改善植物的多核苷酸和方法

专利名称：改善植物的多核苷酸和方法
技术领域：
本发明涉及产生具有升高的种子产量的植物的组合物和方法。
背景技术：
随着世界人口的增长，农业研究的一个主要目标是提高作物植物物种的谷粒产量。直到最近这样的提高是基于按照想要的特性进行植物的选择性育种。 但是对于很多植物来说，子代中产生的异源遗传赠送不引起与其亲代中一样的所需特性，因此限制了选择性育种方法的有效性。如今分子生物学的进展使得可以对植物和动物的种质进行遗传操作。植物的遗传工程包括分离并操作遗传材料以及后续的将该材料导入植物。这个技术已经引起能够表达药物和其它化学物的植物的开发、具有增强的害虫抗性、增强的压力耐受的植物的开发和表达其它有益特性的植物的开发。可以通过开发比同等的野生型植物产生更多的种子或谷粒的植物而达到植物作物植物的谷粒产量的改善。因此，业界需要相对于正常培育的对应物来说具有增加的种子产量的植物。本发明的一个目标是提供开发具有改善的种子或谷粒种子产量的植物品种的改善的组合物和/或方法，或至少为公众提供有用的选择。

发明内容
在第一个方面，本发明提供了产生具有改变的种子产量的植物的方法，该方法包括使用下列多核苷酸转化植物a)编码具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的多肽或多肽变体的多核苷酸，其中变体能够调节植物中的种子产量；b)包含a)中的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的片段的多核苷酸，或c)包含a)中的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的互补物的多核苷酸。在一个具体实施方式
中，变体与具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽具有至少 70%的序列同一性。优选地变体源自植物物种并且包含SEQ ID NO 32的序列。在一个具体实施方式
中，变体源自单子叶植物物种并且包含SEQ ID N0:33的序列。在优选的具体实施方式
中，变体包含选自SEQ ID NO :2_31任一项的氨基酸序列。在优选的具体实施方式
中，多肽或变体是谷氨酸盐脱羧酶。在优选的具体实施方式
中，a)中的多核苷酸编码具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的多肽。在优选的具体实施方式
中，以含有多核苷酸的遗传构建体转化植物。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供了产生具有改变的种子产量的植物的方法，该方法包括使用下列多核苷酸转化植物细胞或植物a)包含SEQ ID NO :34的核苷酸序列的多核苷酸或其变体，其中变体编码能够调节植物中的种子产量的多肽；b)包含a)中的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的片段的多核苷酸，或c)包含a)中的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的互补物的多核苷酸。在一个具体实施方式
中，变体包含SEQ ID NO :35_65任一项的序列。在一个优选的具体实施方式
中，a)中的多核苷酸或变体编码一个多肽，该多肽为谷氨酸盐脱羧酶。在另一个具体实施方式
中，a)中的多核苷酸包含SEQ ID NO 34的序列。在另一个具体实施方式
中，a)中的多核苷酸包含SEQ ID NO 34的编码序列。在优选的具体实施方式
中，以含有多核苷酸的遗传构建体转化植物。优选地，通过本发明的方法产生的植物相对于合适的对照植物具有升高的种子产量。在另一个具体实施方式
中，产生具有改变的种子产量的植物的方法包括使用遗传构建体转化植物细胞或植物，所述遗传构建体能够改变调节种子产量的多肽的表达。在一个具体实施方式
中，由于使用遗传构建体(其能够下调正向调节种子产量的多肽的表达)转化植物细胞或植物，所以该方法产生相对于合适的对照具有降低的种子产量的植物。在优选的具体实施方式
中，由于使用遗传构建体(其能够上调正向调节种子产量的多肽的表达)转化植物细胞或植物，所以该方法产生相对于合适的对照具有升高的种子产量的植物。在另一个方面，本发明提供了根据本发明的方法产生的植物细胞或植物。优选地，根据本发明的方法产生的植物相对于合适的对照植物具有升高的种子产量。在另一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其与编码包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列具有至少75%的序列同一性，其中多核苷酸编码能够调节植物中种子产量的多肽。在一个具体实施方式
中，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO 34的序列。在另一个具体实施方式
中，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO 34的全长编码序列。在另一个方面，本发明提供了编码与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少70%同一性的多肽的多核苷酸。优选地，多肽能够调节植物中的种子产量。优选地，多肽是谷氨酸盐脱羧酶。在另一个方面，本发明提供了编码包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽的分离的多核苷酸。在另一个具体实施方式
中，多核苷酸包含SEQ ID NO 34的序列。在另一个具体实施方式
中，多核苷酸包含SEQ ID NO 34的全长编码序列。在另一个方面，本发明提供了包含SEQ ID NO :34的序列的分离的多核苷酸或其变
5体，其中该变体来自黑麦草或羊茅并且编码能够调节植物中种子产量的多肽。 在一个具体实施方式
中，多肽是谷氨酸盐脱羧酶。在一个具体实施方式
中，分离的多核苷酸包含SEQ ID NO 34的序列。在另一个方面，本发明提供了与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少83%序列同一性的分离的多肽，其中多肽能够调节植物中的种子产量。在一个具体实施方式
中，分离的多肽包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列。在另一个方面，本发明提供了编码本发明的多肽的分离的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含a)包含长度为至少15个核苷酸的本发明的多核苷酸的片段的多核苷酸；b)包含长度为至少15个核苷酸的本发明的多核苷酸的互补物的多核苷酸；或c)包含长度为至少15个核苷酸的能够与本发明的多核苷酸杂交的序列的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了包含本发明的多核苷酸的遗传构建体。在一个具体实施方式
中，遗传构建体是表达构建体。在一个具体实施方式
中，构建体包含与多核苷酸可操作连接的启动子。在另一个具体实施方式
中，构建体包含与多核苷酸可操作连接的终止子。优选地，启动子、终止子或二者来自与多核苷酸不同的来源。在一个具体实施方式
中，不同的来源是不同的物种。在另一个方面，本发明提供了包含本发明的遗传构建体或表达构建体的载体。在另一个方面，本发明提供了经遗传修饰以表达本发明的多核苷酸或本发明的多肽的宿主细胞。在另一个方面，本发明提供了包含本发明的遗传构建体或表达构建体的宿主细胞。在另一个方面，本发明提供了经遗传修饰以表达本发明的多核苷酸或本发明的多肽的植物细胞。在另一个方面，本发明提供了包含本发明的遗传构建体或表达构建体的植物细胞。在另一个方面，本发明提供了包含本发明的植物细胞的植物。在另一个方面，本发明提供了选择相对于合适的对比物具有改变的种子产量的植物的方法，该方法包括测试植物的本发明的多核苷酸表达的改变。在另一个方面，本发明提供了选择相对于合适的对照具有改变的种子产量的植物的方法，该方法包括测试植物的本发明的多肽表达的改变。在另一个方面，本发明提供了根据本发明的方法产生的植物细胞或植物。在另一个方面，本发明提供了根据本发明的方法选择的植物。在另一个方面，本发明提供了一群或一组根据本发明的方法选择的植物。另一个方面，本发明提供了针对本发明的多肽产生的抗体。本发明的多核苷酸和多核苷酸变体可以来自于任何物种和/或可以通过合成或重组产生。在一个具体实施方式
中，多核苷酸或变体来自于植物物种。
在另一个具体实施方式
中，多核苷酸或变体来自于裸子植物物种。在另一个具体实施方式
中，多核苷酸或变体来自于被子植物物种。在另一个具体实施方式
中，多核苷酸或变体来自于双子叶植物物种。在另一个具体实施方式
中，多核苷酸或变体来自于单子叶植物物种。本发明的多肽和多肽变体可以来自于任何物种和/或可以通过合成或重组产生。在一个具体实施方式
中，多肽或变体来自于植物物种。在另一个具体实施方式
中，多肽或变体来自于裸子植物物种。在另一个具体实施方式
中，多肽或变体来自于被子植物物种。在另一个具体实施方式
中，多肽或变体来自于双子叶植物物种。在另一个具体实施方式
中，多肽或变体来自于单子叶植物物种。本发明的植物细胞和植物可以来自于任何物种。在一个具体实施方式
中，植物细胞或植物来自于裸子植物物种。在另一个具体实施方式
中，植物细胞或植物来自于被子植物物种。在另一个具体实施方式
中，植物细胞或植物来自于双子叶植物物种。在另一个具体实施方式
中，植物细胞或植物来自于单子叶植物物种。优选的双子叶植物的属包括桃属(Amygdalus)、腰果属(Anacardium)、落花生属(Arachis)、芸苔属(Brassica)、木豆属(Cajanus)、大麻属(Cannabis)、红花属 (Carthamus)、山核桃属(Carya)、木棉属(Ceiba)、鹰咀豆属(Cicer)、椰子属(Cocos)、芫荽属(Coriandrum)、小冠花属(Coronilla)、棉属(Cossypium)、野百合属(Crotalaria)、 扁豆属(Dolichos)、油棕属(Elaeis)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、山黧豆属(Lathyrus)、兵豆属(Lens)、胡枝子属(Lespedeza)、亚麻属(Linum)、百脉根属(Lotus)、羽扇豆属(Lupinus)、澳洲坚果属(Macadamia)、苜蓿属(Medicago)、草木犀属(Melilotus)、黎豆属(Mucuna)、木犀榄属(Olea)、红豆草属 (Onobrychis)、乌足豆属(Ornithopus)、罂粟属(Papaver)、菜豆属(Phaseolus)、刺葵属 (Phoenix)、黄连木属(Pistacia)、豌豆属(Pisum)、樱桃属(I^unus)、葛属(Pueraria)、 茶薦子属(Ribes)、蓖麻属(Ricinus)、胡麻属(Sesamum)、可可属(Theobroma)、车轴草属 (Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、蚕豆属(Vicia)和豇豆属(Vigna)。优选的双子叶植物的种包括扁1 (Amygdalus communis),腰果 (Anacardiumoccidentale)、花生(Arachis hypogaea)、花生(Arachis hypogea)、 甘蓝型油菜(Brassica napus Rape)、黑芥(Brassica nigra)、白菜(Brassica campestris)、 (Cajanus cajan)、￡口貞 7^(Cajanus indicus) > ) (Cannabis sativa)、红花(Carthamus tinctorius)、美国山核桃(Carya illinoinensis)、爪唾 7^ 丰帛(Ceibapentandra)> 0 ^ S (Cicer arietinum)、！〒(Cocos nucifera)> ^ ^ (Coriandrumsativum)、绣 求(Coronilla varia) > ^ (Cossypium hirsutum)
) (Crotalariajuncea) > Ji(Dolichos lablab)、油胃(Elaeis guineensis) > M yjfl (Gossypiumarboreum)、中国棉(Gossypium nanking)、海岛棉(Gossypium barbadense)、 草棉(Gossypium herbaceum)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、大豆(Glycine max)、 野大豆(Glycine ussuriensis)、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、向曰葵(Helianthus annus)、I夹卩十山 H 豆(Lathyrus angustifolius)、！t # 山 H 豆(Lathyrus luteus)、Lathyrusmutabi 1 isΛ Lathyrus sericea、Lathyrus striata、Lathyrus uliginosus、 ill 黧豆(Lathyrussativus)、兵豆(Lens culinaris)、鸡目艮草(Lespedeza stipulacea)、 亚麻(Linumusitatissimum)、百脉根(Lotus corniculatus)、白习习扇豆(Lupinus albus)、褐斑苜猜(Medicago arabica)、木本苜猜(Medicago arborea)、黄花苜猜 (Medicago falcate)、南苜猜(Medicago hispida)、Medicago officinalis、紫花苜蓿(Medicago sativa)、蒺藜状苜蓿(Medicago tribuloides)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia) Λ(Melilotus albus) Λ ^IJ^iSls. (Mucuna pruriens) Λ ift^tjl
(Olea europaea)、红豆草(Onobrychis viciifolia)、锯齿 草(Ornithopus sativus)、绿 S. (Phaseolusaureus) Λ Phaseolus aureus cerasifera、Phaseolus aureus cerasus、 Phaseolus aureuscoccineus、 Phaseolus aureus domestica、 Phaseolus aureus lunatus、Phaseolus aureusmaheleb、Phaseolus aureus mungo、Phaseolus aureus persica、Phaseolus aureuspseudocerasus、Phaseolus aureus vulgaris、(Papaver somniferum)、宽叶菜豆(Phaseolus acutifolius)、海φ (Phoenix dactylifera)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆(Pisum sativum)、扁桃(Prunus amygdalus)、杏(Prunus armeniaca)、里予葛(Pueraria thunbergiana)、漂穗醋栗(Ribes nigrum)、红醋栗(Ribes rubrum)、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、篦麻(Ricinus communis)、芝麻(Sesamum indicum)、(Trifolium augustifolium)、(Trifolium diffusum)、杂三叶草(Trifolium hybridum)、绛三叶(Trifolium incarnatum)、球三叶草(Trifolium ingrescens)、 红三叶(Trifoliumpratense)、白三叶(Trifolium repens)、波斯三叶草(Trifolium resupinatum)、地三叶草(Trifolium subterraneum)、可可树(Theobroma cacao)、亚历山大三叶草(Trifolium alexandrinum)、香豆子(Trigonella foenumgraecum)、Vigna angustifolia、Vigna atropurpurea、Vigna calcarata、Vigna dasycarpa、Vigna ervilia、 Vigna oxycoccos、Vigna pannonica、长虹显(Vigna sesquipedalis)、虹显(Vigna sinensis)、(Vignavillosa)、香豆(Vicia faba)、大巢菜(Vicia sative)禾口小豆(Vigna angularis)0优选的单子叶植物的属包括冰草属(Agropyron)、葱属(Al 1 ium)、看麦娘属(Alopecurus)、须芒草属(Andropogon)、燕麦草属(Arrhenatherum)、天门冬属 (Asparagus)、燕麦属(Avena)、簕竹属(Bambusa)、孔颖草属(Bothrichloa)、格兰马草属(Bouteloua)、雀麦属(Bromus)、蒺藜草属(Cenchrus)、虎尾草属(Chloris)、香茅属 (Cymbopogon)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、双花草属(Dichanthium)、马唐属(Digitaria)、掺属(Eleusine)、披硷草属(Elymus)、画眉草属(Eragrostis)、荞麦属 (Fagopyrum)、羊茅属(Festuca)、大麦属(Hordeum)、毒麦属(Lolium)、禾酉属(Oryza)、黍属(Panicum)、雀稗属(Paspalum)、狼尾草属(Pennisetum)、薦草属(Phalaris)、梯牧草属 (Phleum)、早熟禾属(Poa)、甘蔗属(Saccharum)、黑麦属(Secale)、狗尾草属(Setaria)JP 第安草属(Sorghastrum)、高粱属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、香果兰属(Vanilla)、小黑麦属(X Triticosecale)和玉蜀黍属(Zea)。优选的单子叶植物的种包括冰草(Agropyron desertorum)、长穗偃麦草(Agropyron elongatum)、丛生小麦草(Agropyron spicatum)、细莲冰草 (Agropyrontrachycaulum)> 毛冰 草(Agropyron trichophorum)、大葱(Alliumfistulosum)、大蒜(Allium, sativum)、草原看麦娘(Alopecurus pratensis)、须芒草(Andropogongerardi)、燕麦草(Arrhenatherum elatius)、石习桕(Asparagus officinalis)、燕麦(Avena sativa)、佛肚竹(Bambusa vulgaris)、Bothrichloa barbinodis、白羊草(Bothrichloa ischaemum)、垂 H 草(Bouteloua curipendula) Λ 格兰马草(Boutelouagracilis)、直立雀麦(Bromus erectus)、纤毛漠藜草(Cenchrus ciliaris)、# #、|、丨 ^ ^ ^ (Chloris gayana) λ M # ^ (Cymbopogon nardus)、^] f t艮 (Cynodon dactylon)、甲鸟茅(Dactylis glomerata)、双花草(Dichanthium annulatum)、 俯仰马唐(Digitariadecumbens)、禾參子(Eleusine coracan)、窄颖赖草(Elymus angustus)、弯叶_眉草(Eragrostis curvula)、苔鼓(Eragrostis tef)、养麦(Fagopyrum esculentum)、軸革旦养麦(Fagopyrum tataricum)、高羊茅(Festuca arundinacea)、二棱大麦(Hordeumdistichum)、大麦(Hordeum vulgare)、漂麦草(Lolium perenne)、多花漂麦草(Loliummultiflorum)、水禾§ (Oryza sativa)、禾术米(Panicum italicium)、大黍 (Panicummaximum)、黍(Panicum miliaceum)、毛花雀禾卑(Paspalum dilatatum)、狼尾草 (Pennisetum clandestinum)、iiH (Pennisetum glaucum)、！H (Phalarisarundinacea)、 梯牧草(Phleum bertolinii)、羊肉草(Poa fendleriana)、林地早熟禾(Poa nemoralis)、 力^里予 (Saccharum robustum)、tt胃(Saccharum sinense) λ ^ (Secale cereale) Λ 非洲狗尾草(Setaria sphacelata)、拟高梁(Sorghastrumnutans)、甜高粱(So rghum dochna)、假高梁(Sorghum halepense)、高梁(Sorghumbicolor)、小麦(Triticum aestivum)、二粒小麦(Triticum dicoccum)、小漂麦(XTriticosecale)、玉米(Zea mays)、 冰草(Agropyron cristatum)、中间偃麦草(Agropyronintermedium)、蓝莲冰草(Agropyron smithii)、火葱(Allium ascalonicum)、洋葱(Alliumcepa)、萬头(Allium chinense)、 韭葱(Allium porrum)、北葱(Allium schoenoprasum)、莜麦(Avena nuda)、佛肚竹 (Bambusa vulgaris) Λ Bothrichloa saccharoides、马胃(Bouteloua eriopoda) Λ 芒雀麦(Bromus inermis) Λ 草地雀麦(Bromusriparius) Λ Dactylis aristatum、 Dactylis sericeum、南非马唐(Digitaria smutsii)、俄罗斯野麦(Εlymus junceus)、羊茅(Festuca ovina)、草甸羊茅(Festuca pratensis)、紫羊茅(Festuca rubra)、紫黍草 (Panicum purpurascens)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、百喜草(Paspalum notatum)、象草(Pennisetum purpureum)、稚[I谷(Pennisetum spicatum)、猫尾草(Phleum pratense) Λ 草地早熟禾(Poa pratensis)、甘蔴(Saccharum officinarum)、云南害！]手密(Saccharum spontaneum)、苏丹草(Sorghum sudanense)、硬粒小麦(Triticum durum)、一粒小麦 (Triticummonococcum)、香荚兰(Vanilla fragrans)禾口玉米(Zea mays)。优选的植物来自毒麦属和车轴草属。特别优选的种是黑麦草和白三叶。特别优选的单子叶植物的种是黑麦草和水稻。术语“植物”包括完整植物、植物的任何部分、繁殖体和植物的子代。术语“繁殖体”意思是可用于再生或繁殖(无论有性的还是无性的)的任何植物部分，包括种子和插条(cutting)。详细描述一般性定义本说明书中所用的术语“包含(comprising)”意思是“至少部分由……组成”。当解读本说明书中每个包括术语“包含”的陈述时，还可以存在除了跟在该术语之后的那个或那些特征之外的特征。相关的术语例如“包含(comprise)”和“包含(comprises) ”应以相同的方式解读。在本说明书中，当提及专利说明书、其它外部文献或其它信息来源时，这一般是为了提供上下文以讨论本发明特征的目的。除非另有特别指明，否则提及这样的外部文献不应被解释为承认这样的文献或这样的信息来源在任何管辖内是现有技术或构成本领域公知常识的部分。多核苷酸和片段本文所用的术语“多核苷酸”意思是单链或双链的任何长度的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，但优选为至少15个核苷酸，并且包括(作为非限制性例子)基因的编码和非编码序列、正义和反义序列互补物、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、pre-mRNA、 mRNA、rRNA、siRNA、miRNA, tRNA、核糖酶、重组多肽、分离的和纯化的天然产生的DNA或RNA 序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。本文提供的多核苷酸序列的“片段”是能够与目标靶特异性杂交的连续核苷酸的亚序列，例如，长度为至少15个核苷酸的序列。本发明的片段包含本发明的多核苷酸的连续核苷酸的15个核苷酸，优选至少20个核苷酸，更优选至少30个核苷酸，更优选至少50 个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，最优选至少60个核苷酸。多核苷酸序列的片段可用于反义、基因沉默、三螺旋或核糖酶技术，或作为引物、探针被包括在微阵列内，或用于本发明的基于多核苷酸的选择方法。术语“引物”是指短的多核苷酸，通常具有自由的3’ OH基团，其与模板杂交并用于启动与靶标互补的多核苷酸的聚合。术语“探针”是指用于在基于杂交的检验中检测与探针互补的多核苷酸序列的短的多核苷酸。探针可以由本文定义的多核苷酸的“片段”组成。多肽和片段本文所用的术语“多肽”包括任意长度的氨基酸链，但是优选为至少5个氨基酸， 包括全长的蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本发明的多肽可以是纯化的天然产物，或者可以部分或全部使用重组或合成技术产生。该术语可以指多肽、多肽的聚集体例如二体或其它多聚体、融合多肽、多肽片段、多肽变体或其衍生物。多肽的“片段”是多肽的亚序列，其实现生物活性所需要的功能和/或提供多肽的三维结构。该术语可以指能够实现上述酶学活性的多肽、多肽的聚集体例如二体或其它多聚体、融合多肽、多肽片段、多肽变体或其衍生物。对于本文公开的多核苷酸或多肽的序列所用的术语“分离的”是指脱离其天然细胞环境的序列。分离的分子可以通过任何方法或方法的组合获得，包括生物化学、重组和合成技术。术语“重组体”是指脱离其天然环境中环绕它的序列的多核苷酸序列，和/或与那些不存在于其天然环境中的序列进行重组的多核苷酸序列。“重组的”多肽序列通过翻译“重组的”多核苷酸序列而产生。关于本发明的多核苷酸或多肽的术语“源自”(源自特定的属或种)意思是该多核苷酸或多肽与那些在该属或种中天然发现的多核苷酸或多肽具有相同的序列。因此可通过合成或重组产生源自特定的属或种的多核苷酸或多肽。变体本文所用的术语“变体”是指与具体指明的序列不同的多核苷酸或多肽的序列，其中删除、替换或添加了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。变体可以是天然产生的等位基因变体，或非天然产生的变体。变体可以来自相同的物种或其它物种，可以包括同源物、旁系同源物和直系同源物。在一些具体实施方式
中，本发明的多肽和多肽的变体与本发明的多肽或多肽变体具有相同或相似的生物学活性。提及多肽和多肽时的术语“变体”包括本文定义的所有形式的多肽和多肽。多核苷酸变体变体多核苷酸序列相对于指明的多核苷酸序列优选显示出至少50%，更优选至少 51%,更优选至少52%，更优选至少53%，更优选至少M%，更优选至少55%，更优选至少 56 %，更优选至少57 %，更优选至少58 %，更优选至少59 %，更优选至少60 %，更优选至少 61%,更优选至少62%，更优选至少63%，更优选至少64%，更优选至少65%，更优选至少 66 %，更优选至少67 %，更优选至少68 %，更优选至少69 %，更优选至少70 %，更优选至少 71%，更优选至少72%，更优选至少73%，更优选至少74%，更优选至少75%，更优选至少 76 %，更优选至少77 %，更优选至少78 %，更优选至少79 %，更优选至少80 %，更优选至少 81%,更优选至少82%，更优选至少83%，更优选至少84%，更优选至少85%，更优选至少 86 %，更优选至少87 %，更优选至少88 %，更优选至少89 %，更优选至少90 %，更优选至少 91%,更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，更优选至少95%，更优选至少 96 %，更优选至少97 %，更优选至少98 %，最优选至少99 %的同一性。在指明的多核苷酸序列的至少20个核苷酸位置，优选至少50个核苷酸位置，更优选至少100个核苷酸位置，最优选其全长的比较窗口中找到同一性。可以根据以下方式确定多核苷酸的序列同一性。使用bl2seq(Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), " Blast 2 sequences-a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences" , FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250) 中的BLASTN (来自程序的BLAST套装软件(the BLAST suite of programs)，版本 2. 2.5[2002 年 11 月])(其可以公开地从 NCBI (ftp://ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)获得) 将主题多核苷酸序列与候选多核苷酸序列进行比较。使用blkeq的缺省参数，只是需要关闭低复杂性部分的滤除。可以使用以下的imix命令行参数测定多核苷酸序列的同一性bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F -ρ blastn参数-F F关闭低复杂性部分的滤除。参数-P为序列对选择合适的算法。blkeq 程序在行“同一性=”中以相同核苷酸的数字和百分率报告序列同一性。也可以使用全域序列比对程序(例如Needleman，S. B.和Wunsch，C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453)在候选和主题多核苷酸序列之间的重叠的全长上计算多核苷酸的序列同一'性。可以在 EMBOSS 程序包(Rice，P. Longden, I.和 Bleasby，A. EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite,Trends in GeneticsJune 2000,vol 16,No 6. pp. 276-277 其可以从http://www. hRmp. mrc. ac. uk/Software/EMBOSS/获得)的 needle程序中找到Needleman-Wunsch全域比对算法的完全应用。欧洲生物信息学研究所服务器也提供工具而在http:/WWW. ebi. ac. uk/emboss/align/上在线进行两个序列之间的EMBOSS-needle全域比对。或者可以使用GAP程序，其计算两个序列的最佳全域比对而无处罚末端空隙。 在以下文章中描述了 GAP :Huang，X. (1994)0n Global Sequence Alignm ent. Computer Applications in the Biosciences 10,227-235。本发明的多核苷酸变体还包括那些与一个或多个具体指明的序列显示相似性的序列，其可能保留那些序列的功能等同性，并且不能合理地被预计通过随机的机会产生。这样的关于多肽的序列相似性可以使用从NCBI (ftp //ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)来自程序的BLAST套装软件(版本2. 2. 5[2002年11月])公开获得的bl2seq程序来确定。可以使用以下的imix命令行参数测定多核苷酸序列的相似性bl2seq-i nucleotideseq l_j nucleotideseq2_F F -ρ tblastx参数-F F关闭低复杂性部分的滤除。参数-P为序列对选择合适的算法。该程序在序列间找到相似性区，对于每个这样的区域报告一个“E值”，E值是在含有随机序列的固定参考大小的数据库中可以预期随机见到这样的匹配的预期次数。该数据库的大小在 bl2seq程序中设定为缺省值。对于小的E值(远小于1)，E值大约是这样的随机匹配发生的概率。当与任何一个具体指明的序列相比时，变体多核苷酸序列优选显示出1X10,以下，更优选1X 10_2°以下，更优选1 X 10_3°以下，更优选1 X 10_4°以下，更优选1 X 10_5°以下， 更优选1 X10,以下，更优选1 X 10_7°以下，更优选1 X 10_8°以下，更优选1 X 10,以下，更优选1 X 10,°以下，更优选1 X 以下，最优选1 X 10_12°以下的E值。或者，本发明的变体多核苷酸在严谨条件下与指明的多核苷酸序列或其互补物杂 、-父。术语“在严谨条件下杂交”及其语法等同物是指在确定的温度和盐浓度的条件下，多核苷酸分子与靶多核苷酸分子(例如固定于DNA或RNA印迹例如Southern印迹或 Northern印迹上的靶多核苷酸分子)杂交的能力。可以通过最初在低严谨条件下杂交然后将严谨度增加至需要的严谨度来确定在严谨杂交条件下的杂交能力。对于长度为大约100个碱基以上的多核苷酸分子，通常的严谨杂交条件为不低于原态双链的熔解温度(Tm)的25至30°C (例如，10°C )以下(一般性参见，Sambrook等人 Eds,1987,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Ed. ColdSpring Harbor Press ； Ausubel 等人，1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing)。 对于大约100个碱基以上的多核苷酸分子，其Tm值可以根据公式Tm = 81.5+0.41% (G+C-log(Na+). (Sambrook 等人，Eds, 1987,MolecularCloning,A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ；Bolton andMcCarthy, 1962, PNAS 84 :1390)计算。对于长度为100个碱基以上的多核苷酸，通常的严谨条件为下列的杂交条件例如在6X SSC, 0.2% SDS的溶液中预先洗涤；在65°C，6X SSC, 0.2% SDS中杂交过夜；然后在65°C，IX SSC,0. 1% SDS中洗涤两次，每次30分钟，然后在65°C，0. 2X SSC, 0. 1% SDS中洗涤两次， 每次30分钟。对于长度为100个碱基以下的多核苷酸分子，示例性的严谨杂交条件为Tm以下5 至10°C。平均来讲，长度为IOObp以下的多核苷酸分子的Tm大约下降(500/寡核苷酸长度)°C。对于被称作肽核酸(PNA)的DNA类似物(Nielsen等人，Science. 1991 Dec6 ； 254 (5037) 1497-500)，其iTm值比DNA-DNA或DNA-RNA杂交体的要高，可以使用根据Giesen 等人，Nucleic Acids Res. 1998 Nov 1 ；26 (21) :5004-6 描述的公式计算。具有 100 个碱基以下长度的DNA-PNA杂交体的示例性的严谨杂交条件为Tm以下5至10°C。本发明的变体多核苷酸还包括这样的多核苷酸其与本发明的序列不同，但是由于遗传密码的简并性的结果，其编码与本发明的多核苷酸编码的多肽具有相似活性的多肽。不改变多肽的氨基酸序列的序列改变是“沉默变异”。除了 ATG(蛋氨酸)和TGG(色氨酸)之外，可以通过本领域承认的技术改变同一个氨基酸的其它密码子，例如为了在特定宿主生物中使密码子的表达最优化。本发明还包括在编码的多肽序列中引起一个或几个氨基酸的保守性替换而不显著改变其生物学活性的多核苷酸序列的改变。本领域技术人员将知道进行表型沉默氨基酸替换的方法(参见，例如Bowie等人，1990，Science 247，1306)。可以使用从NCBI (ftp //ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)公开获得的来自程序的 BLAST套装软件(版本2. 2. 5 [2002年11月])的blkeq程序通过如上所述的tblastx算法来确定由于编码的多肽序列中的沉默变异和保守性替换而产生的变体多核苷酸。多肽变体提及多肽时的术语“变体”包括天然产生的、重组的和合成产生的多肽。变体多肽序列相对于本发明的序列优选显示出至少50%，更优选至少51%，更优选至少52%，更优选至少53 %，更优选至少M %，更优选至少55 %，更优选至少56 %，更优选至少57 %，更优选至少58 %，更优选至少59 %，更优选至少60 %，更优选至少61 %，更优选至少62 %，更优选至少63 %，更优选至少64 %，更优选至少65 %，更优选至少66 %，更优选至少67 %，更优选至少68 %，更优选至少69 %，更优选至少70 %，更优选至少71 %，更优选至少72 %，更优选至少73 %，更优选至少74 %，更优选至少75 %，更优选至少76 %，更优选至少77 %，更优选至少78 %，更优选至少79 %，更优选至少80 %，更优选至少81 %，更优选至少82 %，更优选至少83 %，更优选至少84 %，更优选至少85 %，更优选至少86 %，更优选至少87 %，更优选至少88 %，更优选至少89 %，更优选至少90 %，更优选至少91 %，更优选至少92 %，更优选至少93 %，更优选至少94 %，更优选至少95 %，更优选至少96 %，更优选至少97 %，更优选至少98 %，最优选至少99 %的同一性。在本发明的多肽的至少20个氨基酸位置，优选至少50个氨基酸位置，更优选至少100个氨基酸位置，最优选其全长的比较窗口中找到同一性。可以根据以下方式确定多肽的序列同一性。使用blkeq中的BLASTP(来自程序的BLAST套装软件，版本2. 2. 5 [2002年11月])(其可以公开地从NCBI (ftp://ftp.ncbi. nih. Rov/blast/)获得)将主题多肽序列与候选多肽序列进行比较。使用blkeq的缺省参数，只是需要关闭低复杂性区的滤除。也可以使用全域序列比对程序在候选和主题多核苷酸序列之间的重叠的全长上计算多肽的序列同一性。如上文讨论的EMB0SS_needle(可以从http:/www. ebi. ac. uk/ emboss/align/获得)禾口 GAP(Huang，X. (1994)On GlobalSequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10，227-235)也是合适的用于计算多肽的序列同一性的全域序列比对程序。上面描述的BLASTP用途优选用于确定根据本发明的多肽变体。本发明的多肽变体还包括那些与一个或多个具体指明的序列显示相似性的序列， 其可能保留那些序列的功能等同性，并且不能合理地被预计通过随机的机会产生。这样的关于多肽的序列相似性可以使用从NCBI (ftp //ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)公开获得的来自程序的BLAST套装软件(版本2. 2. 5[2002年11月])的blkeq程序来确定。可以使用以下的imix命令行参数测定多肽序列的相似性bl2seq-i peptideseql-j peptideseq2_F F -ρ blastp当与任何一个具体指明的序列相比时，变体多肽序列优选显示出1X10,以下，更优选1 X 10_2°以下，更优选1 X 10_3°以下，更优选1 X 10_4°以下，更优选1 X 10_5°以下，更优选1 X 10_6°以下，更优选1 X 10_7°以下，更优选1 X 10_8°以下，更优选1 X 10_9°以下，更优选 1 X10-1°°以下，更优选1 X 10_110以下，更优选1 X 10_120以下，更优选1 X 10_130以下，更优选 1 X 10_140以下，更优选1 X 10_150以下，更优选1 X 10_16°以下，更优选1 X 10_170以下，更优选 1 X10-·以下，更优选1 X 10_190以下，更优选1 X 10_200以下，更优选1 X 10_210以下，更优选 IXlO-220以下，最优选1 X 10—222以下的E值。参数-F F关闭低复杂性部分的滤除。参数-P为序列对选择合适的算法。该程序在序列间找到相似性区，对于每个这样的区域报告一个“E值”，E值是在含有随机序列的固定参考大小的数据库中可以预期随机见到这样的匹配的预期次数。对于小的E值(远小于 1)，E值大约是这样的随机匹配发生的概率。本发明还包括所描述的多肽序列的一个或几个氨基酸的保守性替换(而不显著改变其生物学活性)。本领域技术人员将知道进行表型沉默氨基酸替换的方法(参见，例如 Bowie 等人，1990，Science 247，1306)。构建体、载体及其成分术语“遗传构建体”是指这样的多核苷酸分子，其通常为双链DNA，其中可以插入另一个多核苷酸分子(插入的多核苷酸分子)例如但不限于，cDNA分子。遗传构建体可以含有允许插入的多核苷酸分子转录的，以及可选的将转录本翻译成多肽的必需元件。插入的多核苷酸分子可以源自宿主细胞，或者可以源自不同的细胞或生物和/或可以是重组的多核苷酸。一旦进入宿主细胞，遗传构建体可以整合进入宿主的染色体DNA。遗传构建体可以与载体相连。术语“载体”是指这样的多核苷酸分子，其通常为双链DNA，用于将遗传构建体运送至宿主细胞。载体能够在至少一个另外的宿主系统例如大肠杆菌(E.coli)中复制。术语“表达构建体”是指包括允许插入的多核苷酸分子转录的，以及可选的将转录本翻译成多肽的必需元件的遗传构建体。表达构建体通常以5’至3’方向包含a)在构建体转化进入的宿主细胞中有功能的启动子；b)要表达的多核苷酸；和c)在构建体转化进入的宿主细胞中有功能的终止子。术语“编码区域”或“开放读码框”(ORF)是指基因组DNA序列或cDNA序列的正义链，其能够在合适的调控序列的控制下产生转录产物和/或多肽。编码序列由5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子的存在而鉴别。当插入遗传构建体中时，当“编码序列”与启动子和终止子序列可操作地连接时，“编码序列”能够表达。 “可操作地连接”意思是要表达的序列置于调控元件(包括启动子、组织特异性调控元件、时间调控元件、增强子、抑制子和终止子)的控制之下。术语“非编码区域”是指在翻译起始位点上游和翻译终止位点下游的非翻译序列。 这些序列也被分别称为5’UTR和3’UTR。这些区域包括转录起始和终止以及调节翻译效率所需的元件。终止子是终止转录的序列，存在于基因的3’非翻译末端，被翻译的序列的下游。终止子是mRNA稳定性的重要决定者，在一些情况下，发现终止子具有空间调控功能。术语“启动子”是指调节基因转录的位于编码区域上游的非转录顺式调控元件。启动子包含顺式起始元件(其指明转录的起始位点)和保守性的盒例如TATA盒，以及被转录因子结合的基序。“转基因”是从一个生物中取出并通过转化被导入一个不同生物的多核苷酸。转基因可以源自相同的物种或来自与转基因所导入的生物的物种不同的物种。“反向重复”是重复序列，其中重复的后一半在互补链中，例如(5，) GATCTA.......TAGATC (3，)(3，) CTAGAT.......ATCTAG (5，)通读转录将产生这样的转录本，其进行互补性碱基配对以形成发夹结构，只要在重复区域之间有3-5pb的间隔子。“转基因植物”是指由于遗传操作或转化的结果而含有新的遗传材料的植物。新的遗传材料可以源自于得到的转基因植物相同的物种或来自不同物种。术语“改变本发明的多核苷酸或多肽的表达”和“本发明的多核苷酸或多肽的改变的表达”包括这样的情况对应于本发明的多核苷酸的基因组DNA被修饰，因而引起本发明的多核苷酸或多肽的改变的表达。可以通过遗传转化或本领域已知的用于诱导突变的其它方法进行基因组DNA的修饰。“改变的表达”可以与信使RNA和/或产生的多肽的量的增加或减少相关，也可以由于产生的多核苷酸和多肽的序列改变而引起多肽的活性改变。术语“种子产量”是指植物产生的种子或谷粒的大小和/或质量和/或数目。因此，相对于相同年龄或等同发育阶段的合适的对照植物来说，具有增加的种子产量的植物具有增加的大小和/或质量和/或数目的种子或谷粒。相反，相对于相同年龄或等同发育阶段的合适的对照植物来说，具有减少的种子产量的植物具有增加的大小和/或质量和/ 或数目的种子或谷粒。合适的对照植物可以包括相同物种和品种的非转化植物，或以对照构建体转化的相同的物种和品种的植物。提及种子产量时的术语“改变的”包括种子产量的减少或增加。提及种子产量时的术语“调节”包括减少或增加种子的产量。本发明提供了产生和/或选择相对于合适的对照植物来说具有改变的种子产量的植物的方法，包括具有增加的和减少的种子产量的植物以及通过这样的方法产生的植物。本发明提供了编码调节植物中种子产量的多肽(SEQ ID N0:1)的多核苷酸(SEQ ID N0:34)。本发明提供了编码SEQ ID NO 1的多肽的变体(SEQ ID NO 2-31)的SEQ IDNO 34的多核苷酸的变体(SEQ ID NO :35-65)。本申请人还鉴定了存在于SEQ ID NO :1_31 中的共有多肽序列(SEQ ID NO :32)和存在于选自SEQ ID NO :1_31的单子叶植物的序列中的第二个共有多肽序列(SEQ ID N0:33)。分离或产生多核苷酸的方法可以使用本领域技术人员已知的各种技术分离本发明的多核苷酸分子。举例来说，可以通过使用 Mullis 等人，Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Biridiauser (通过引用并入本文)中描述的聚合酶链式反应(PCR)分离这样的多核苷酸。 可以使用本文定义的源自本发明的多核苷酸序列的引物扩增本发明的多肽。分离本发明的多核苷酸或可用于本发明的方法的多核苷酸的其它方法包括使用全部或部分的本文列出的作为杂交探针的多核苷酸。将标记的多核苷酸探针与固定于固体支持物(例如硝酸纤维素膜或尼龙膜)上的多核苷酸杂交的技术可用于筛选基因组或 cDNA库。示例性的杂交和洗涤条件为于65°C在5. OX SS°C，0. 5 %十二烷基硫酸钠，IX Denhardt' s溶液中杂交20小时；在1. OX SSC, 1% (w/v)十二烷基硫酸钠中洗涤(三次， 每次在55°C洗涤20分钟)，可选地在60°C，0. 5X SSC, 1 % (w/v)十二烷基硫酸钠中洗涤1 次(20分钟)。可选地，可以在60°C，0. IX SSC, 1% (w/v)十二烷基硫酸钠的条件下再洗涤一次(20分钟)。可以通过本领域熟知的技术产生本发明的多核苷酸片段，例如限制性内切酶消化和寡核苷酸合成。多核苷酸序列的一部分可用于本领域熟知的方法以鉴定相应的全长多核苷酸序列。这样的方法包括基于 PCR 的方法，5，RACE (Frohman ΜΑ, 1993，MethodsEnzymol. 218 340-56)和基于杂交的方法，基于计算机/数据库的方法。另外，举例来说，反向PCR允许获得从基于已知区域的引物开始，本文公开的多核苷酸序列侧翼的未知序列(Triglia等人， 1998,Nucleic Acids Res 16，8186，通过引用并入本文)。该方法使用几个限制性酶以在基因的已知区域产生合适的片段。然后该片段通过分子内的连接而环化并用作PCR的模板。 从已知的区域设计分散引物(divergent primer)。为了物理组合全长克隆，可以使用标准分子生物学方法(Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold SpringHarbor Press,1987)。当从特定物种产生转基因植物时，以序列或源自该物种的序列转化这样的植物可能是有益的。该益处可以缓解公众对于跨物种转化而产生转基因生物的担心。另外，当某基因的下调是想要的结果时，可能需要使用与植物(希望其中的表达降低)中的序列相同 (或至少高度相似)的序列。由于这些原因(除了其它的之外)，所以需要能够鉴定并分离几个不同植物物种中特定基因的直系同源物。可以通过所描述的方法鉴定变体(包括直系同源物)。鉴定变体的方法物理方法可以使用基于PCR的方法鉴定变体多核苷酸(Mullis等人，Eds. 1994 ThePolymerase Chain Reaction, Birkhauser)。通常，用于通过PCR扩增变体多核苷酸分子的引物的多核苷酸序列可以基于编码相应氨基酸序列的保守性区域的序列。或者，可以使用本领域技术人员熟知的库筛选方法(Sambrook等人，
16MolecularCloning :A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press，1987)。当鉴定探针序列的变体时，杂交和/或洗涤的严谨度通常比寻找完整序列匹配时要低。还可以通过物理方法鉴定多肽变体，例如通过使用针对本发明多肽产生的抗体来蹄选表达库(Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987)或通过这样的抗体的帮助从天然来源鉴定多肽。基于计算机的方法还可以使用公共的结构域序列比对算法和序列相似性搜索工具(以搜索序列数据库)(公共的结构域数据库包括Genbank，EMBL, Swiss-Prot, PIR和其它)通过本领域技术人员熟知的基于计算机的方法鉴定多核苷酸和多肽的变体。参见例如Nucleic Acids Res. 29 =I-IOand 11_16，2001，例如在线来源。相似性搜索检索并比对靶序列以与待分析的序列(即待查询序列)进行比较。序列对比算法使用得分阵距以分配给每个比对一个总体分值。用于在序列数据库中鉴定变体的示例性的程序家族为程序的BLAST套装软件(版本 2. 2. 5[2002 年 11 月])包括 BLASTN，BLASTP, BLASTX, tBLASTN 禾口 tBLASTX,可以从(ftp//ftp, ncbi. nih. gov/blast/)或从 National Center for BiotechnologyInformation(NCBI), National Library of Medicine,Building 38A,Room 8N805,Bethesda,MD 20894 USA公开地获得。NCBI服务器还提供使用程序筛选一些可公开获得的序列数据库的工具。BLASTN比较待查询核苷酸序列和数据库核苷酸序列。BLASTP 比较待查询氨基酸序列和数据库蛋白序列。BLASTX比较以所有读码框翻译的待查询核苷酸序列和数据库蛋白序列。tBLASTN比较待查询蛋白序列和以所有读码框动态翻译的数据库核苷酸序列。tBLASTX比较待查询核苷酸序列的六框翻译和数据库核苷酸序列的六框翻译。可以以缺省参数使用BLAST程序或者按照需要改变参数以改善筛选。BLAST家族算法(包括BLASTN，BLASTP和BLASTX)的使用在Altschul等人的论文 Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402，1997 中有描述。BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN, tBLASTX或相似算法产生的待查询序列对于一个或多个数据库序列的“命中”比对并鉴定序列的相似部分。命中按照相似度的顺序和序列重叠的长度而排列。对数据库序列的命中一般代表只有待查询序列的序列长度的一部分
上重叠。BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN 和 tBLASTX 算法还产生比对的“预计”值。预计值(E)表示当搜索含有随机连续序列的相同大小的数据库时能够“预计”随机见到的命中的数目。预计值用作显著性临界值以确定对数据库的命中是否表示真实的相似性。例如， 分配给多核苷酸命中的E值为0. 1被解读为意思是在所筛选的数据库大小的数据库中，可以在具有相似得分的序列比对的部分上能够简单地通过随机预计见到0. 1个匹配。对于在比对和匹配部分上具有0. 01或更低的E值的序列，使用BLASTN，BLASTP, BLASTX, tBLASTN 或tBLASTX算法在该数据库中随机发现匹配的概率是或更低。可以使用DbCLUSTAL (Thompson J. D.，Plewnial F.，Thierry J. -C.禾Π Poch 0. (2000)Rapid and reliable global multiple alignments of protein sequences detected bydatabase searches. Nucleic Acid Research, Vol. 28, No 15 :2919_2926, http://www. ebi. ac. uk/cgi-bin/dbclustal/submit)或 CLUSTALff (Thompson,J. D. , Higgins, D. G.和 Gibson, Τ. J. (1994)CLUSTALff improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions—specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22 :4673-4680, http://www-iRbmc. u~strasbR. fr/BioInfo/Clustalff/Top. html)或 T-COFFEE(Cedric Notredame, Desmond G. Higgins, Jaap Heringa, T-Coffee A novelmethod for fast and accurate multiple sequence alignment, J. Mol. Biol. (2000)302 :205-217))或 PILEUP (其使用累进的成对比对)(Feng 和 Doolittle，1987， J. Mol. Evo 1. 25，351)进行一组相关序列的多重序列比对。可以获得模式识别软件应用以寻找基序或标志序列。例如，MEME(MultipleEm for Motif Elicitation)在一组序列中寻找基序和标志序列，MAST (Mot if Alignment and Search Tool)使用这些基序在待查询序列中鉴定相似或相同的基序。MAST的结果作为一系列的具有合适的统计学数据的比对和所发现的基序的可视概况而提供。MEME和MAST由 University of California, San Diego 开发。PR0SITE (Bairoch 禾口 Bucher，1994，Nucleic Acids Res. 22，3583 ;Hofmann 等人， 1999,Nucleic Acids Res. 27,215)是鉴定从基因组或cDNA序列翻译而来的未鉴定的蛋白的功能的方法。PR0SITE数据库(www, expasy. org/prosite)含有生物学显著模式和概述， 其被设计为可以使用合适的计算机工具将新的序列分配给已知的蛋白家族或确定在序列中存在何种已知的结构域(Falquet 等人，2002，Nucleic Acids Res. 30,235) Prosearch 是一种可以按照给定序列模式或标志搜索SWISS-PR0T和EMBL数据库的工具。分离多肽的方法可以使用本领域熟知的肽合成方法(例如使用固相技术(例如Mewart等人， 1969,in Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California) 直接合成肽或自动化合成(例如使用Applied Biosystems 431A肽合成仪(Foster City, California)))来制备本发明的多肽，包括变体多肽。也可以在这样的合成中产生突变形式的多肽。还可以使用本领域已知的各种技术(例如Deutscher，1990，Ed, Methods inEnzymology，Vol. 182，Guide to Protein Purification)从天然来源纯化本发明的多月太和变体多肽。或者可以在合适的宿主细胞中重组表达本发明的多肽和变体多肽并按照以下讨论从细胞中分离本发明的多肽和变体多肽。产生构建体和载体的方法本发明的遗传构建体包含一个或多个本发明的多核苷酸序列和/或编码本发明的多肽的多核苷酸，可用于转化例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物。本发明的遗传构建体包括本文定义的表达构建体。用于产生和使用遗传构建体和载体的方法是本领域熟知的，在Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press,1987 ； Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987)中
有一般性描述。产生包含构建体和载体的宿主细胞的方法
技术领域：
本发明提供了包含本发明的遗传构建体或载体的宿主细胞。宿主细胞可以源自例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物。包含本发明的遗传构建体(例如表达构建体)的宿主细胞可用于本领域熟知的方法(例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. ColdSpring Harbor Press, 1987 ；Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987)以重组产生本发明的多肽。这样的方法可以包括在合适的培养基中在适合于或有益于表达本发明多肽的条件下培养宿主细胞。然后可以通过本领域熟知的方法(例如 Deutscher，Ed，1990，Methods in Enzymology, Vol 182，Guide to Protein Purification)将所表达的重组多肽(其可选地可以被分泌到培养物中)从培养基、宿主细胞或培养基中分离出来。本发明的宿主细胞还可用于生产由所表达的本发明多肽产生的酶产物的方法。这样的方法可以包括可选地当存在用于所表达的本发明多肽的另外的酶底物时，在适合表达本发明的重组多肽的培养基中培养本发明的宿主细胞。然后可以通过各种本领域标准方法将产生的酶产物从宿主细胞或培养基中分离出来。产生包含构建体和载体的植物细胞和植物的方法本发明还提供了包含本发明的遗传构建体的植物细胞和为了改变本发明的多核苷酸或多肽的表达而修饰的植物细胞。包含这样的细胞的植物也构成本发明的一个方面。可以通过本发明的方法产生具有改变的种子产量的植物。这样的方法可以包括以构建体(其被设计为改变能够调节这样的植物细胞和植物中种子产量的多核苷酸或多肽的表达)转化植物细胞和植物。这样的方法还包括以构建体(其被设计为改变能够调节这样的植物细胞和植物中种子产量的一个或多个多核苷酸或多肽的表达)的组合转化植物细胞和植物。在 Draper 等人，1988, Plant Genetic Transformation and Gene Expression. ALaboratory Manual. Blackwell Sci.Pub. Oxford, p. 365 ；Potrykus 和 Spangenburg, 1995, Gene Transfer to Plants. Springer-Verlag, Berlin.；和 Gelvin 等人，1993, PlantMolecular Biol. Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht 中描述了以多核苷酸转化植物细胞、植物及其部分的方法。在Galun和Breiman，1997，Transgenic Plants. ImperialCollege Press，London中提供了关于转基因植物(包括转化技术)的综述。遗传操作植物的方法一些遗传操作植物的策略是可以获得的(例如Birch，1997，Ann Rev Plant PhysPlant Mol Biol，48，297)。例如，策略可被设计为在正常表达多核苷酸/多肽的植物细胞、器官和/或特定发育阶段中增加多核苷酸/多肽的表达，或者在不正常表达多核苷酸 /多肽的细胞、组织、器官和/或特定发育阶段中异位表达多核苷酸/多肽。所表达的多核苷酸/多肽可以源自待转化的植物物种或者可以源自不同的植物物种。可以将转化策略设计为在正常表达多核苷酸/多肽的植物细胞、组织、器官或特定发育阶段中减少多核苷酸/多肽的表达。这样的策略被称为基因沉默策略。转基因植物中用于基因表达的遗传构建体通常包括用于驱动一个或多个克隆的多核苷酸表达的启动子、终止子和检测在转化植物中存在遗传构建体的选择性标记序列。适合用于本发明的构建体中的启动子在单子叶植物或双子叶植物的细胞、组织或器官中是功能性的，包括细胞、组织和器官特异性的启动子，细胞周期特异性启动子，时间启动子，可诱导启动子，在多数植物组织中有活性的组成性启动子和重组启动子。启动子的选择将取决于所需要的克隆的多核苷酸的时间和空间的表达。启动子可以是那些通常与目标转基因相连的启动子或源自其它植物、病毒和植物病原性细菌和真菌的基因的启动子。本领域技术人员无需经过过量实验即能够选择适合用于使用包含本发明的多核苷酸序列的遗传构建体而改变和调节植物特性的启动子。组成性植物启动子的例子包括CaMV 35S 启动子，胭脂碱合成酶启动子和章鱼碱合成酶启动子，以及来自玉米的Ubi 1启动子。在科技文献中描述了在特异性组织中有活性的，对内部发育信号或外部非生物或生物的压力有反应的植物启动子。在例如WO 02/00894 (通过引用并入本文)中描述了示例性的启动子。通常用于植物转化遗传构建体的示例性的终止子包括例如花椰菜花叶病毒 (CaMV) 35S终止子、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶或章鱼碱合成酶终止子、玉米(Zea mays) zin基因终止子、水稻(Oryza sativa) ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子和马铃薯(Solanum tuberosum)PI-II终止子。通常用于植物转化的选择性标记包括新霉素磷酸转移酶II基因(NPT II)，其赋予卡那霉素抗性；aadA基因，其赋予奇霉素和链霉素抗性；草丁膦乙酰转移酶(bar基因)， 其赋予Ignite (AgrEvo)和Basta (Hoechst)抗性；以及潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)，其赋予潮霉素抗性。还考虑到可用于分析植物和植物组织中的启动子表达的包含报告基因(其编码表达对于宿主来说为外源的活性(通常为酶活性和/或可见信号(例如荧光素酶、GUS、 GFP))的序列)的遗传构建体的使用。关于报告基因的文献见综述=Herrera-Estrella等人，1993，Nature 303，209 禾口 Schrott，1995，In =Gene Transfer toPlants(Potrykus, Τ.， Spangenbert. Eds)Springer Verlag. Berline, pp.325—336。基因沉默策略可聚集在基因本身或影响编码多肽的表达的调控元件。“调控元件” 在本文中以最可能宽的意义使用且包括其它的与目标基因相互作用的基因。设计为减少本发明的多核苷酸/多肽的表达或使其沉默的遗传构建体可以包括本发明的多核苷酸的反义拷贝。在这样的构建体中，多核苷酸被置于相对于启动子和终止子的反义方向。通过将多核苷酸或多核苷酸的部分倒置而获得“反义”多核苷酸，从而所产生的转录本将与基因的mRNA转录本互补，例如5’ GATCTA 3’(编码链) 3’ CTAGAT 5’(反义链)3，CUAGAU 5，mRNA5，GAUCUCG 3，反义 RNA设计用于基因沉默的遗传构建体还可以包括反向重复。“反向重复”是重复序列， 其中重复的后一半在互补链中，例如5，GATCTA.......TAGATC-3，3’ CTAGAT.......ATCTAG-5’ 形成的转录本可以进行互补性碱基配对以形成发夹结构。发夹结构的形成通常需要在重复区域之间有3-5pb的间隔子。 另一个沉默方法包括使用靶向等同于miRNA的转录本的小的反义RNA(Llave等人，2002，Science 297,2053).也明确考虑到这样的对应于本发明的多核苷酸的小的反义RNA的使用。本文所用的术语遗传构建体还包括小的反义RNA和其它这样的影响基因沉默的多肽。以本文定义的表达构建体进行转化还可能通过被称为正义抑制的过程引起基因沉默(例如 Napoli 等人，1990，Plant Cell 2,279 ；de Carvalho Niebel 等人，1995，Plant Cell，7，347)。在一些情况下，正义抑制可以包括全部或部分编码序列的过表达，但还可以包括基因的非编码区域例如内含子或5’或3’非翻译区域(UTR)的表达。可以使用嵌合的部分正义构建体协调地使多个基因沉默(Abbott等人，2002，Plant Physiol. 128(3) 844-53 Jones等人，1998，Planta 204:499-505)。使用这样的正义抑制策略以使本发明的多核苷酸的表达沉默也考虑在内。设计用于基因沉默的遗传构建体中的多核苷酸插入物可以对应于编码序列和/ 或非编码序列，例如启动子和/或内含子和/或5’或3’ UTR序列，或相应的基因。其它的基因沉默策略包括显性负性方法和使用核糖酶构建体(Mclntyre，1996， Transgenic Res，5，257)0可以通过基因本身的突变或其调控元件的突变引起转录前沉默。这样的突变可以包括点突变、移框、插入、删除和取代。以下的代表性文献公开了可以用于遗传转化下列植物物种的遗传转化规程水稻(Alam等人，1999，Plant Cell R印.18，572)；玉米(美国专利系列号5，177，010和 5, 981, 840)；小麦(Ortiz 等人，1996，Plant Cell Rep. 15,1996,877)；番茄(美国专利系列号 5，159，135)；马铃薯(Kumar 等人，1996 Plant J. 9，:821)；木薯(Li 等人，1996 Nat. Biotechnology 14，736)；莴苣(Michelmore 等人，1987，Plant Cell Rep. 6,439)； 烟草(Horsch等人，1985，Science 227，1229)；棉花(美国专利系列号5，846，797和 5，004，863)；草(美国专利号 5，187，073,6. 020，539)；薄荷(Niu 等人，1998，Plant Cell Rep. 17,165)；柑橘属植物(Pena 等人，1995，Plant Sci. 104,183)；香菜(Krens 等人， 1997，Plant Cell Rep, 17, 39)；香蕉(美国专利系列号5，792，935)；大豆(美国专利号 5，416，011 ；5，569，834 ；5，824，877 ；5，563，04455 和 5，968，830)；菠萝(美国专利系列号 5, 952, 543)；白杨(美国专利号4，795，855)；一般性单子叶植物(美国专利号5，591，616 和6，037，522)；芸苔(美国专利号5，188，958 ；5, 463，174和5，750，871)；和谷类(美国专利号6，074，877)。其它的物种也考虑在内，本领域技术人员使用的合适的方法和规程可以在科学文献中获得。本领域已知的几个其它方法可以用于改变本发明的核苷酸和/或多肽的表达。 这样的方法包括但不限于Tilling(Till等人，2003，Methods Mol Biol，2 %，205)，所谓的 “Deletagene” 技术(Li 等人，2001，Plant Journal 27 (3)，235)以及使用人工转录因子，例如合成的锌指转录因子(例如Jouvenot等人，2003，Gene Therapy 10,513) 还可以在植物中表达另外的靶向特定多肽的抗体或其片段(Jobling等人，2003，Nat. Biotechnol. ,21(1),35).还可以使用转座子标签方法。可以通过一些技术例如相显示 (Dyax Corporation)来鉴定与本发明的多肽相互作用的其它多肽。这样的相互作用的肽可以在植物中表达或者应用到植物中以影响本发明的多肽的活性。以上每个改变本发明的核苷酸和/或多肽的表达的方法的使用被特别考虑在内。
21
选择植物的方法还提供了选择具有改变的种子产量的植物的方法。这样的方法包括测试植物中的本发明的多核苷酸或多肽的表达的改变。这样的方法可用于年幼的年龄或早期发育阶段 (当改变的种子产量不是必须可见时)以加速朝向改善的种子产量的育种程序。多核苷酸例如信使RNA的表达经常被用作相应的多肽表达的指示。示例性的测定多核苷酸表达的方法包括但不限于Northern分析、RT-PCR和点杂交分析(Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold SpringHarbor Press,1987)。因此本发明的多核苷酸或多核苷酸的部分可用作如本文定义的用于鉴定具有改变的种子产量的植物的方法的探针或引物。本发明的多肽可用作杂交实验中的探针，或基于PCR的实验中的引物，其被设计为鉴定这样的植物。或者可以产生针对本发明的多肽的抗体。产生和使用抗体的方法在本领域中是标准的(参见例如Antibodies, A Laboratory Manual，Harlow A Lane，Eds，ColdSpring Harbour Laboratory，1998)。这样的抗体可用于检测调节植物中种子产量的多肽的表达的改变的方法。这样的方法可以包括 ELISA (Kemeny，1991，A PracticalGuide to ELISA，NY Pergamon Press)禾口 Western 分析(Towbin 禾口 Gordon，1994，JImmunol Methods，72，313)。这些分析多核苷酸或多肽表达并选择具有改变的表达的植物的方法在被设计为产生具有改变的种子产量的品种的常规育种程序中是有用的。植物可以种植本发明的植物并且自交或与不同植物株进行杂交，可以鉴定所产生的具有需要的表型特征的杂交体。可以种植两代或两代以上以确保主题表型特征被稳定地保持和遗传。从这样的标准育种方法产生的植物也构成本发明的一个方面。可以通过本发明的方法改变植物中的种子产量。这样的方法可以包括以本发明的构建体(其被设计为改变调节这样的植物细胞和植物中的种子产量的多核苷酸或多肽的表达)转化植物细胞和植物。这样的方法还包括以本发明的构建体和一个或多个其它构建体(其被设计为改变调节植物中种子产量的一个或多个多核苷酸或多肽的表达)的组合转化植物细胞和植物。在Boyes DC 等人，2001，Plant Cell. 13(7) :1499-510 ；Lancashire P.D 等人， 1991，Ann. Appl. Biol. 119 :560-601和下面的实施例1中提供了示例性的检测植物中种子
产量的方法。也可以广泛地说本发明单独地或联合地存在于本申请说明书中提及的或指明的部分、元素和特征，以及任意两个或两个以上所述部分、元素和特征的任意或所有组合中， 和本发明相关的领域中具有已知同等物的本文提到的特异性完整物，这样的已知同等物被认为包含在本文中，如同单独列出一样。


将通过参考随附的附图更好地理解本发明，其中图1显示了对其中0RF56多肽作为种子序列的uniref 100数据库(版本 2. OMP-WashU
)进行 BLASTP 搜索的输出总结。图2 显示了多肽(SEQ ID NO :1 至 31)(包括 0RF56 及其变体)的 “Prettyplot，，比对，并显示了本申请人鉴定的存在于所有序列中的共有区域。图3显示了本发明的多肽(包括0RF56 SEQ ID NO :1和来自SEQ ID NO 1的所有变体的序列)的“Prettyplot”比对，并显示了本申请人鉴定的存在于所有这些序列中的共有GAD区域。图4显示了本发明的多肽(包括0RF56 SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2_31的序列变体)的另一个“Prettyplot”比对，并显示了本申请人鉴定的存在于所有这些序列中的共有CaM区域。图5显示了用于植物转化的过表达载体的示意图，其包含以正义方向克隆的 0RF56(SEQ ID NO 66)。图6显示了来自0RF56 TO转基因植物的基因组DNA(以限制性酶消化并以0RF56 编码序列的片段探测，从而确定基因拷贝数并鉴定独立转化事件)的DNA凝胶印迹分析。图7a_7d显示了观察到的转基因0RF56 Tl植物系的生长参数(与表现最好的野生型对照(日本晴(Nipponbare))比较)。其中，图7a是从实验1中测量的植物高度；图 7b是从实验1中测量的植物分蘖；图7c是从实验2中测量的植物高度；图7d是从实验1 中测量的植物分蘖。图8a-8e显示了转基因0RF56 Tl植物系的种子和谷粒的特性(与表现最好的野生型对照(日本晴)比较)。其中，图8a是不同的0RF56 Tl系中每株植物的种子产量；图 8b是不同的0RF56 Tl系中每株植物的种子总数；图8c是每个0RF56T1系中单个种子的平均质量；图8d是不同的0RF56 Tl系中种子产量的二项分布；图8e是不同的0RF56 Tl系中种子产量分布的偏移。图9显示了从产量最高的对照植物(日本晴)和0RF56 Tl植物收获的种子/谷粒。图10显示了 0RF56多肽序列(SEQ ID NO 1)和来自单子叶植物物种的公开的所有其它变体序列的比对。显示了 GAD区域内的完全保守性基序的位置。在SEQ ID NO 32 中显示了完全保守性基序的序列。图11显示了 0RF56多肽序列(SEQ ID NO 1)和来自双子叶植物物种的公开的所有其它变体序列的比对。显示了 GAD区域内的完全保守性基序的位置。这个序列基序在所有双子叶植物序列和所有单子叶植物序列中是完全保守的(见图10)，并被显示于SEQ ID NO :33ο
具体实施例方式现在将通过参考以下非限制性实施例解释本发明。实施例1.通过在植物中表达本发明的多核苷酸改变种子产量

0RF56在 ViaLactia Biosciences Ltd proprietary ryegrass (黑麦草)Gene Thresher (OrionGenomics)基因组库中鉴定了一个多核苷酸，将其称为0RF56 (SEQ ID NO: 34)。0RF56似乎编码是谷氨酸盐脱羧酶(GAD)的多肽(SEQ ID NO :1)。GAD催化谷氨酸盐向二氧化碳和Y-氨基丁酸盐(GABA)的反应。相信GAD对于胞浆pH的调节以及基础形态学发育是必不可少的。GABA的合成在正常生长条件下和对压力(例如冷、热、水或机械压力)反应时(Bouche 等人，2004 ；Mayer 等人，1990 =Patterson 和 Graham 1987 ；Wallace 等人，1984)受到高度调控。已经表明GABA在向日葵中刺激乙烯的产生，表面上看是通过引起ACC合成酶mRNA积累的增加、ACC水平的增加、ACC氧化酶mRNA水平的增加和ACC氧化酶活性的增加，这提示GABA可能在信号传导中发挥作用(Kathiresan等人，1997)。已经报道高水平的GABA破坏花粉管生长，从而破坏结实(seed set)，而低水平的GABA则被报道是刺激性的(Updegraff和I^reuss 2004)。0RF56编码的谷氨酸盐脱羧酶含有两个主要结构域GAD催化结构域和第二个钙调蛋白结合结构域(CaM)。已经显示CaM通过结合至C-末端“扩展”(在GAD的原核生物(例如大肠杆菌)或哺乳动物的形式中未发现C-末端“扩展”)而刺激GAD活性。截掉此结构域产生较短的更分叉的延迟变绿的且缺少花粉的植物 (Baum等人，1996 ；Akama和Takaiwa 2007)。GAD的翻译后修饰可能引起观察到的不同的表型。GAD在水溶液中是单体。通常来讲，肽的疏水性区域中的Trp残基与CaM的C-末端结构域(图4中加框的残基)的结合启动肽复合物的形成。然后，CaM的N-末端的叶结合至距离Trp残基10-12个残基的肽区域的疏水性和带正电的残基(Yuan和Vogel 1998)。但是，在多年生黑麦草(Perennial Ryegrass)中，SEQ ID 1 (CaM结合结构域)缺少疏水性残基Trp，而是以疏水性环境中的极性但不带电的Cys残基替换。多年生黑麦草CaM结构域中的负电荷还以这样的方式被配置=CaM的N-末端的叶与GAD的N-或C-末端的区域的相互作用将不是积极有利的，从而促进第二个或多个GAD肽与CaM的N-末端区域中的疏水性表面的结合。这实质上引起GAD-Ca2+-CaM复合物的二聚体化或多聚体化。存在使GAD进行这样的二聚体化的可能性，这似乎是由Ca2+-CaM结合所诱导(Yuan和Vogel 1998)。在植物中，存在牵牛花GAD寡聚化的证据并且在牵牛花中只有寡聚化的GAD似乎有活性的(Baum 等人，1996)。另外有报道指出从大麦中提取的活性GAD的各种同种型具有 256kDa和 120kDa的质量(Inatomi和Slaughter 1975)。也有报道指出在存在2-巯基乙醇时，大麦 GAD的活性显示出可逆的抑制。综合这些证据，可合理预计CaM结构域中的Cys残基(该位置上正常为Trp残基)在稳定二聚体化的GAD-Ca2+-CaM复合物中发挥作用。0RF56 变体使用0RF56编码的多肽序列作为种子序列以进行对imiref 100数据库 (2. OMP-WashU
)的WU_blastp搜索，从而鉴定0RF56的变体。在图1中显示了 WU-blastp输出总结。基于对公共数据库中的相关分值和注释的评价，鉴定了小于或等于5. 5e-169的界限e值以从不相关蛋白中区分0RF56的变体。使用DbCLUSTAL(Thompson J. D. ,Plewnial F. ,Thierry J. -C.和Poch 0. :2000)(其为流行的多重比对程序ClustalW 的界面)对所选的变体序列进行比对。使用另一个称为I^rettyplot的EMBOSS工具显示比对的序列，如图2所示。0RF56的变体多肽序列在序列表中列为SEQ ID NO :2_31。相应的多核苷酸序列列为 SEQ ID NO 35-65。除了四个变体多肽序列之外，所有的变体多肽序列似乎均具有正确的GAD催化结构域和正确的CaM结合结构域。四个序列(多肽SEQ ID NO :11，15，22和四；多核苷酸SEQ ID NO 61至66)似乎具有正确的有变体CaM结合结构域的GAD催化结构域。使用ft~ettypl0t比对鉴定了存在于0RF56和所有的鉴定出的0RF56变体中的保守性GAD多肽序列区域，如图3所示。还使用Prettyplot比对鉴定了存在于多肽序列SEQ ID NO :1_31中的另一个 保守性CaM多肽序列区域，如图4所示。在所有的变体序列的GAD区域中鉴定了完全保守性多肽序列基序，如SEQ IDNO 32所示。在来自单子叶植物物种的所有变体序列的GAD区域中也鉴定了完全保守性多肽序列基序，如SEQ ID N0:33所示。用于通过植物转化过表达0RF56的载体的构建通过标准分子生物学技术产生了用于过表达0RF56的载体。在图5中显示了双载体的示意图。在SEQ ID NO :66中显示了载体的序列。植物转化可以使用双质粒载体DNA通过冷冻/解冻(Chen等人1994)或电穿孔方法 (denDulk-Ras A 禾口 Hooykgrns PJ.) ^ IH ± ^ ff ^ (Agrobacterium tumefaciens) 菌株。通过电穿孔将纯化的0RF56质粒DNA导入土壤杆菌菌株EHA105，将悬浮液在26 °C孵育30分钟。将一小等份植板于含有100mg/L的卡那霉素的AB基本培养基 (Schmidt-Eisenlohr等人1999)。在26°C将板孵育3天，使用构建体特异性引物测定单个克隆中质粒的存在并确认转化。土壤杆菌培养物在26°C生长于含有100mg/L的卡那霉素的AG基本培养基中 (200rpm摇动)。在5，OOOrpm离心5分钟以沉淀土壤杆菌悬浮液，在含有1 %葡萄糖和3% 蔗糖的基础MS培养基(pH*5.2)中洗涤一次并悬浮于含有200 μ M乙酰丁香酮的相同培养基中达到OD6J). 6-0.8。使用含有双载体0RF56的根癌土壤杆菌共培养至少1，000个未成熟水稻(Oryza sativa)cv.日本晴胚胎。在无菌水中洗涤来自水稻的未成熟种子，然后以含有1. 25%活性氯的次氯化钠和10 μ LTWeen 20进行表面灭菌20分钟。灭菌后，以无菌水将这些种子洗涤几次并在无菌滤纸(3M)上吸干。使用无菌钳子人工将种子去壳，以无菌刀分离胚胎。将分离的胚胎浸没于IOmL培养管中的土壤杆菌悬浮液中，在IOOrpm持续摇动30分钟。排掉多余的液体，将胚胎在无菌滤纸上吸干，然后将其置于含有MS培养基(Murashige和Skoog， 1964)(补充了 3%蔗糖，葡萄糖，2mg/L 2，4-D，0. lmg/L BA，400 μ M 乙酰丁香酮)的共培养培养基(PH为5. 2)中在黑暗中共培养4天。共培养之后，将形成愈伤组织的胚胎每两周在选择性培养基(由补充了 3%蔗糖，葡萄糖，2mg/L 2，4-D (2，4-二氯苯氧基乙酸)， 0. lmg/L BA(苄基腺嘌呤)MS的培养基组成，并含有50mg/L潮霉素和300mg/L特美汀 (替卡西林+克拉维酸))上次培养一次，直至至少30个健康愈伤组织显示绿色斑点(指示达到健康的芽的出现)。将含有绿色斑点的愈伤组织转移至不含2，4-D的选择性培养基以再生最少10个转化植物。使再生植物生根然后移植到6英寸含有土壤的罐子中，植物在温室中生长。进行DNA凝胶印迹分析(图6)以确定基因拷贝数并鉴定5个独立转化事件。从转化的植物(TO)中收获Tl种子。Tl植物表型分型将来自Southern阳性的TO植物的30粒种子种植于单个的含有椰子壳泥炭土 (cocopeat)的杯子中，将其中的20个健康植物移植到温室。使用CRD以来自随机数字表的随机数字排列这些植物。 在两个单独的实验中进行Tl植物表型分型。第一个实验包括来自TO事件11四105 和1129106和日本晴(野生型对照)的子代系，第二个实验包括来自TO事件11四102、 11四103和11四04和日本晴(野生型对照)的子代系。TO系的表型分析
在下面表1中显示了 TO植物的生理状态
表1. TO系的生理测定
生产性分蘖/分
TO系花粉生殖力植物高度(cm)种子产量
蘖总数目
112910272. 2%9/964. 330
112910391. 5%14/1569. 630
112910479. 7%9/965. 650
112910585. 6%8/884. 2130
112910681. 5%7/775. 5160
Tl系的表型分析
移植后每周测定一次植物高度和分蘖数目，.直至达到结实。图7a、b、C和d描述
了对这些植物观察到的生长参数。基于标准统计学分析，转基因0RF56植物(Tl)的植物高度和分蘖能力没有差异。可以说转基因0RF56植物在评估的所有方面均是正常的(数据未显示)，除了种子产量；发现所分析的植物子代中的一个的种子产量高达正常种子产量的 3. 55 倍。图8a、b、C、d和e描述了每个植物的种子产量、每个植物的种子总数、每个系中的单个种子的平均质量、不同系中种子产量的二项分布和所分析的系中种子产量分布的偏移。从这些分析中可以看出种子产量的增加是种子数目增加的结果而不是单个种子重量增加的结果(图8a、b和c)。鉴于该分析是在Tl中使用分离群进行的，所以在所研究的转基因群体中的种子产量特性的二项分布中观察到偏移是不足为奇的(图8d和e)。常规育种技术(例如单粒传法)可以固定增加种子产量的特性。在图9中显示了来自野生型日本晴的最大种子产量的植物和T10RF56植物的种子产量。参考文献Adams et al.，1991，Science 252 :1651-1656.Akama, K and Takaiwa(2007) J Exp Bot. :58(10)2699-2707.Baum G, Lev-Yadun S, Fridmann Y, Arazi Τ, Katsnelson H, Zik Μ, and Fromm H (1996) EMBO J. :15(12)2988-2996.Bouche N, Fait A, Zik M，Fromm H. (2004) Plant Mol Biol. ；55 (3) :315-25.Chen H, Nelson RS, Sherwood JL. (1994)Biotechniques ； 16 (4) :664-8,670.Chen et al.，2002，Nucleic Acids Res. 31 :101-105den Dulk-Ras A, Hooykaas PJ. (1995)Methods Mol Biol. ；55 :63-72.Inatomi, K and Slaughter, JC (1975)Biochem J. 147 :479-484.
Kathiresan A, Tung P, Chinnappa CC, Reid DM(1997)Plant Physiol.115 129-135.Lee et al. ，2003，PNAS 99 :12257_12262Lee and Lee,2003 Plant Physiol. 132 :517_529Mayer RR, Cherry JH，Rhodes D (1990)Plant Physiol. 94 :796-810.Murashige T，Skoog F (1962)Physiol Plant 15 473-497Patterson BD, Graham D(1987)In(DD Davies ed) " The Biochemistry of Plants" , Vol12, Academic Press, New York,pp.153-199.Richmond and Somerville 2000, Current Opinion in Plant Biology.3 108-116Ruan et al. ,2004, Trends in Biotechnology 22:23—30.Schmidt-Eisenlohr H, Domke N, Angerer C, Wanner G, Zambryski PC, Baron C. (1999) J. Bacteriol. ；181 (24) :7485_92·Sun et al.，2004，BMC Genomics 5 :1· 1-1. 4Thompson, J. D.，Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994) CAB I OS, 10，19-29.Updegraff E, Preuss D(2004)in International Arabidopsis Conference, GermanyVelculescu et al. , 1995, Science 270 484-487Wallace W, Secor J, Schrader LE(1984)Plant Physiol. 75 :170—175.Yuan, T and Vogel, HJ(1998) J Biol. Chem. 273(46)30328-30335.以上实施例解释了本发明的实施。本领域技术人员将认识到可以不脱离本发明的精神和范围而作出各种改变和修饰。序列总结
权利要求
1.一种产生具有改变的种子产量的植物的方法，该方法包括使用下列多核苷酸转化植物a)编码具有SEQID NO :1的氨基酸序列的多肽或多肽变体的多核苷酸，其中变体能够调节植物中的种子产量；b)包含a)中的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的片段的多核苷酸，或c)包含a)中的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的互补物的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中变体与具有SEQID NO :1的氨基酸序列的多肽具有至少70%的序列同一性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中变体源自植物物种并且包含SEQIDNO :32的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中变体源自单子叶植物物种并且包含SEQ ID NO 33的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中变体包含选自SEQID NO :2_31任一项的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中变体是谷氨酸盐脱羧酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中a)中的多核苷酸编码具有SEQID NO 1的氨基酸序列的多肽。
8.—种产生具有改变的种子产量的植物的方法，该方法包括使用下列多核苷酸转化植物细胞或植物a)包含SEQID NO :34的核苷酸序列的多核苷酸或其变体，其中变体编码能够调节植物中的种子产量的多肽；b)包含a)中的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的片段的多核苷酸，或c)包含a)中的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的互补物的多核苷酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其中变体与SEQID NO 34具有至少70%的序列同一性。
10.根据权利要求8所述的方法，其中变体与SEQID NO :34的编码序列具有至少70% 的序列同一性。
11.根据权利要求8所述的方法，其中变体包含SEQID NO :35-65任一项的序列。
12.根据权利要求8所述的方法，其中变体包含SEQID N0:35-65任一项的编码序列。
13.根据权利要求8至12任一项所述的方法，其中多肽为谷氨酸盐脱羧酶。
14.根据权利要求8所述的方法，其中a)中的多核苷酸包含SEQID N0:34的序列。
15.根据权利要求8所述的方法，其中a)中的多核苷酸包含SEQID NO :34的编码序列。
16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其中相对于合适的对照植物，所产生的植物具有增加的种子产量。
17.根据权利要求1至16任一项所述的方法产生的植物细胞或植物。
18.一种分离的多核苷酸，其编码与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少75%的序列同一性的多肽，其中多核苷酸编码能够调节植物中种子产量的多肽。
19.根据权利要求18所述的分离的多核苷酸，其中多肽是谷氨酸盐脱羧酶。
20.根据权利要求18所述的分离的多核苷酸，其包含SEQID NO:34的序列。
21.根据权利要求18所述的分离的多核苷酸，其包含SEQID NO:34的编码序列。
22.—种分离的多肽，其与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少83%的序列同一性，其中多肽能够调节植物中的种子产量。
23.根据权利要求22所述的分离的多肽，其中多肽是谷氨酸盐脱羧酶。
24.根据权利要求22所述的分离的多肽，其包含SEQID NO :1的氨基酸序列。
25.一种包含权利要求18至21任一项的多核苷酸的遗传构建体。
26.一种遗传构建体，其包括由至少一个下列组成的多核苷酸a)权利要求18-21任一项的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的片段；b)权利要求18-21任一项的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的互补物；或c)长度为至少15个核苷酸的能够与权利要求18-21任一项的多核苷酸杂交的序列。
27.根据权利要求26所述的遗传构建体，其包含与多核苷酸可操作地连接的启动子序列。
28.根据权利要求26或27所述的遗传构建体，其包含与多核苷酸可操作地连接的终止子序列。
29.一种经遗传修饰以表达权利要求18至21任一项的多核苷酸或权利要求22至24 任一项的多肽的宿主细胞。
30.一种包含权利要求25至28任一项的遗传构建体的宿主细胞。
31.一种经遗传修饰以表达权利要求18至21任一项的多核苷酸或权利要求22至24 任一项的多肽的植物细胞。
32.一种包含权利要求25至28任一项的遗传构建体的植物细胞。
33.一种包含权利要求31或32的植物细胞的植物。
34.一种选择相对于合适的对照植物具有改变的种子产量的植物的方法，该方法包括测试植物中的权利要求18至21任一项的多核苷酸的改变的表达。
35.一种选择相对于合适的对照植物具有改变的种子产量的植物的方法，该方法包括测试植物中的权利要求22至24任一项的多肽的改变的表达。
36.一组根据权利要求34或35的方法选择的植物。
37.一种针对权利要求22至24任一项的多肽产生的抗体。
全文摘要
本发明提供了产生具有改变的种子产量的植物的方法，所述方法包括以遗传构建体转化植物，所述遗传构建体包括编码具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽或其变体或片段的多核苷酸。本方法还提供了用于产生具有改变的种子产量的植物的分离的多肽、多核苷酸、构建体和载体。本方法还提供了经转化的含有并表达多肽、多核苷酸和构建体的植物细胞和植物。本发明还提供了根据本发明的方法产生的植物。
文档编号C12N15/29GK102159714SQ200880117208
公开日2011年8月17日 申请日期2008年10月24日 优先权日2007年10月26日
发明者C·J·史密斯-埃斯皮诺萨, C·J·布赖恩特, J·R·菲利普斯, K·M·埃尔伯勒, M·比斯瓦, S·普蒂格 申请人:维亚拉克什亚生物科学有限公司