以多糖作为信号放大媒介体的核酸电化学生物分析方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分析技术领域，具体涉及以多糖作为信号放大媒介体的核酸电化学生物分析方法。
【背景技术】
[0002]随着科学技术的不断发展以及人们对生活质量要求的逐步提高与追求，核酸分析技术已经逐渐成为环境监测、食品安全、医药卫生，以及生物技术等领域的主要分析手段。以纳米粒子为基础的电化学分析技术成为了不可或缺的技术核心，而以此为基础发展出来的微量的和超灵敏的分析技术手段具有相当广泛的应用前景。
[0003]传统的核酸定量分析方法主要包括定磷法、定糖法、分光光度法、荧光光谱法、紫外吸收光谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法以及共振光散射法等，但都具有灵敏度低、选择性差、设备复杂或检测成本高等缺点，而电化学方法用于核酸的定量分析时具有灵敏度高、检测成本低、检测周期短等优良特性。
[0004]传统的信号放大策略主要包括酶促放大法、目标循环法、滚环扩增放大法、聚合酶链式反应扩增法、以及用纳米粒子进行标记等。这些方法虽然都能显著地降低核酸电化学生物分析的检测下限，但都具有操作过程复杂、检测成本高、费时、费力等缺陷。多糖作为普遍存在的生物原料，具有方便易得，成本低廉，绿色环保等特点，但对其开发并使之应用于生物分析领域的努力还处于萌芽阶段。在本方法中，结合多糖生物原料的方便易得和成本低廉，以及纳米粒子分析的高灵敏特点，开发了一种全新的核酸电化学生物分析方法。该方法简便，便利，成本低，灵敏度高，应用范围广，具有十分重要的意义。
[0005]文献10.1021/ac800334y公布了一种以多糖为模板形成银纳米线用于实现对核酸的超灵敏电学检测的方法。该方法首先在芯片表面刻划出一系列交叉指型电极，然后利用3-氨丙基三乙氧基硅烷以及对苯二异硫氰酸酯将芯片表面活化，将修饰有氨基末端的肽核酸连接到芯片表面作为捕获探针，与待测寡核苷酸片段杂交后，利用锆离子的配位化学作用将果胶分子连接到杂交形成的异源双螺旋骨架上，用高碘酸钠将果胶分子中的邻位羟基氧化成醛基，生成的醛基将银离子还原成银纳米粒子沉积在交叉指型电极间，通过检测电极间导电性的变化来实现对特异性寡核苷酸片段的定量检测。该方法的检测下限可以达到1.0fM，但其交叉指型电极制造过程复杂，捕获探针固定化过程相当繁琐，其芯片也不能重复利用，故在实际应用时有一定的局限性；此外，在实际检测时，其检测下限和检测结果的可重现性也不是相当理想。
【发明内容】
[0006]为解决现有技术中信号放大方法所存在的不足，本发明的目的在于提供一种以多糖作为信号放大媒介体的高灵敏核酸电化学生物分析方法。
[0007]实现本发明目的的技术解决方案为:一种以多糖作为信号放大媒介体的高灵敏核酸电化学生物分析方法，包括以下步骤:
[0008]步骤一、将金电极表面打磨至镜面，清洗干净后，在水虎鱼酸中浸泡，清洗后，在稀硫酸中对电极表面进行电化学预处理，清洗干净后用氮气吹干；
[0009]步骤二、将修饰有巯基末端的肽核酸的水溶液滴加到上述预处理过的金电极表面，进行反应，将残余的肽核酸清洗干净，用巯基己醇对电极表面进行封闭，封闭结束后冲洗干净，用氮气吹干；
[0010]步骤三、将含待测寡核苷酸片段的溶液滴加到步骤二所得的电极表面，杂交反应结束后，将未参与杂交反应的寡核苷酸片段清洗干净，用氮气吹干；
[0011]步骤四、将步骤三所得电极表面浸泡在含过渡金属离子的溶液中，反应完成后清洗干净，将多糖滴加到电极表面，反应结束后清洗干净，用氮气吹干；
[0012]步骤五、将步骤四所得电极表面浸泡在强氧化性试剂中，反应结束后清洗干净，将银离子溶液滴加到电极表面，反应结束后清洗干净，用氮气吹干；
[0013]步骤六、将步骤五所得电极表面沉积的银纳米粒子用电化学方法进行检测。
[0014]步骤一中所述的电极表面依次用0.3微米和0.05微米的氧化铝悬浮液打磨，所述水虎鱼酸中浓硫酸与过氧化氢的体积比为3:1，浸泡时间为lOmin，所用稀硫酸的浓度为0.5M，所述电化学预处理采用循环伏安法，其扫描电位范围为-0.2?1.5V。
[0015]步骤二中所述的肽核酸的水溶液的浓度为1.0uM,反应时间为90min，巯基己醇浓度为2.0mM，封闭时间为45min。
[0016]步骤三中所述的待测寡核苷酸片段的溶液中溶剂为pH=8.0的TE缓冲液，杂交反应时间为 45 ?120min，其中，TE 缓冲液为:10mM Tris-HCl+lmM EDTA0
[0017]步骤四中所述过渡金属离子为锆离子，其浓度为5mM，浸泡时间为45min，所述的多糖为饱和多聚半乳糖醛酸钾，反应时间为60min。
[0018]步骤五中所述强氧化性试剂为高碘酸钠，其浓度为25mM，浸泡时间为120min，所述银离子溶液为银氨溶液，其浓度为7?17mM，反应时间为60min。
[0019]步骤六中所述电化学方法为差分脉冲伏安法，其扫描电位范围为-0.15?0.25V。
[0020]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0021]①本发明的以多糖类化合物作为信号放大媒介体的高灵敏、高选择性的核酸电化学生物分析方法，通过采用具有高选择性和高杂交效率的肽核酸通过自组装的方式固定在电极表面作为捕获探针，提高了核酸电化学生物分析方法的选择性，简化了捕获探针的固定化过程，并且可以实现金电极的重复利用，有利于降低检测成本；
[0022]②通过利用过渡金属离子的配位化学作用，将多糖类化合物连接到杂交反应所形成的异源双螺旋骨架上，接着在多糖的作用下实现金属纳米粒子的原位沉积，简化了电化学生物分析方法所面临的信号放大难题，同时也可以降低检测成本；
[0023]③通过利用电化学分析技术检测电极表面沉积的金属纳米粒子，可实现对核酸样品的高灵敏检测，检测时间短，成本低，设备简单。
【附图说明】
[0024]图1是本发明核酸电化学生物分析方法的制备过程示意图。(其中，A为在预处理过的电极表面固定化肽核酸捕获探针，用巯基己醇对电极表面进行封闭为捕获探针与待测寡核苷酸片段杂交；C为在锆离子的作用下将多糖分子引入到异源双螺旋骨架上；D为用高碘酸钠将多糖氧化；E为银纳米粒子的沉积；F为用差分脉冲伏安法检测电极表面沉积的银纳米粒子。)
[0025]图2是本发明核酸电化学生物分析方法的差分脉冲伏安图。
[0026]图3是本发明表征电极表面沉积的银纳米粒子形貌的扫描电子显微镜图。
[0027]图4是本发明不同杂交反应时间对本发明核酸电化学生物分析方法检测结果的影响。
[0028]图5是本发明不同银离子浓度对本发明核酸电化学生物分析方法检测结果的影响。
[0029]图6(A)是本发明采用本发明核酸电化学生物分析方法检测不同浓度的寡核苷酸片段的响应特性。
[0030]图6(B)是本发明相应寡核苷酸片段浓度下差分脉冲伏安响应峰电流大小的校准曲线。
[0031]图7是本发明采用本发明核酸电化学生物分析方法检测不同寡核苷酸序列的响应信号大小的比较(其中，A是完全互补配对的寡核苷酸片段，B是具有单碱基错配的寡核苷酸片段，C为完全不互补配对的寡核苷酸片段)。
【具体实施方式】
[0032]实施例1:如附图1中所示的A，B, C，D，E，F步骤，制备本发明核酸电化学生物分析方法。
[0033](I)电极表面的预处理及捕获探针的固定化
[0034]首先，将电极表面依次用粒径为0.3微米和0.05微米的氧化铝悬浮液打磨至镜面，清洗干净后，在水虎鱼酸中化学氧化处理10分钟，在超纯水中超声清洗后，在0.5M的稀硫酸中用循环伏安法在-0.2?1.5V的电位范围内对电极表面进行电化学预处理，进一步除去电极表面吸附的杂质并对电极表面粗糙度进行优化。将电极表面用超纯水超声清洗后，用氮气吹干。在电极表面滴加1.0uM的修饰有巯基末端的肽核酸捕获探针(序列:5，-HS-(CH2)11-AAC CAT ACA ACC TAC TAC CTC A-3’)，在 37°C下静置约 90min，冲洗干净后，在37 C条件下，将电极表面在2mM疏基己醇中浸泡约45min，封闭结束后将电极表面冲洗干净用氮气吹干。
[0035](2)杂交
[0036]将0.1pM待测寡核苷酸片段(序列:5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’)滴加到电极表面，37°C下反应约90min，反应完成后，用pH=8.0的TE缓冲液(1mM Tris-HCl+lmMEDTA)将电极表面清洗干净用氮气吹干。
[0037](3)多糖分子的引入及银纳米粒子的沉积
[0038]将电极表面浸泡在5mM锆离子溶液中，37°C下反应约45min，将电极表面冲洗干净后用氮气吹干。将12mg/mL的多聚半乳糖醛酸钾溶液滴加到电极表面，37°C下反应约60min，将电极表面清洗干净后用氮气吹干。将电极表面浸入25mM高碘酸钠溶液中，室温下放置约120min后将电极表面清洗干净，用氮气吹干。将13mM银氨溶液滴加到上述电极表面，室温下放置约60min，将电极表面清洗干净后用氮气吹干。
[0039](4)电化学检测
[0040]用饱和甘汞电极作为参比电极，用钼丝作为对电极，在1.0M氯化钾溶液中用差分脉冲伏安法对电极表面沉