专利名称：使用米多肽/核酸进行植物改良的制作方法
使用米多肽/核酸进行植物改良技术领域
本发明主要是以制备转基因植物的方法，将重组DNA构建体转化进入宿主植物， 并在此宿主植物中表达此一特定水稻多肽，进而产生一转基因植物的方法。
背景技术：
筛选影响植物重要性状的多肽一直是各界关注的课题，例如，提高产量或提高植 物对环境压力的抗压性等特性的多肽。同时，将这些多肽编码基因转入宿主植物中，也可使 宿主植物具有这些多肽所表现的特性。发明内容
本发明基于筛选出数种水稻多肽及其编码核苷酸，这些多肽使稻米表现出各种不 同的重要性质，例如种子重量/尺寸及稻穗型态、大小或密度。
因此，本发明涉及制备转基因植物的方法，将一重组DNA构建体转化进入宿主植 物，在植物细胞中表达一特定多肽，其氨基酸序列与表一中选取的序列编号1-49、99-114 及149氨基酸序列的相似度至少达80%以上(例如，85%、90%、95%、98%、99%或 100% ) ο上述重组DNA构建体可包含表一中选取的序列编号50-98、115-148、150及151 的核苷酸序列，以及在植物细胞中具有功能的启动子序列，且此启动子序列是以可人为操 作的方式与上述核苷酸序列相连接。
制备完成的转基因植物可表现出一或多个与宿主植物相关的特性(a)对环境压 力的耐受性提高，如干旱、寒冷、高温、高盐、贫瘠环境、植物病变、除草剂、极度渗透压不平 衡、病原或虫害；(b)促进植物细胞生长；(c)改善或降低半乳甘露聚糖、木质素、纤维素、类 黄酮素或植物生长调节素等的产量；(d)经由调节光合作用、碳水化合物的使用和/或摄 取、氮素的使用和/或摄取、磷的使用和/或摄取、矿物质的使用和/或摄取以促使产量增 加；(e)种子油、淀粉和/或蛋白质的产量提高；及(f)同源重组速度增加；(g)增加种子的 大小或重量；(h)增加穗长或种子密度；(i)开花、授粉或受粉效率的提升；及(j)提高种子 生长发育及成熟速度。
转基因植物是一种透过转化或重组等方法，加入外来基因或增加原生基因的数量 而改变其基因组的植物。
另一方面，本发明也提供一种抑制任一项前述多肽在植物细胞中表达的方法，将 包含多核苷酸及启动子序列的DNA构建体引进植物细胞或植物中。此多核苷酸的核苷酸序 列与目标多肽的多核苷酸序列互补。因此，DNA构建体在植物细胞或植物中所表达的RNA分 子，可以一反义RNA或一干扰RNA的模式抑制前述多肽的表达。
本发明也包含上述任一重组DNA构建体以及含有此DNA构建体的植物细胞或转基 因植物。接下来将详细说本发明的实施例。同时，也将透过下列的实施例及权利要求更深 入地阐明本发明其它特质与优势，使其更为明显易懂。
实施方式
本发明筛选出66个分离的水稻多肽(序列编号1-49、99-114及149)及其具有 相等功能的变型，变型指的是其氨基酸序列与序列编号1-49、99-114及49其中之一氨基 酸序列具有至少65%的相似度(如，70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)，且与 前述水稻多肽具有相同功能的多肽。
在此，“分离的多肽”指一本质上在自然情况下不具有与其相关连的多肽的分子， 意即，一含多肽的混合物，具有低于20%干燥重量比的连接分子。纯度可经由任何适当方法 测得，如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳及高效液相层析(HPLC)。
两段氨基酸序列的序列相似度可由Karlin and Altschul发表于I^roc，Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264_52268，1990 的运算法以及 Karlin and Altschul 发表于 Proc， Natl. Acad. Sci. USA 5873-5877，1993中改良的计算法计算而得。此计算法被并入 Altschul 等人发表于 J. Mol. Bio. 215 :403-410,1990 所述的 NBLAST 及 XBLAST 软件中运算。 BLAST核苷酸搜索与NBLAST软件一起进行，(得分=100，字长=12)，以取得与本发明核酸 分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索与XBLAST软件(得分=50，字长=3)进行，以 取得与参考多肽同源的氨基酸序列。根据Altschul等人发表于Nucleic Acids Res. 25 3389-3402，1997中所述，利用Gapped BLAST取得空位比对序列以做为比较。使用BLAST与 Gapped BLAST软件时，也需使用个别软件(如XBLAST及NBLAST)的预设参数。参见w驟· ncbi. nlm. nih. rov。
表1及表2中列出前述66个水稻多肽的GenBank登录号、氨基酸序列及其编码的 核苷酸序列，表1也列出这些多肽的功能。
表1.与种子产量或圆锥花序形成相关的米多肽
辣IIh脚表型TRIM 系基因位置GOI蛋白质CDNAGenBank 登录号1髙种子产 量MOOl 5163LOC 0s03 g57290cullin序列编 号:I序歹IJ编 号:50AAT752452髙种子产 量；抗旱性M0019261LOC OS 0 lg61420ring finger 蛋白5序列编 号:2序列编 号:51BAD736323髙种子产 量；抗旱性LOC OsOl g61430unk zinc finger HIT序列编 号:3序列编 号:52NP 194611 .24种子产量M0025978LOC OsOl g52790细胞色素 P450序列编 号:4序列编 号:53NP—9167545LOC OsOlg 52800细胞色素 P450序列编 号:5序列编 号:54BAD869306LOC OsOl g528l0PP2C序列编 号:6序列编 号:55NPJ67145 (ara)7LOC OsOl g52830unk序列编 号:7序歹!！编 号:56NP_916757 (ara)8穗型较长M0038751LOC 0s03 g64150MatE efflux 家族序列编 号:8序列编 号:57XP—4704979穗型较长， 大型种子M0046723LOC 0s04 g58180WD domain Gbeta序列编 号:9序列编 号:58XP一 47435810LOC 0s04 g58190dof28序列编 号:10序列编 号:59XP_47435911大型种子M0022658LOC 0s02 g28970序列编 号:11序歹Ij编 号:60NP 001046 872.112大型种子 抗旱性M0024255LOC 0s07 gioilo序列编 号:12序歹U编 号:61NP 001044 695.113大型种子M0034189LOC 0s04 g39430 ？ p450, dwarf4序列编 号:13序列编 号:62NP 001053 047.114大型种子M0034642-1LOC OslO g42820DUF221/ER D序列编 号:14序歹Il编 号:63NP 001065 504.115大型种子M0039539LOC 0s04 g55690unk序列编 号:15序列编 号:64NP 001054 091.116大型种子M0040296LOC 0s07 gl4890unk序列编 号:16序歹J编 号:65NP 001059 304:117LOC 0s07 gl49l0unk序列编 号:17序列编 号:66NP 001059 305.1
618穗上种子 密集M0033394LOC 0s02 g56250推定的 QATA序列编 号:18序列编 号:67CT828966, not predicted, NP 001048 448:119穗上种子 密集M0038155LOC 0s02 g32504unk序列编 号:19序列编 号:68NP 001046 996:120穗上种子 密集M0039100LOC 0s06 g508l8unk序列编 号:20序列编 号:69NP 001058 607.121LOC 0s06 g50830推定的TF bzip序列编 号:21序列编 号:70NP 001058 608:122穗上种子 密集M0039314LOC 0s08 g41950MADS, MADS7, MADS45序列编 号:22序列编 号:71NP 001062 335:123LOC 0s08 g41960mads 无法 预测AGL72序列编 号:23序列编 号:72NP 001062 336:124穗上种子 密集M0039419LOC 0s02 g47430unk not predicted, 肽酶M20序列编 号:24序列编 号:73NP 001058 304:125LOC 0s02 g47440推定的 syntaxin序列编 号:25序列编 号:74NP 001047 853.126穗上种子 密集M0039485LOC Osl2 gl5222unk序列编 号:26序歹!J编 号:75NP 001066 50 Ll27穗上种子 密集M0043153LOC 0s06 g46240ARM重复 序列序列编 号:27序列编 号7628LOC 0s06 g46250unk, proteophosp hoglycan 前 驱物序列编 号:28序歹 编 号:77NP 001058 344:129德上种子 密集M0050559LOC Osl2 g43720put RXW8, DUF221, ERD序列编 号29序列编 号:78NP 001067 352:130LOC Osl2 g43730无法预测， 类细胞周期 素 Fbox序列编 号:30序列编 号:79NP 001052 038.131LOC Osl2 g43740短链脱氢酶序列编 号:31序列编 号:80BAF30371. 132大型谷粒M0027918LOC OslO g01700unk 表达， HSR201序列编 号:32序列编 号:8133大型谷粒 抗旱性M0028590-1LOC 0s03 g554302蛋白于2 框架？序列编 号:33序列编 号:82342蛋白于2 框架序列编 号:34序歹IJ编 号:83NP 001051 361.135LOC 0s03 g55450unk序列编 号:35序列编 号:84NP 001051 362.136大型谷粒M0063563LOC 0s08 g32930unk序列编 号:36序列编 号:85NP 001061 837.137大型谷粒M0063736LOC 0s08 g31130unk integral mb prot DUF6 家 族，类 MtN21 ara序列编 号:37序列编 号:86NP 001061 761:138LOC 0s08 g31120unk部分序列编 号:38序歹IJ编 号:87NP 001066 824.权利要求
1.一种制备转基因植物的方法，包含将一重组DNA构建体转化进入一宿主植物；该重 组DNA构建体包含一多核苷酸以及与该多核苷酸连接的一具有功能的启动子序列，该多核 苷酸可编码一多肽的氨基酸序列，与选自由序列编号1-49、99-114及149所组成群组的氨 基酸序列具有至少80%的相似度，该激活子序列在该宿主植物的细胞中具有功能，其中，该 转基因植物可表现一或多个下列与该宿主植物相关的性质(a)增强耐旱、耐冷、耐热、耐盐、耐贫瘠环境、抗植物病变、抗除草剂、抗极度渗透情况、 抗病原体或抗虫害的能力；(b)促进植物细胞生长；(c)调节半乳甘露聚糖、木质素、纤维素、类黄酮素、或植物生长调节素的产量；(d)经由调节光合作用、碳水化合物的使用和/或摄取、氮气的使用和/或摄取、磷的使 用和/或摄取、矿物质的使用和/或摄取，使其产量增加；(e)种子油、淀粉和/或蛋白质的产量增加；及(f)同源重组速度增加；(g)种子大小或重量增加；(h)穗长或种子密度增加；(i)开花、授粉或稔实率提升；及(j)种子生长及成熟速度增加。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该多核苷酸编码一多肽，该多肽的氨基酸序列与 选自由序列编号1-49、99-114及149所组成群组的氨基酸序列具有至少90%的相似度。
3.根据权利要求2所述的方法，其中该多核苷酸编码一多肽，该多肽的氨基酸序列选 自由序列编号1-49、99-114及149所组成的群组。
4.根据权利要求3所述的方法，其中该多核苷酸具有选自由序列编号50-98、 115-148、150及151所组成群组的一核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中该宿主植物为一农作物。
6.一种制备转基因细胞的方法，包含将一重组DNA构建体转化进一入宿主植物细胞， 该重组DNA构建体包含一多核苷酸及与该多核苷酸连接的具有功能的启动子序列，该多核 苷酸编码一多肽，该多肽的氨基酸序列与选自由序列编号1-49、99-114及149所组成群 组的一氨基酸序列具有至少80%的相似度，该激活子序列在该宿主植物的一细胞中具功能 性。
7.根据权利要求6所述的方法，其中该多核苷酸编码一多肽，该多肽的氨基酸序列与 选自由序列编号1-49、99-114及149所组成群组的氨基酸序列具有至少95%的相似度。
8.根据权利要求7所述的方法，其中该多核苷酸编码一多肽，该多肽的氨基酸序列选 自由序列编号1-49、99-114及149的氨基酸序列所组成的群组。
9.根据权利要求8所述的方法，其中该多核苷酸具有选自由序列编号50-98、 115-148、150及151所组成群组的一核苷酸序列。
10.根据权利要求6所述的方法，其中该宿主植物为一农作物。
11.一种转基因植物，其包含一重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含一核苷酸序列， 该核苷酸序列编码一多肽，该多肽的氨基酸序列与选自由序列编号1-49、99-114及149所 组成群组的氨基酸序列具有至少80%的相似度，其中该DNA构建体在该转基因植物中表达该多肽。分
12.根据权利要求11所述的转基因植物，其中该多肽的氨基酸序列与选自由序列编 号1-49、99-114及149所组成群组的氨基酸序列具有至少90%的相似度。
13.根据权利要求12所述的转基因植物，其中该多肽的氨基酸序列选自由序列编号 1-49、99-114及149所组成的群组。
14.根据权利要求13所述的转基因植物，其中该核苷酸序列选自由序列编号50-98、 115-148、150及151所组成的群组。
15.根据权利要求11所述的转基因植物，其中该转基因植物为一转基因农作物。
16.一种转基因植物细胞，包含一重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含一核苷酸 序列，该核苷酸序列编码一多肽，该多肽的氨基酸序列与选自由序列编号1-49、99-114及 149所组成群组的氨基酸序列具有至少80%的相似度，其中该DNA构建体在该转基因植物 中表达该多肽。
17.—种重组DNA构建体，包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码一多肽，该多肽的氨 基酸序列与选自由序列编号1-49、99-114及149所组成群组的氨基酸序列具有至少80% 的相似度，其中该DNA构建体在一宿主植物细胞中表达该多肽。
全文摘要
一种利用植物转基因的方法，将重组DNA构建体转化进入宿主植物，以产生转基因植物，并进而于转基因植物中表达此一特定水稻多肽。
文档编号C07K14/415GK102037125SQ200980118252
公开日2011年4月27日 申请日期2009年5月1日 优先权日2008年5月1日
发明者余淑美, 禹依·C·刑, 端华·大卫·贺, 罗舜芳, 辜瑞雪 申请人:中央研究院