cgcatgtcaa cagacgtccg ctgc 34<210> 21<211>' 35 <212> DNA <213>人工序列<40O 21gtagcgacag acgcaatccc cacgcgcatc gaggc 35<210> 22<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 22gacccaagag ctgcctgtga ttacccttcc ccgca 35<210> 23<211> 34<212> DNA <213>人工序列<400> 23gcggcagc扭tagagccatc atcccccccc accc 34<210> 24<211>， 35<212> DNA <213>人工序列<400> 24cccteacacc gtcattgate ctccgacaca. agcta 35<210> 25<211> 35<212> t)NA <213>人工序列<400> 25tccctcagca cccagacccc gcttctocca cattc 35<210> 26 <211> 35 <212> DNA<213> 人工序列 <400> 26acccgttacc caaccgattt ccttacgccg caatt 35<210> 27<2rf> 36<212> DNA <213>人工序列<400> 57cgccccacaa cacactgtcc cgctgccatc ccgtca 36<210>. 28<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 28gtggccccgc tctctcctac ctctttcacc acgac 35<210> 9<211> 35.<212> DNA <213>人工序列<400> 29tgtatgctga gtgtaccagc ccttctctca cccta 3 5<210> 30<211> 34<212> DNA <213>人工序列<400> 2|0gcgccgaacc atctcgatcc cc堪ctg^a ctac 34<210> 31<211>' 35<212> DNA <213>人工序列<400> 31 》 .ccaacatccg gcttcccgcg tacgcgcgtt gtgac 35<210> 32<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 32gacccaagag ctgcctgtga ttacccttcc ccgca 35<210> 33.<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 33tgccaatccc ccaaggttcc tccattacat ccgac 35<210> 34<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 34'caaacgcccc ataccgtctt cacccatccg ccctc 35<210>' 35<211> 32<212> DNA<213> 人工序列<400> 35tg呢cccatc acctgcaggg gaccccggat te 32<210> 36<2U> 35<212> DNA<213> 人工序列<400> 36gcacctggaa aagcatagct tgaaacatcg cacaa 3权利要求
1. 一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于，它是具有序列表中SEQ IDNo.1～SEQ ID No.18的核苷酸序列之一。
2、根据权利要求1所说的一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于所说的 SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18的核智酸序列具有下述结构之一
3.<image>image see original document page 3</image>3、 .根据权利要求1所说的一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于所说的 核苷酸序列也可以与SEQ ID No. 1广SEQ ID No. 18中的一种鼠源IgG核酸适 配子的核苷酸序列之一同源序列占60%以上，使其具有相同功能。
4、 根据权利要求1所说的一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于所说的拔-竹Ef酸序列也可以与SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18一种鼠源IgG核酸适合匕配子的核苷酸序列之一杂交的寡核苷酸序列，使其具有相同功會
5、 根据权利要求l所说的一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于所说的 核苷酸序列也可以用SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18中的一种鼠源IgG核酸适 '配子的核苷酸序列之一转录的RNA序列。
6、 根据权利要求l所说的一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于所说的 核苷酸序列的不少于一个位置的A或G或C或T或U被稀有碱基甲基化嘌呤 或二氢尿嘧啶或次黄嘌呤置换后，使其具有相同功能。
7、 根据权利要求1所说的一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在 于所说的核苷酸序列的不少于,一个位置进行磷酸化或甲基化或氨基 化或巯基化或同位素化或结合生物素或结合地高辛或结合荧光物质或结合纳米发光材料或酶标记修饰，使其具有相同功能。
8、 一种上述鼠源IgG核酸适配子的筛选制备方法，其特征在于它是由以下步骤构成U)用PCR制备ssDNA文库；文库扩增方案一采用对称PCR扩增得到5'端带有生物素的dsDNA文库，后者以 链亲和素磁珠为基质进行分离并变性解链，磁分离后经i醇沉淀得到 后续筛选的ssDNA文库。文库扩增方案二-采用不对称PCR，获得ssDNA文库。(2) 反筛与筛选以Protein A—琼脂糖为基质，反筛去掉ssDNA文库中的非特异 结合部分，筛选得到与鼠源IgG特异结合的ssDNA;(3) 克隆及阳性克隆的序列测定扩增数轮筛选后所得次级文库，回收目标片段，经连接、转化， 挑取单克隆白斑，对PCR反应鉴定的阳性克隆进行序列测定。
9、 一种上述鼠源IgG核酸适配子的应用，其特征在于在实验室、 临床及工业化的应用，包括用于鼠源IgG的检测、鼠源IgG的分离纯 化。
10、 根据权利要求9所说的一种鼠源IgG核酸适配子的应用，其 特征在于所说的具有序列表中SEQ ID No.l9 SEQ ID No.36的核苷 酸序列之一，用于实验室、临床及工业化，包括鼠源IgG的检测和/ 或鼠源IgG的分离纯化。
全文摘要
一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于它是具有序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.18的核苷酸序列之一；制备方法包括(1)用PCR制备ssDNA文库、(2)反筛与筛选、(3)克隆及阳性克隆的序列测定；应用其特征在于在实验室、临床及工业化的应用，包括用于鼠源IgG的检测、鼠源IgG的分离纯化。本发明的优越性本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本；具有比抗体更高的亲和性和特异性；便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感；因此，SELEX技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。
文档编号C12N15/13GK101275137SQ20071018806
公开日2008年10月1日 申请日期2007年11月23日 优先权日2006年12月15日
发明者吴淑庆, 弓景波 申请人:国家纳米技术与工程研究院