改良植物特征的方法

专利名称：改良植物特征的方法
技术领域：
本发明涉及编码多肽，诸如在油菜素类固醇生物合成路径中起作用的多肽的多聚 核苷酸，包括所述多聚核苷酸的转基因植物，和应用所述多聚核苷酸改良植物表型特征的 方法。更具体地，本发明涉及表现出增强水平的一种或多种下列代谢物的转基因植物蔗 糖，谷氨酸盐/酯(谷氨酸)，或亚油酸。另外，本发明涉及表现出增强水平的6-脱氧油菜 素甾酮(6-deoxocathasterone)和/或降低水平的菜油甾醇(campestanol)的转基因植 物。所述转基因植物还可能表现出增强的生长潜力，增加的大小(例如，高度)，增加的种子 产量，更加均一的种子充实度(例如，在单子叶植物中)，每株植物增加的种子重量，每株植 物增加的种子，更快的生长速度，更有效率的光合作用，或改良的耐干旱性。
背景技术：
由于全世界人口增殖导致的对农业和林业产业的增长的需求已经导致努力增加 植物产量和/或大小。尽管用于增加植物大小的一种方式是通过植物育种计划，这样的育 种计划典型地是耗费时间和劳动力密集型的。另一方面，通过引入赋予需要特征的外来核 酸而对植物的特性进行遗传控制，可以是更少耗费时间的，并且可能应用于各种植物种类。植物产生大量的类固醇和固醇，叫作油菜素类固醇(BRs)，它们中的一些作用为 生长激素。存在多于40种已知的BRs，典型地在一个或多个C-2，C-6，C-22，和C-23位置 具有特征性氧部分。油菜素内酯(BL)是促生长BRs的最有生物活性的形式。拟南芥CPD 和DWF4是催化BL生物合成路径的酶促步骤的细胞色素P45tl蛋白；它们在氨基酸水平有 43%的同源性。在BL生物合成过程中，DWF4催化菜油留醇在C-22氧化以形成6-脱氧油 菜素留酮，而CPD催化下游的临近步骤6-脱氧油菜素留酮在C-23的羟基化作用以产生 6-deoxyteasterone。发明概述本申请提供分离的多聚核苷酸，由其编码的多肽，和包括其的转基因植物。转基 因植物可以展示相对于对照植物的需要的表型特征，诸如下列各项的一种或多种增加的 高度，增强的光合作用率，增加水平的一种或多种代谢物，诸如蔗糖、谷氨酸盐/酯、或亚油 酸，和增加水平的6-脱氧油菜素留酮，降低水平的菜油留醇，增强的活性(例如，酶促活 性)，提高的水利用率，每株植物增加的种子重量，每株植物增加的种子，和增强的耐干旱 性。本申请还提供与已知为DWF4的拟南芥&5(|蛋白功能性相当的多肽(同系物和直 向同源物)和与这样的同系物和直向同源物一致的多肽序列。DWF4在油菜素类固醇的合成 中起着重要的作用，其作用为植物生长促进激素。因此，除了其它事物，本发明还提供编码P450多肽的分离的多聚核苷酸。在一些情形中，P45tl多肽可以在油菜素类固醇生物合成路径 中起作用。例如，一些P45tl多肽可以行使DWF4的酶促活性，例如，菜油甾醇在C-22的氧化 以形成6-脱氧油菜素甾酮。本公开内容还提供包括本文所描述的多聚核苷酸的转基因植物，和用于制备所述 转基因植物的方法。所述多肽在植物中的表达可以引起一种或多种表现效果，诸如增加的 植物大小(例如，高度，生物量)和/或更快的生长速度；增加的种子产量；增加的种子充 实度(例如，对于单子叶植物，诸如稻科，小麦属，和玉蜀黍属)；增加水平的代谢物，诸如蔗 糖，谷氨酸盐，或亚油酸；降低水平的菜油留醇；增加水平的6-脱氧油菜素留酮；增强的光 合作用率；提高的水利用率；或改善的耐干旱性。在其它情形，多肽的表达可以提供植物中 通常不存在的(例如，完全不存在或仅在某些组织中不存在)生化或酶促活性，或者可以提 供增强水平的这样的生化活性。在某些情形中，所述多肽的表达可以互补植物中已经存在 的生化或酶促功能，或者可以导致改变的酶促活性(例如，增加的活性，降低的活性，或不 同的活性)。抑制P45tl多肽在植物中的表达，例如，通过反义，RNAi，或基于核酶的方法，可以 导致植物改善的耐荫性(例如，如在阴暗条件下受抑制的延长所指示的那样)。因此，在一方面，提供分离的多聚核苷酸。分离的多聚核苷酸可以包括编码具有与 SEQ ID NO :2列出的氨基酸序列约85%或更多序列同源性的多肽的核酸分子；例如，包括 SEQ ID NO :2列出的氨基酸序列，或由SEQ ID NO :2列出的氨基酸序列组成。分离的多聚 核苷酸可以包括编码包括与在图2中列出的共有序列(SEQ ID NO :4)相对应的氨基酸序列 的多肽，例如，对应所述共有序列的多肽的核酸分子。多肽可以有效地催化菜油留醇在C-22 的氧化以形成6-脱氧油菜素甾酮。多聚核苷酸还可以包括有效地与编码所述多肽的核酸，诸如广泛表达的启动子或 组成型启动子连接的控制元件。在一些情形中，广泛表达的启动子选自由P326，YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144 和 YP0190 组成的组。在一些情形中，组 成型启动子是35S。在一些情形中，所编码的多肽没有展现出与SEQ ID NO :1或SEQ IDNO :3列出的氨 基酸序列有93%或更多的序列同源性。在其它情形中，分离的多聚核苷酸可以包括编码包 括与图2中列出的共有序列(SEQ IDNO 4)相对应的氨基酸序列的多肽的核酸，其中所述多 聚核苷酸还包括有效地与编码所述多肽的核酸连接的广泛表达启动子控制元件。本申请还提供包括上述多聚核苷酸的重组载体。重组载体可以包括有效地连接到 所述多聚核苷酸上的控制元件，其中所述多聚核苷酸包括编码具有与SEQ ID N0:2列出的 氨基酸序列约85%或更多的序列同源性的多肽的核酸分子，或者包括编码包括与图2列出 的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的氨基酸序列的多肽的核酸分子。另一方面，还提供了转基因植物。转基因植物可以包括至少一种外源多聚核苷酸， 所述至少一种外源多聚核苷酸包括编码这样的多肽的核酸，即，(a)与SEQ ID N0:2列出 的氨基酸序列有约85%或更多序列同源性；或者(b)包括与图2列出的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的氨基酸序列，条件是所编码的多肽没有展现出同SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3列出的氨基酸序列有93%或更多的序列同源性。所述多肽可以有效地催化菜油甾醇 在C-22氧化，以形成6-脱氧油菜素留酮。在一些情形中，外源多聚核苷酸还包括有效地连 接到编码所述多肽的核酸上的控制元件。所述控制元件可以是广泛表达的启动子或组成型启动子。广泛表达的启动子可以选自由下列各项组成的组p326，YPO158，YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144和YP0190。启动子可以有效地引起所述多肽在枝条和 茎尖中的表达。转基因植物可以展现出相对于对照植物改变的表型。所述改变的表型可以 是选自由下列各项组成的组的一种或多种相对于对照植物，改变的新陈代谢模式，6-脱 氧油菜素留酮水平的增加，菜油留醇水平的减少，增加的光合作用率，增加的种子产量，每 株植物增加的种子重量，和增加的高度。改变的新陈代谢模式可以是相对于对照植物增加 水平的蔗糖、谷氨酸或亚油酸。转基因植物可以是单子叶植物，诸如稻科，小麦属，柳枝稷， 黑麦属，大麦属，高梁属，或玉蜀黍属。转基因植物可以是双子叶植物。另一方面，转基因植物不是拟南芥(Arabidopsis thaiiana)或烟草(Nicotiana tabacum)植物。这样的转基因植物可以包括至少一种外源多聚核苷酸，所述至少一种外源 多聚核苷酸包括编码这样的多肽的核酸，即，(a)与SEQ ID NO :2列出的氨基酸序列有约 85%或更多序列同源性；或者(b)包括与图2列出的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的氨 基酸序列。所述外源多聚核苷酸还可以包括有效地连接稻编码所述多肽的核酸上的控制元 件。所述控制元件可以是广泛表达的启动子或组成型启动子。所述广泛表达的启动子可以 选自由下列各项组成的组p326，YPO158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144 和YP0190。p3^5启动子可以有效地引起所述多肽在枝条和茎尖中的表达。转基因植物可以 展现出相对于对照植物改变的表型。改变的表型可以是选自由下列各项组成的组的一种或 多种相对于对照植物，改变的新陈代谢模式，6-脱氧油菜素留酮水平的增加，菜油留醇水 平的减少，增加的光合作用率，增加的种子产量，每株植物增加的种子重量，和增加的高度。 改变的新陈代谢模式可以是相对于对照植物增加水平的蔗糖、谷氨酸或亚油酸。转基因植 物可以是单子叶植物，诸如稻科，小麦属，柳枝稷，黑麦属，大麦属，高梁属，或玉蜀黍属。转 基因植物可以是双子叶植物。多肽可以有效地催化菜油留醇在C-22的氧化，以形成6-脱 氧油菜素甾酮。在另一实施方案中，提供包括至少一种外源多聚核苷酸的转基因植物，所述至少 一种外源多聚核苷酸包括编码这样的多肽的核酸，即，(a)与SEQ ID NO :2列出的氨基酸序 列有约85%或更多序列同源性；或者(b)包括与图2列出的共有序列(SEQ ID NO 4)相 对应的氨基酸序列，其中所述转基因植物相对于对照植物展现出6-脱氧油菜素留酮水平 的增加。所述外源多聚核苷酸还可以包括有效地连接到编码所述多肽的核酸上的控制元 件。控制元件可以是广泛表达的启动子或组成型启动子。所述广泛表达的启动子可以选自 由下列各项组成的组p326，YPO158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144 和 YP0190o 启动子可以有效地引起所述多肽在枝条和茎尖中的表达。转基因植物可以展 现出相对于对照植物改变的表型，其选自由下列各项组成的组的一种或多种相对于对照 植物，改变的新陈代谢模式，菜油留醇水平的减少，增加的光合作用率，增加的种子产量，每 株植物增加的种子重量，和增加的高度。转基因植物可以是单子叶植物，诸如稻科，小麦属， 柳枝稷，黑麦属，大麦属，高梁属，或玉蜀黍属，或双子叶植物，如上述。多肽可以有效地催化 菜油留醇在C-22氧化，以形成6-脱氧油菜素甾酮。另一方面，本申请提供包括至少一种外源多聚核苷酸的转基因植物，所述至少一 种外源多聚核苷酸包括编码这样的多肽的核酸，即，(a)与SEQID NO :2列出的氨基酸序列 有约85%或更多序列同源性；或者(b)对应图2列出的共有序列(SEQ ID N0:4)，其中所述转基因植物相对于对照植物展现出6-脱氧油菜素留酮水平的增加。所述外源多聚核苷 酸还可以包括有效地连接到编码所述多肽的核酸上的控制元件。控制元件可以是广泛表达 的启动子或组成型启动子。所述广泛表达的启动子可以选自由下列各项组成的组P326， YP0158，YP0214，YP0380，PT0848，PT0633，YP0050，YP0144 禾口 YPO190 ρ326 启动子可以有效 地引起所述多肽在枝条和茎尖中的表达。转基因植物还可以展现出相对于对照植物改变的 表型，其选自由下列各项组成的组的一种或多种相对于对照植物，改变的新陈代谢模式， 6-脱氧油菜素留酮水平的增加，增加的光合作用率，增加的种子产量，每株植物增加的种子 重量，和增加的高度。转基因植物可以是单子叶植物，诸如稻科，小麦属，柳枝稷，黑麦属，大 麦属，高梁属，或玉蜀黍属，或双子叶植物。多肽可以有效地催化菜油留醇在C-22氧化，以 形成6-脱氧油菜素甾酮。在另一实施方案中，提供包括至少一种外源多聚核苷酸的转基因植物。所述至少 一种外源多聚核苷酸可以包括编码这样的多肽的核酸，即，(a)与SEQ ID NO :2列出的氨基 酸序列有约85%或更多序列同源性；或者(b)对应图2列出的共有序列(SEQ ID N0:4)，其 中所述外源多聚核苷酸还可以包括有效地连接到编码所述多肽的核酸上的广泛表达的控 制元件。广泛表达的启动子可以选自由下列各项组成的组p326，YPO158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144和YPO190。转基因植物可以展现出相对于对照植物改变 的表型，其选自由下列各项组成的组的一种或多种相对于对照植物，改变的新陈代谢模 式，菜油留醇水平的减少，6-脱氧油菜素留酮水平的增加，增加的光合作用率，增加的种子 产量，每株植物增加的种子重量，和增加的高度。改变的新陈代谢模式可以是相对于对照植 物增加水平的蔗糖、谷氨酸、或亚油酸。转基因植物可以是单子叶植物，诸如稻科，小麦属， 柳枝稷，黑麦属，大麦属，高梁属，或玉蜀黍属。转基因植物可以是双子叶植物。多肽可以有 效地催化菜油留醇在C-22氧化，以形成6-脱氧油菜素甾酮。在另一方面，提供包括至少一种外源多聚核苷酸的转基因植物。所述至少一种外 源多聚核苷酸可以包括编码这样的多肽的核酸，即，(a)与SEQID NO :2列出的氨基酸序列 有约85%或更多序列同源性；或者(b)对应图2列出的共有序列(SEQ ID N0:4)，其中所 述转基因植物相对于对照植物展现出增加的光合作用率。所述外源多聚核苷酸还可以包括 有效地连接到编码所述多肽的核酸上的控制元件。控制元件可以是广泛表达的启动子或 组成型启动子。广泛表达的启动子可以选自由下列各项组成的组p326，YPO158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144 和 YP0190。广泛表达的启动子可以是 p326，其可 以有效地引起所述多肽在枝条和茎尖中的表达。转基因植物还可以展现出相对于对照植物 改变的表型，其选自由下列各项组成的组的一种或多种相对于对照植物，改变的新陈代谢 模式，菜油留醇水平的减少，6-脱氧油菜素留酮水平的增加，增加的种子产量，每株植物增 加的种子重量，和增加的高度。改变的新陈代谢分布可以是相对于对照植物增加水平的蔗 糖、谷氨酸、或亚油酸。转基因植物可以是单子叶植物，诸如稻科，小麦属，柳枝稷，黑麦属， 大麦属，高梁属，或玉蜀黍属，或可以是双子叶植物。多肽可以有效地催化菜油留醇在C-22 氧化，以形成6-脱氧油菜素甾酮。还提供了用于生产转基因植物的方法。用于生产转基因植物的方法可以包括(a) 将本文所描述的任何多聚核苷酸引入植物细胞，以产生转化的植物细胞；和(b)从所述转 化的植物细胞产生转基因植物。还提供了本文所描述的任何转基因植物的种子。
另一方面，提供了分离的多肽。分离的多肽可以(a)具有与SEQ ID NO :2列出的氨 基酸序列约85%或更多的序列同源性；或者(b)包括与图2列出的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的氨基酸序列，条件是所编码的多肽没有展现出与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3 列出的氨基酸序列93%或更多的序列同源性。本公开内容还提供改变植物的一种或多种表型特征的方法。例如，提供用于增加 植物中选自由蔗糖、谷氨酸盐/酯和亚油酸组成的组的一种或多种代谢物的水平的方法。 所述方法包括(a)将先前所述的任何多聚核苷酸引入植物细胞，以产生转化的植物细胞；和(b) 从所述转化的植物细胞生产转基因植物，其中所述转基因植物表现出一种或多种代谢物的 增加水平。在另一实施方案中，一种用于增加植物中选自由蔗糖、谷氨酸盐/酯和亚油酸组 成的组的一种或多种代谢物的水平的方法包括(a)为了产生转化的植物细胞，向植物细 胞中引入包括编码下列各项的核酸分子的分离的多聚核苷酸1)具有与SEQ ID N0:2列出 的氨基酸序列约85%或更多的序列同源性的多肽，或幻包括与图2列出的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的氨基酸序列的多肽；和(b)从所述转化的植物细胞产生转基因植物，其 中所述转基因植物表现出一种或多种代谢物的增加水平。还描述了用于增加植物中6-脱氧油菜素留酮水平的方法。所述方法包括a)为了 产生转化的植物细胞，向植物细胞引入本文所描述的分离的多聚核苷酸，例如，其包括编码 下列各项的核酸分子1)具有与SEQ ID NO :2列出的氨基酸序列约85%或更多的序列同源 性的多肽，或幻包括与图2列出的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的氨基酸序列的多肽； 和(b)从所述转化的植物细胞产生转基因植物，其中所述转基因植物表现出增加水 平的6-脱氧油菜素甾酮。在另一方面，提供了用于减少植物中菜油留醇水平的方法。所述方法包括a)为 了产生转化的植物细胞，向植物细胞引入本文所描述的分离的多聚核苷酸，例如，其包括编 码下列各项的核酸分子1)具有与SEQ IDNO 2列出的氨基酸序列约85%或更多的序列同 源性的多肽，或2)包括与图2列出的共有序列(SEQ ID NO :4)相对应的氨基酸序列的多 肽；和(b)从所述转化的植物细胞产生转基因植物，其中所述转基因植物表现出减少水 平的菜油甾醇。在另一方面，提供了用于增强植物的光合作用率的方法，其包括(a)为了产生转 化的植物细胞，向植物细胞引入本文所描述的分离的多聚核苷酸，例如，其包括编码下列各 项的核酸分子1)具有与SEQ ID NO :2列出的氨基酸序列约85%或更多的序列同源性的多 肽，或2)包括与图2列出的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的氨基酸序列的多肽；和(b)从所述转化的植物细胞产生转基因植物，其中所述转基因植物表现出增强的 光合作用率。除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域内的普 通技术人员通常所理解的相同的意思。尽管与本文所描述的那些相似或等价的方法和材料 可以用于实践或检验本发明，但是在下文中描述适当的方法和材料。另外，所述材料、方法和实例仅是示例性的，并不是意欲限制。本文所提及的所有的出版物、专利申请、专利、和其 它参考文献通过参考全部并入本文。在冲突的情形中，本详述，包括定义，将会控制。本发明的一个或多个实施方案的详情在下文的附图和详述中列出。本发明的其它 特征、目的、和优点将从描述和附图，以及从权利要求中显而易见。附图简述

图1列出拟南芥(Arabidopsis)DWF4的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)和与拟南芥 DWF4功能相当的两种多肽的氨基酸序列来自玉米的SEQID NO 2和来自水稻的SEQ ID NO :3。关于SEQ ID NO 2, Ceres clone ID是所述序列的内部名称。关于SEQ ID NO: 3，" gi"对应在公共数据库NCBI中的名称，接着是BAC克隆标识和蛋白序列的简短描述。图2是与拟南芥DWF4功能相当的多肽的公共序列(SEQ ID NO :4)。所述公共序 列包括具有DWF4活性的P45tl多肽，例如，具有22 α -羟化酶活性。所述公共序列表明在每 个位置出现哪个氨基酸。所述公共序列含有小写字母和大写字母。大写字母代表标准的一 个字母的氨基酸缩写，而小写字母代表氨基酸的种类“t”指小氨基酸，其具体为丙氨酸， 甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸；“P"指极性氨基酸，其具体为天冬酰胺和谷胺酰胺；“η"指 负电荷的氨基酸，其具体为天冬氨酸和谷氨酸；“+"指正电荷残基，其具体为赖氨酸，精 氨酸，和组氨酸；“r"指芳香残基，其具体为苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸；“a"指脂肪 族残基，其具体为异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸，和甲硫氨酸。共有序列中可允许的氨基酸缺口 用" “符号标记。例如，<1>表示等于1个氨基酸的缺口是允许的；<2_4>表示2-4个氨 基酸的缺口是允许的。图3列出DWF4反义序列(DWF4a/s ；SEQ ID NO 5)；参见实施例3。图4示范拟南芥DWF4和稻(Oryza Sativa) DWF4在氨基酸水平上的比对。这两个 序列彼此间有69%的同源性。膜锚定，脯氨酸富集，O2-结合，类固醇结合，功能未知，和血 红素结合域的位置分别由下划线1-6表示。将相同的氨基酸用暗灰色阴影封闭。图5示范本文所用的许多启动子的核苷酸序列。图6是显示本文所描述的转基因植物和对照之间在不同的光强度比较光合作用 率(PS)的图表。PS 率在 380ppm CO2 浓度，25°C温度，和 0，20，50，100，200，500，1000，1500， 2000 μ mo 1 m-k-1，在完整的旗叶上测定。每个光点的PS率代表3株植物的平均值。线条 代表标准偏差。图7显示编码本文所描述的拟南芥，玉蜀黍(Zea mays)，和稻DWF4多肽的多聚核 苷酸序列。图8显示许多DWF4多肽直向同源物，例如C_22 α -羟化酶直向同源物的多肽序 列。发明详述组成型启动子在大多数，但不必要是全部的，环境条件和发育状态或细胞分化 下，本文提到的作为“组成型启动子”的启动子促进在所有植物组织中有效连接的序列的可 检测水平的转录。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S转录起始区域，拟 南芥启动子Ρ13879和ρ3Μ49，衍生于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) T-DNA的 1'或2'启动子，许多植物基因的其它转录起始区域，诸如玉米泛蛋白-1启动子。广泛表达的启动子当它在许多，但不必是所有，植物组织中促进转录时，启动子可以称为是如本文所用的“广泛表达的”。例如，广泛表达的启动子可以促进有效连接的序 列在茎，枝条，茎尖(苗端)，和叶片中的转录，但是可以微弱地或完全不促进在组织，诸如 花和发育的种子的繁殖组织中的转录。在某些情形中，有效地连接到序列上的广泛表达的 启动子可以以比在根组织或发育的种子中的转录水平高出至少2倍(例如，至少3，5，10，或 20倍)的水平促进在植物枝条中的转录。在其它情形中，广泛表达的启动子可以以比在花 的繁殖组织中的转录水平高出至少2倍(例如，至少3，5，10，或20倍)的水平促进在植物 枝条中的转录。考虑到上述，不认为CaMV 35S启动子是广泛表达的启动子。用于本发明的 广泛表达的启动子实例包括 p326，YP0158，YP0214，YP0380，PT0848，PT0633，YP0050，YP0144 和 YPO190。结构域结构域是可以用于特征性描述蛋白家族和/和蛋白片段的指纹结构或标 签。这样的指纹结构或标签可以包括保守的(1) 一级序列；和/或(2) 二级结构；和/或 (3)三维构象。一般地，结构域可以与蛋白家族或基序相关。典型地，这些家族和/或基序与 体外和/或体内活性相关。结构域可以是任何长度的，包括蛋白序列的全部。细胞色素？45(| 结构域，相关的家族和基序，以及与本发明的多肽的相关活性的详细描述在下文中描述。如 本文所描述，具有表现出与另一多肽特定百分比的序列同源性的一个或多个指定结构域的 多肽，可以表现出由另一多肽所表现出的至少一种生化活性，或者可以以相似的方式影响 植物表型。内源的术语“内源的”在本发明上下文中是指为细胞的天然部分或从所述细胞再 生的有机体的任何多聚核苷酸，多肽或蛋白序列。外源的“外源的”是指通过除性杂交以外的任何方式而引入宿主细胞或生物体的 多聚核苷酸。典型地，外源多聚核苷酸稳定地整合到宿主细胞或生物体的基因组中。可以 将多聚核苷酸引入植物和植物细胞的方法的实例在下文描述，并且其包括农杆菌介导的转 化，生物射弹方法，电穿孔，in planta技术，等。此处，含有外源核酸的植物，对于初级转基 因植物可以称为T1植物，对于第一代称为T2植物，并且对于第二和后续代植物称为T3，T4, 等等。T2后代是T1植物自体受精的结果。T3后代是T2植物自体受精的结果。应该理解，外 源多聚核苷酸可以已经被引入祖先细胞，而不是研究的细胞或植物。例如，含有所有外源核 酸的转基因植物可以是稳定转化的植物和非转基因植物之间杂交的后代。认为这样的后代 含有所述外源多聚核苷酸。因此，BCl，BC2，和BC3植物以及Fl，F2，和F3植物可以类似地 含有外源多聚核苷酸。功能相当的多肽这一短语描述那些具有至少一种共有特征的多肽。这样的特征包 括序列相似性或同源性，生化活性，转录模式相似性，和表型活性。典型地，功能相当的蛋白 共享一些序列相似性或同源性。在这一定义中，认为同系物或直向同源物是功能相当的。另 外，功能相当的蛋白可以共享至少一种生化活性。例如，功能相当的多肽可以是“生化相当 的”，例如，可以作用在相同的反应物上以给出相同的产物。生化相当物可以或可以不展现 出相同的动力学，与反应物的亲和力，或产生所述产物的周转时间，但是由于产生了相同的 最终产物，仍旧可以认为是功能相当的。另一类功能相当的多肽是“表型相当的(phenotypic comparables) ”，其影响相 同的物理特征，诸如增加的植物大小或高度或改变的新陈代谢模式。即使多肽影响相同的 物理特征，但是程度不同的，还是可以认为多肽是表型相当的。例如，相当的多肽影响相同的特征(例如，导致增加的高度)，其中由相当的多肽之一引起的定量测定是另一个的大约 20%或更多；例如，约 20-30%;约 30-40%;约 40-50%;约 50-60%;约 60-70%;约 70-80%； 约80-90% ；或约90-100%。因此，尽管一种蛋白将植物高度增加10%和另一种植物将植 物高度增加15%，但是两种多肽可以是表型相当物。基因当用于本发明上下文时，术语“基因”包括与具有遗传功能的单一遗传个体 相邻地缔合的所有调控和编码序列。基因可以包括调节遗传功能的非编码序列，所述遗传 功能包括，但不限于，特定多腺苷化作用，转录调控，DNA构象，染色质构象，碱基甲基化的程 度和位置以及控制所有这些的蛋白的结合位点的那些。包括“外显子”(编码序列)的基 因，其可以被“内含子”(非编码序列)中断，编码蛋白。基因的遗传功能可以只需要RNA表 达或蛋白生产，或可以只需要蛋白和/或核酸的结合，无需相关的表达。在某些情形中，临 近彼此的基因可以以这样的方式共享序列，即，一个基因将重叠另一基因。基因可以在生物 体的基因组、人工染色体、质粒、载体等中发现，或作为独立的分离实体而发现。异源序列“异源序列”是那些没有有效连接和/或本质上不是彼此接近的那些序 列。例如，认为来自玉米的启动子对于拟南芥编码区序列是异源的。而且，认为来自编码玉 米生长因子的基因的启动子对于编码玉米所述生长因子受体的序列是异源的。调控元件序 列，诸如本质上没有起始于所述编码序列起始的相同的基因的UTRs或3'末端终止序列， 被认为对于所述编码序列是异源的。本质上有效地连接并且彼此相邻的元件对于彼此不是 异源的。另一方面，这些相同的元件保持有效地连接，但是如果将其它填充序列置于它们之 间就会变成是异源的。因此，表达氨基酸转运蛋白的玉米基因的启动子和编码序列彼此不 是异源的，但是以新型方式有效连接的玉米基因的启动子和编码序列是异源的。同源的在本发明中，“同源的”是指，例如，与目的基因，核酸，多聚核苷酸，或多肽 共享一定程度的序列相似性或同源性的基因，核酸，多聚核苷酸，或多肽。这种相似性可以 只在所述序列的片段中，并且可以代表结构域(例如，结构或功能结构域)。同源实体的生 化活性或表型作用不必要是相同的或相似的，尽管它们可以是相同的或相似的。可诱导的启动子在本发明的上下文中，“可诱导的启动子”是指在某些条件下，诸 如光，化学药品浓度，蛋白浓度，生物体、细胞或细胞器官内的条件，等等，受到调控的启动 子。可以与本发明的多聚核苷酸一起应用的可诱导的启动子的典型实例是PARSK1，来自编 码丝氨酸-苏氨酸激酶酶的拟南芥基因的启动子，并且所述启动子受到脱水作用，脱落酸 和氯化钠的诱导(Wang和Goodman，Plant 18:37(1995))。可以通过可诱导的启动子而影 响转录的环境条件的实例包括无氧条件，升高的温度，或光的存在。有效地连接“有效地连接”到编码序列上的控制元件以这样的方式结合到所述编 码序列上，以便在与控制元件兼容的条件下获得所述编码序列的表达。所述控制元件不必 与编码序列相邻。因此，例如，对不翻译但是转录的序列的干涉可以存在于启动子和编码序 列之间，以便所述启动子“有效地连接”到所述编码序列上。直向同源物在本发明中，“直向同源物”是指编码如第一种核酸的产物那样行使 相似的生化活性或以相似的方式影响表型的基因产物或多肽的第二种核酸。所述直向同源 物典型地还将具有同第一种核酸一定程度的序列相似性或同源性。因此，直向同源核酸可 以编码表现出同第一种核酸编码的多肽有一定程度的序列相似性的多肽。所述序列相似性 可以在一个或多个功能和/或结构结构域或沿着所述核酸的编码序列和/或它们对应的多肽的全长而发现。序列同源性百分数一般地，术语“同源性”是指分别对应两种多聚核苷酸或多肽 的准确的核苷酸-对-核苷酸或氨基酸-对-氨基酸。两种或多种序列(多聚核苷酸或多 肽)可以通过确定它们的“序列同源性百分数”而进行比较。用在本文中时，术语“序列同 源性百分数”是指任何给出的质询序列和主题序列之间的同源性的程度。对于任何质询核 酸或氨基酸序列，例如，C22-Q羟化酶相对于主题核酸或氨基酸序列的同源性百分数可以 如下确定。应用计算机程序ClustalW，其允许核酸或蛋白序列的比对沿着它们的全长(总 体对比)进行，将质询核酸或氨基酸序列与一种或多种主题核酸或氨基酸序列进行比对。 ClustalW计算质询和一种或多种主题序列之间的最佳匹配，并且比对它们，以便可以确定 同源性，相似性和差异性。可以将一个或多个残基的缺口插入质询序列，主题序列或两者 中，以将序列比对最大化。对于核酸序列的快速成对比对，应用显示参量词的大小2 ；窗 口大小4;得分方法百分数；顶端对角线数目4;和缺口罚分(penalty) :5。对于核酸 序列的多重比对，应用下述参量缺口开放罚分10.0 ；缺口延伸罚分5.0 ；和重量转换 是。对于蛋白序列的快速成对比对，应用下述参量词的大小1 ；窗口大小5 ；得分方法 百分数；顶端对角线数目5;缺口罚分3。对于蛋白序列的多重比对，应用下述参量重量 基质bloSum ；缺口开放罚分10. 0 ；缺口延伸罚分0. 05 ；亲水性缺口 开启；亲水性残基 GPSNDQERK ；残基特异性缺口罚分开启。输出是序列对比，其反映序列之间的关系。例如，ClustalW可以在BayIor College of Medicine (BCM) Search Launcher 网 tit <http://searchlauncher. bcm. tmc. edu/multi-align/multi-align. html> 5 ￠: European Bioinformatics Institute 网址 <http://www. ebi. ac. uk/clustalw> 运行。为了确定质询序列和主题序列之间的同源性百分数，ClustalW用更短序列的碱基 或氨基酸数目除以匹配的碱基或氨基酸数目，并且用100乘所述结果。输出是所述主题序 列关于所述质询序列的同源性百分数。例如，如果质询序列和主题序列各为500个碱基对 长，并且具有200个匹配的(或相同的)碱基，那么所述主题序列将具有对于所述质询序列 40%的序列同源性。如果两种比较的序列是不同的长度，那么将匹配的数目除以两种序列 长度中更短的序列。例如，如果在400质询多肽和500个氨基酸的主题多肽之间有100个 氨基酸匹配，那么所述主题多肽将具有同质询多肽25%的同源性。如果更短的序列长度上 少于150个碱基或50个氨基酸，那么将匹配的数目除以150 (对于核酸碱基)或50 (对于 氨基酸)，并且乘以100，以获得同源性百分数。在一些实施方案中，适当的主题多肽的氨基酸序列具有同质询的多肽的氨基酸序 列(例如，SEQ ID N0S:2和3)大于40%的序列同源性(例如，> 40%，> 50%，> 60%，
>70%, > 75%, > 80%, > 85%, > 86%, > 87%, > 88%, > 89%, > 90%, > 91%, > 92%，> 93%，> 94%，> 95%，> 96%，> 97%，> 98%，或者> 99%的序列同源性)。在 一些实施方案中，适当的主题核苷酸的核苷酸序列具有同质询核酸的核苷酸序列大于70% 的序列同源性(例如，>75%，>80%，>85%，>90%，>91%，>92%，>93%，>94%，
>95%，> 96%，> 97%，> 98%，或者> 99%的序列同源性)。应该注意到，同源性百分数值可以四舍五入到最接近的十分之一。例如，将78. 11，78. 12，78. 13，和 78. 14 四舍五入到 78. 1，而将 78. 15，78. 16，78. 17，78. 18，和 78. 19 四舍五
入到78. 2。还应该注意到，长度值应该总是整数。植物启动子“植物启动子”是能够在植物细胞中起始(促进)转录的启动子。这 样的启动子不必是植物源性的。例如，衍生于植物病毒的启动子，诸如CaMV35S启动子，或 衍生于根癌农杆菌的启动子，诸如T-DNA启动子，可以为植物启动子。植物源性的植物启动 子的典型实例是玉米泛蛋白-l(ubi-l)启动子。其它植物启动子也是为本领域的普通技术 人员所知的。启动子用在本文时，术语“启动子”是指位于基因转录起点的上游的序列确定子 区域，并且其参与RNA聚合酶和其它蛋白的识别和结合，以起始和调节转录。基本的启动子 是组装转录起始所需要的转录复合物必需的最小序列。基本启动子通常包括"TATA盒" 元件，其通常位于转录起始位点上游的第15和35个核苷酸之间。有时，基本启动子还包 括"CCAAT盒"元件(典型地CCAAT序列)和/或GGGCG序列，其通常位于转录起点上游 第40和200个核苷酸，优选地第60-120个核苷酸之间。调控序列术语“调控序列”和“控制元件”可以互换的应用，并且是指影响转录或 翻译起始和速率，和所述译本或多肽产物的稳定性和/或运动性的任何核苷酸序列。调控 序列包括，但不限于，启动子，启动子控制元件，蛋白结合序列，5'和3' UTRs，转录起始位 点，终止序列，多聚腺苷化序列，内含子，编码序列内的特定序列，等等。严谨性用于本文时，“严谨性”是探针长度，探针组合物(G+C含量)，和盐浓度， 有机溶剂浓度，和杂交温度或洗涤条件的功能。严谨性典型地通过参数Tm和与Tm不同的 温度而进行比较，Tm是当杂交中有50%的互补分子杂交时的温度。高度严谨性条件是提供 Tm-5°C到Tm-10°C的条件的那些。中间或中等严谨性条件是提供Tm-20°C到Tm-29°C的条件 的那些。低严谨性提交是提供Tm-40°C^ljTm-48°C的条件的那些。杂交条件与Tm(°C)的关 系表示在数学方程中Tm = 81. 5-16. 6 (Iog10 [Na+] )+0. 41(% G+C) - (600/N) (1)其中N是探针的长度。这一方程对于长度在14-70个核苷酸与目标序列相同的探 针非常有用。下述对于DNA-DNA杂合体的Tm的方程有效用于在50到大于500个核苷酸范 围内的探针，并且用于包括有机溶剂(甲酰胺)的条件。Tm = 81. 5+16. 61og {[Na+] / (1+0. 7 [Na+])} +0. 41(% G+C) -500/L0. 63(% 甲酰胺) (2)其中L 是杂合体中探针的长度。(P. Tijessen, “ Hybridization with NucleicAcid Probes “ in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, P. C. vand der Vliet, ed.，c. 1993by Elsevier, Amsterdam.)方程 U)的 Tm 受到 杂合体性质的影响；对于DNA-RNA杂合体，Tm高于计算值10-15°C，对于RNA-RNA杂合体，Tm 高出20-25°C。由于当应用长探针时，同源性每减少1%，Tm减少约1°C (Bormer等.，J. Mol. Biol. 81 :123(197 ),所以可以将严谨性条件调整到支持相同基因或相关家族成员检测。假定平衡，并且因此，按照本发明的杂交在探针过剩和充足的时间条件下最优选 地实行，以获得平衡，得出方程O)。需要达到平衡的时间可以通过在杂交缓冲液中包含杂 交促进剂，诸如葡聚糖硫酸酯或其它高体积的多聚物而缩短。可以在杂交反应过程中，或在杂交发生后，通过改变所用的洗涤溶液的盐和温度条件而控制严谨性。当用于计算洗涤溶液的严谨性时，上文显示的公式是同等可用的。优 选的洗涤溶液严谨性处于上文描述的范围内；高严谨性是低于Tm 5_8°C，中间或中等严谨 性是低于Tm 2649°C，和低严谨性是低于Tm 45-48°C。基本上没有当组合物中全部A+B中至少85重量％是A时，含有A的组合物是“基 本上没有”B的。优选地，A包括组合物中全部A+B的至少约90重量％，更优选地至少约95 重量％或甚至99重量％。例如，可以认为植物基因或DNA序列基本上没有其它植物基因或 DNA序列。翻译起始位点在本发明的上下文中，cDNA转录中“翻译起始位点”通常是ATG，更 通常是第一个ATG。然而，单一的cDNA可以具有多个翻译起始位点。转录起始位点在本发明中，“转录起始位点”用来描述转录起始的点。这一点典 型地位于TFIID结合位点下游约25个核苷酸处，诸如TATA盒。转录可以在基因内的一个 或多个位点起始，并且单个基因可以有多个转录起始位点，它们中的一些可以是特异性用 于在具体的细胞类型或组织中的转录。不翻译区(UTR) “ UTR"是转录但是不翻译的任何相邻系列的核苷酸碱基。这些 不翻译的区域可以同具体的功能相关，诸如增加mRNA信使的稳定性。UTRs的实例包括，但 不限于，多聚腺苷化信号，终止序列，位于转录起点和第一个外显子之间的序列(5' UTR), 以及位于最后一个外显子和mRNA末端的序列(3 ‘ UTR)。载体载体意指能够将多聚核苷酸序列转运到靶点细胞的任何遗传元件，诸如质 粒，噬菌体，转座子，黏端质粒，染色体，病毒，等。一般地，当与适当的控制元件相缔合时，载 体能够复制。因此，所述术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体和结合载体。核酸或多聚核苷酸当用在本文中时，术语“核酸”或“多聚核苷酸”互换应用，并且 是指RNA和DNA，包括cDNA，基因组DNA，合成(例如，化学合成的)DNA,和含有核酸类似物 的DNA(或RNA)。多聚核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以处于有义或反义方向。多聚 核苷酸的非限制性实例包括基因，基因片段，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核 糖体RNA，核糖体，cDNA,重组多聚核苷酸，分支多聚核苷酸，质粒，载体，分离的任何序列的 DNA，分离的任何序列的RNA，核酸探针，和引物。分离的核酸分子可以通过标准技术产生。例如，聚合酶链式反应(PCR)技术可以 用来获得分离的含有本文所描述的核苷酸序列的核酸。PCR是指在其中酶促扩增目的核酸 的方法或技术。典型地应用目的区域末端或以外的序列信息来设计寡聚核苷酸引物，其与 要被扩增的模板的反向链的序列一致。PCR可以用来从DNA以及RNA扩增具体的序列，包 括来自全基因组DNA或全细胞RNA的序列。引物在长度上典型地为14-40个核苷酸，但是 在长度上可以从10个核苷酸到几百个核苷酸(例如，长度为10，15，20，25，27，34，40，45， 50，52，60，65，70，75，82，90，102，150，200，250 个核苷酸)。例如，综合的 PCR 技术在 PCR Primer :A Laboratory Manual,Dieffenbach,C.禾口Dveksler,G.编辑，Cold Spring Harbor Laboratory I^ress，1995中描述。当应用RNA作为模板来源时，可以应用反转录酶来合成 互补的DNA(cDNA)链。连接酶链式反应，链置换扩增，自动维持序列扩增或基于核酸序列的 扩增也可以用来获得分离的核酸。例如，参见，Lewis, 1992, Genetic Engineering News, 12 1 ；Guatelli 等.,1990, Proc.Natl. Acad. Sci.USA,87 :1874-1878 ；和 Weiss,1991, Science,254 12920
本发明分离的核酸还可以是化学合成的，作为单个核酸分子(例如，应用 phosphoramidite技术，在3' -5'方向应用自动DNA合成)或作为一系列寡聚核苷酸。例 如，可以合成含有需要的序列的一对或多对长寡聚核苷酸(例如，> 100个核苷酸)，每一 对含有短的互补片段(例如，约15个核苷酸)，以便当所述寡聚核苷酸对退火时，形成双链 体。DNA聚合酶用来延伸寡聚核苷酸，每个寡聚核苷酸对形成单个的、双链的核酸分子，然后 将其连接到载体中。本发明分离的核酸还可以通过诱变获得。例如，应用标准技术，包括通过PCR的 寡聚核苷酸定向诱变和位点定向诱变，可以将参考核酸序列突变。参见，Short Protocols in Molecular BioloRy,第 8 章，Green PublishingAssociates 禾口 John Wiley & Sons, Ausubel, F. Μ.等编辑，1992。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分、或磷酸骨架上进行修饰，以提高，例如，核酸 的稳定性、杂交性、或溶解性。对骨架的修饰包括不带电荷的连接(例如，磷酸甲酯，磷酸 三酯，磷酰胺(phosphamidates)，氨基甲酸，等)和带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯，二 硫代磷酸酯，等)。对骨架的修饰还可以结合肽连接，例如，导致PNA-型连接。在碱基部 分的修饰包括使脱氧胸苷修饰成脱氧尿苷，将脱氧胞苷修饰成5-甲基-2'-脱氧胞苷或 5-溴-2'-脱氧胞苷。糖部分的修饰包括修饰核糖的2'羟基形成2' -0-甲基或'-0-烯 丙基糖。可以修饰磷酸脱氧核糖骨架，以产生吗啉代核酸，其中每个碱基部分连接六元吗啉 环，或产生肽核酸，其中脱氧磷酸骨架被假肽骨架取代，并且保留4个碱基。皿Summer ton 和Weller,Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997)7(3) :187-195 ；和Hyrup等· (1996) BioorRan. Med. Chem.4(l) :5-23.另外，例如，脱氧磷酸骨架可以被硫代磷酸酯或二硫代磷 酸酯骨架，磷酰胺，或烷基磷酸酯骨架取代。核酸可以是双链的或单链的(即，有义或反义 单链)。当用于本文时，“分离的”，当指核酸或多聚核苷酸时，是指从在基因组，例如植物 基因组中存在的其它核酸或多聚核酸分子分离的核酸或多聚核苷酸，其包括通常侧连在所 述基因组的核酸或多聚核苷酸的一侧或两侧的核酸或多聚核苷酸。用在本文时，关于核酸 或寡聚核苷酸的术语“分离的”还包括任何非天然存在的序列，由于这样的非天然存在的序 列没有在天然中发现，并且在天然存在的基因组中没有直接相邻的序列。例如，分离的核酸或多聚核苷酸可以是DNA分子，条件是在天然存在的基因组中 通常发现直接与所述DNA分子侧连的核酸序列之一被移除或不存在。因此，分离的核酸包 括，但不限于，作为不依赖于其它序列的分离的分子(例如，化学合成的核酸，或由PCR或限 制性核酸内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)而存在的DNA分子，以及结合到载体、 自主复制的质粒、病毒(例如，反转录病毒，慢病毒，腺病毒，或疱疹病毒)上的DNA，或原核 生物或真核生物的基因组DNA。另外，分离的核酸可以包括工程核酸，诸如作为杂合或融合 核酸的一部分的DNA分子。例如，在cDNA文库或基因组文库，或含有基因组DNA限制性消 化液的凝胶切片上成百到上百万其它核酸中存在的核酸，不认为是分离的核酸。多肽术语“多肽”以其最宽泛的意义应用，指两个或多个亚基氨基酸、氨基酸类似 物、或其它肽模拟物的化合物。所述亚基可以通过肽键或其它键连接，例如，酯，醚，等。术 语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括D/L光学异构体。通过这一 定义包括全长的蛋白、类似物、突变体及其片段。
至于多肽，“分离的”，意指在某种程度上所述多肽与其通常在天然发现的细胞成 分分离。分离的多肽可以在非还原多聚丙稀酰胺凝胶上产生单一的主带。在某些情形中， 多肽是“纯化的”。用在本文时，术语“纯化的”优选地指，例如，在混合物中相对于所有的多 肽，存在至少约75重量％或更多(例如，至少80%，85%，90%，95%，97%，98%，99%，或 100%)的同一类型的多肽。例如，分离的多肽可以通过从天然来源提取，通过化学合成，或 通过在宿主细胞或转基因植物中重组生产获得。为了重组生产多肽，可以将含有编码目的多肽的核苷酸序列的核酸序列连接到表 达载体中，并且用来转化细菌，真核或植物宿主细胞(例如，昆虫，酵母，哺乳动物，或植物 细胞)。在细菌系统中，可以应用大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，诸如BL-21。适宜的 大肠杆菌(E.coli)载体包括可以产生具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的pGEX 系列载体。取决于所用的载体，转化的大肠杆菌典型地指数性生长，然后，在收获之前用异 丙基硫代半乳糖苷(IPTG)刺激。一般地，表达的融合蛋白是可溶的，并且通过吸附到谷胱 甘肽琼脂糖珠子上，然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱，可以容易地从裂解细胞中纯化。PGEX 载体设计成包括凝血酶或)(a因子蛋白酶裂解位点，以致克隆的目标基因产物可以从GST部 分释放出来。备选地，6X His-标记可以用来辅助分离。在真核宿主细胞中，许多基于病毒的表达系统可以用来表达多肽。例如，可以将编 码本发明的多肽的核酸克隆到杆状病毒载体，诸如pBlueBacdnvitrogen，Carlsbad, CA) 中，并且然后用来与来自Autographa californica多包被核多面体病毒(AcMNPV)的野生 型DNA —起共同转染昆虫细胞，诸如Spodoptera frugiperda(Sf9)细胞。产生本发明多肽 的重组病毒可以通过标准方法学鉴别。通过应用具有适当控制元件和选择标记的表达载体，可以产生稳定表达多肽的 哺乳动物细胞系。例如，pcDNA3真核表达载体(Invitrogen，Carlsbad, CA)适于在细胞， 诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、C0S-1细胞、人胚肾293细胞、NIH3T3细胞、BHK21细胞、 MDCK细胞、ST细胞、H(15细胞、或人血管内皮细胞(HUVEC)中表达多肽。在一些实例中， pcDNA3载体可以用来在BHK21细胞中表达多肽，其中所述载体包括CMV启动子和G418抗 生素抗性基因。按照表达载体的介绍，例如，可以通过对G418、卡那霉素或潮霉素的抗生 素抗性，选择稳定的细胞系。备选地，可以将扩增的序列连接到哺乳动物表达载体上，诸如 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA)，并且然后应用小麦胚芽提取物或兔网织红细胞裂解 物在体外转录和翻译。在其它情形中，可以用重组核酸构建体转化植物细胞，以表达多肽，如先前和在下 述实施例中所描述的那样。然后，可以应用本领域具有普通技术的人员已知的技术，提取并 纯化所述多肽。多聚核苷酸和多肽由于包括它们的转基因植物相对于对照植物可以展现出改变的表型特征，所以本 文所描述的多聚核苷酸是令人感兴趣的。例如，转基因植物可以展现出改变的新陈代谢模 式。改变的新陈代谢模式可以包括改良水平的蔗糖、谷氨酸、或亚油酸，如下文所讨论的那 样。在一些情形中，转基因植物可以表现出增加水平的6-脱氧油菜素留酮，和/或减少水 平的菜油留醇。在一些情形中，表达这样的多肽的转基因植物可以表现出提高的光合作用 率。
这些改变的表型特征可以用来开发或最佳化植物产品。例如，本发明的多聚核苷 酸和/或多肽可以用来增加植物中蔗糖、谷氨酸、或亚油酸的水平；或增加植物中6-脱氧油 菜素留酮的水平；或减少植物中菜油留醇的水平；或提高植物的光合作用率。在某些情形 中，多于一种表型特征得到改善，例如，增加水平的6-脱氧油菜素留酮和减少水平的菜油 甾醇。因此，转基因植物可以具有提高的生长潜力，具有增加的生物量、高度、种子产量、种 子重量、或提高的种子充实度。因此，所述多聚核苷酸或多肽有效用于制备在农业和林业产 业中具有特殊应用的转基因植物。特别地，提供了分离的P45tl多聚核苷酸和多肽序列，包括多聚核苷酸序列变体、同 系物、直向同源物、融合体、和片段、和与P45tl多肽功能相当的多肽。分离的P45tl多聚核苷酸 和多肽可以是拟南芥Dwf4多聚核苷酸或DWF4多肽的同系物和/或直向同源物。分离的P45tl 多聚核苷酸和多肽可以是编码22-α羟化酶或22-α羟化酶多肽的同系物和/或直向同源 物。因此，本文描述了分离的Dwf4多聚核苷酸或DWF4多肽序列，其包括与拟南芥DWF4功 能相当的DWF4多肽。DWF4是细胞色素P45tl多肽，除了其它活性，其催化菜油甾醇在C-22羟 基化以产生6-脱氧油菜素留酮。因此，在某些情形中，多肽序列可以以与DWF4多肽相似的 方式，表现出生化活性或影响植物表型，并且代表与拟南芥DWF4蛋白生化或表型功能相当 的多肽。本发明的多聚核苷酸包括编码细胞色素P45tl多肽的核酸。SEQ ID N0s:l_3分别 列出来自拟南芥、玉米和水稻的3种P45tl蛋白的多聚核苷酸和多肽序列。拟南芥和水稻序 列是编码22-α羟化酶酶的DWF4多肽。通过将玉米多肽序列文库针对许多多肽数据库，包 括Ρ45(ι、植物和私人所有的数据库进行序列比较，并且通过评估表达所述玉米多肽(SEQ ID NO 2)的转基因植物相对于表达拟南芥DWF4多肽(SEQ ID NO 1)或水稻DWF4多肽(SEQ ID NO 3)的转基因植物的表型特征，鉴定玉米多肽(SEQ ID NO 2)为DWF4直向同源物。参 见下述实施例和图4，图4列出了在拟南芥DWF4多肽和水稻DWF4多肽之间的比对。还考虑了所描述的多聚核苷酸(和编码的多肽)的同系物、直向同源物、片段、融 合体、补体、或反向补体。如上文所述，多肽的同系物和直向同源物可以叫作功能相当的多 肽。功能相当的多肽同系物表现出同SEQID NO :2列出的玉米多肽序列有特殊水平的序列 同源性。例如，分离的多聚核苷酸可以包括编码同SEQ ID NO :2列出的氨基酸序列有约 85%或更多序列同源性，例如，约86，87，90，92，95，96，97，98，99，或100%序列同源性的多 肽的核酸。功能相当的蛋白可以是拟南芥DWF4的直向同源物。功能相当的蛋白可以是具 有C-22 α -羟化酶活性的多肽的直向同源物。图8列出拟南芥DWF4的许多直向同源物的 多肽序列。在一些情形中，分离的多聚核苷酸可以包括编码这样的多肽的核酸，S卩，所述多肽 包括与图2列出的DWF4多肽的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的氨基酸序列。例如，分离 的多聚核苷酸可以包括编码与图2列出的DWF4多肽的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的 多肽的核酸。在一些情形中，所述多聚核苷酸还包括有效连接到编码所述多肽的核酸上的 广泛表达的启动子。可以应用任何广泛表达的启动子，包括，但不限于，本文进一步描述的 那些。在一些情形中，分离的多聚核苷酸可以包括编码这样的多肽的核酸，S卩，所述多肽 包括与图2列出的DWF4多肽的共有序列(SEQ ID NO :4)相对应的氨基酸序列，条件是所编码的多肽没有表现出同SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3列出的氨基酸序列有93%或更多 (例如，94%，94· 5%，95%，95· 5%，96%，97%，98%，或99% )的序列同源性。可以应用包 括与共有序列相对应的氨基酸序列的多肽，例如，来制备具有一种或多种下述表型特征的 转基因植物改良的(例如，提高的)光合作用率，增加水平的6-脱氧油菜素留酮，减少水 平的菜油留醇，改良的新陈代谢模式，例如，增加水平的蔗糖、谷氨酸、或亚油酸，提高的种 子产量，提高的种子充实度，增加的植物高度，等。在某些情形中，本文所描述的多肽可以是与拟南芥DWF4功能相当的蛋白直向同 源物，这通过多肽行使至少一种DWF4的生化活性或以与DWF4相似的方式影响植物表型而 确定。因此，多肽可以催化与DWF4相似的反应，或以与DWF4相似的方式影响植物表型。例 如，已知拟南芥DWF4催化菜油留醇在C-22氧化以形成6-脱氧油菜素留酮。DWF4还催化 6-氧代菜油甾醇羟化以产生油菜素甾酮(cathasterone)。本发明的多肽还可以完成这些 酶促步骤的一步或两步。在某些情形中，功能相当的多肽表现出至少60%的拟南芥DWF4蛋白生化活性，例 如，至少70 %，80%，90 %，或95%的生化活性。评估生化活性的方法对本领域的普通技术 人员是已知的，并且包括酶促检测(例如，评估Vmax，Kffl, Kcat, Ki等)，放射性示踪剂摄取检 测，等等。特别地，对于所给的酶促步骤的底物和产物水平，可以应用本领域的普通技术人 员已知的分析技术(例如，GC-MS)来评估。例如，BL途径中的化学中间体水平可以在包括 编码本文所描述的多肽的多聚核苷酸的转基因植物中评估。相对于对照植物中的水平，可 以比较水平。转基因植物中化学中间体的水平可以在发育的各个时期，例如，在幼苗或成熟 时期，或应用各种组织(例如，种子，叶片，枝条，茎，花，等等)进行评估。菜油留醇水平的 减少和/或6-脱氧油菜素留酮水平的增加可以预示多肽是拟南芥DWF4的直向同源物。重组载体和宿主细胞本发明还提供包括上述任何分离的多聚核苷酸的重组载体和宿主细胞。如下文更 加充分地说明，各种重组载体是本领域的普通技术人员已知的。重组载体可以包括具有任 何需要的转录和/或翻译调控序列，诸如启动子，UTRs，和3'末端终止序列的本发明的序 列。载体还可以包括复制起点，支架附着区(SARs)，标记，同源序列，内含子，等。所述载体还 可以包括赋予植物细胞可选择的表型的标记基因。所述标记典型地编码生物杀灭剂抗性， 特别是抗生素抗性，诸如对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的抗性，或除草剂抗性诸如氯 石黄隆(chlorosulfuron)或 phosphinotricin 的抗性。典型地，重组的载体将包括多聚核苷酸和有效连接到多聚核苷酸上的控制元件， 以致例如，在宿主细胞中，多聚核苷酸中的多肽编码序列可以被转录和翻译。控制元件可以 是启动子，它们中的一些是本领域的技术人员已知的。例如，植物启动子可以包括，诸如指 导所述基因在再生的植物的所有的或某些组织中转录的启动子，例如，组成型启动子，诸如 35S或广泛表达的启动子，诸如在这样的情形中，启动子有效地连接到编码目的多肽 的核酸上。备选地，植物启动子可以指导本发明的序列在特定组织中的转录(组织特异性 启动子)，或者另外是在更加精确的环境控制下(可诱导的启动子)。如先前所说明的，各 种植物启动子，包括组成型的、组织特异性的、广泛表达型的、和可诱导的启动子，是本领域 的技术人员已知的。还可以包括在编码区的3'末端的多聚腺苷化区域。所述多聚腺苷化 区域可以衍生于天然基因，衍生于各种其它植物基因，或衍生于T-DNA。
在某些情形中，可以包括广泛表达的启动子。可以应用例如，广泛表达的启动子， 诸如 p326，YPO158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144 和 YP0190。在这样的 情形中，有效地连接到广泛表达的启动子上的多聚核苷酸可以是上述任何多聚核苷酸，例 如，包括编码SEQID NOs 1-3或图2列出的共有的DWF4氨基酸序列的核酸的那些，或包括 编码这样的多肽的核酸序列的多聚核苷酸，即，所述多肽表现出同SEQID NOs 1-3至少约 85% (例如，至少约 86%，87%，90%，92%，95%，96%，97%，98%，99%或 100% )的序列 同源性。在应用组成型启动子，诸如35S的情形中，多聚核苷酸可以包括编码同SEQ ID NO 2列出的氨基酸序列有85%或更多序列同源性(例如，约86，87，90，92，95，96，97，98，99，或 100%序列同源性)的核酸，或可以包括编码具有与图2列出的DWF4多肽的共有序列(SEQ ID NO :4)相对应的氨基酸序列的多肽的核酸，条件是所编码的多肽没有表现出同SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3列出的氨基酸序列有93%或更多的(例如，94，94. 5,95,95. 5,96,97, 98，99或100% )序列同源性。重组载体可以用来转化各种植物细胞以制备转基因植物。本领域已知用于转化广 泛种类的高等植物种类的技术。典型地，制备包括本发明的多聚核苷酸序列的重组DNA构 建体，所述多聚核苷酸序列插入到适于转化植物细胞的载体中。构建体可以应用标准的重 组DNA技术(Sambrook等.1989)制备。载体骨架可以是本领域中任何典型的载体，诸如质 粒，病毒，人工染色体，BACs，YACs和PACs。转基因植物本发明还提供包括本文所描述的外源多聚核苷酸或重组载体的转基因植物。通过 许多已知的方法，包括电穿孔，显微注射，和生物射弹方法，可以将先前所描述的任何多聚 核苷酸或重组载体引入到各种植物宿主的基因组中。备选地，所述多聚核苷酸或载体可以 与适当的T-DNA侧接区域连接，并且引入到常规根癌农杆菌宿主载体中。这样的根癌农杆 菌介导的转化技术，包括解除(disarming)以及二元载体的应用，在本领域内是公知的。其 它基因转移和转化技术包括通过钙或PEG原生质体转化，电穿孔介导的裸DNA的摄入；植物 组织的电穿孔，和微粒轰击。本发明的序列的异位表达可以应用“敲入”方法实现。这里，第一成分，“活化子系 (activator line) ”，是包括有效连接到启动子上的转录活化子的转基因植物。第二成分包 括有效连接到转录活化子的靶点结合序列/区域的需要的cDNA序列。将第二成分转化到 “活化子系”或用于转化宿主植物以产生“目标”系，其与“活化子系”通过常规培养方法杂 交。在每种情形中，结果是相同的。也就是说，所述启动子促进转录活化子蛋白的产生，然 后其结合靶点结合区域以促进需要的cDNA的表达。任何在植物中作用的启动子都可以用于第一成分，诸如组成型启动子，组织或器 官特异性启动子，或广泛表达的启动子，如先前所描述的那样。适当的转录活化子多肽包 括，但不限于，编码HAP和GAL4的那些。由所选择的转录活化子蛋白识别并且靶向的所述 结合序列用于第二成分。可以培养由上述方法产生的转化植物细胞，以再生拥有所转化的表型的植物。再 生技术可以取决于植物激素在组织培养生长培养基中的操纵，并且可以取决于与所述目的 多聚核苷酸一起引入的生物杀灭剂和/或除草剂标记。再生还可以从植物原生质体、胼胝 体、移植体、器官、花粉、胚、或其部分获得。
转化的细胞、胼胝体、组织或植物可以通过选择或筛选特殊特征或活性的工程植 物物质，例如，由标记基因或抗生素抗性基因编码的那些，而确定和分离。这样的筛选和选 择方法学是本领域的普通技术人员公知的。另外，可以应用物理和化学方法来鉴定转化子。 方法包括DNA分析和PCR扩增(例如，用于多聚核苷酸的检测)；用于检测和检验RNA转录 的RNA印迹，Sl Rnase保护，引物延伸，或RT-PCR扩增；用于检测多肽和多聚核苷酸的酶或 核酶活性的酶促检验；和蛋白质凝胶电泳，蛋白质印迹，免疫沉淀，和酶联免疫检测，以检测 多肽。其它技术，诸如原位杂交，酶染色，和免疫染色，也可以用来检测多肽和/或多聚核苷 酸的存在或表达。实行所有提及的技术的方法是公知的。当多聚核苷酸稳定地结合到转基 因植物中后，它可以通过有性杂交而被引入其它植物中，例如，通过标准的育种繁殖技术。上述多聚核苷酸可以用来转化许多植物和植物细胞系统，包括单子叶植物和双子 叶植物。多聚核苷酸和多肽将在农业和林业领域找到具体的应用。适当组的植物种类包括 双子叶植物，诸如红蓝花属，紫苜蓿，大豆属，咖啡属，油菜籽(高芥子酸和油菜)或向日葵 属。单子叶植物也适用，诸如玉蜀黍、小麦属、黑麦属、大麦属、燕麦属、稻属、黍、苋科、柳枝 稷或高梁属。蔬菜作物或根茎作物，诸如莴苣属、胡萝卜、葱属、花椰菜、豌豆属、甜玉米、爆 玉米花用玉米、番茄属、马铃薯、豆属(包括菜豆、利马豆、干豆(dry beans)、青豆)等，是 适用的，以及果实作物，诸如葡萄、草莓属、凤梨属、瓜属(例如，西瓜、甜瓜)、桃、梨属、苹果 属、樱属、桔、柠檬、葡萄柚、李属、芒果属、芭蕉属、和棕榈。因此，本文所描述的方法可以用于属于下列各目的双子叶植物=Magniolales,八 角目(Illiciales)，樟目(Laurales)，胡椒目(Piperales)，马兜铃目(Aristochiales)， 睡莲目(Nymphaeales)，毛莫目(Ranunculales)， Papeverales, Sarraceniaceae,昆 栏树目(Trochodendrales)，金缕梅目(Hamamelidales)，杜仲目(Eucom iales)， Leitneriales, 1 § (Myricales)，壳斗目(Fagales)，木麻黄目(Casuarinales)，石 竹目(Caryophyllales)，Batales,蓼目(Polygonales)，白花丹目(Plumbaginales)，五 桠果目(Dilleniales)，山茶目(Theales)，锦葵目(Malvales)，荨麻目(Urticales)，玉 蕊目(Lecythidales)，堇菜目(Violales)，杨柳目(Salicales)，Capparales,欧石南目 (Ericales)，岩梅目(Diapensales)，棉目(Ebenales)，报春花目(Primulales)，蔷蔽目 (Rosales), Fabales,川笞草目(Podostemales), Haloragales,桃金娘目(Myrtales),山莱 萸目(Cornales)，帕洛梯目(Proteales)，檀香目(Santales)，大花草目(RafTlesiales)， 卫矛目 (Celastrales)，大卓戈目 (Euphorbiales)， 鼠李目 (Rhamnales),无患子目 (Sapindales),古月桃目(Juglandales)牛儿苗目(Geraniales),远志目(Polygalales), Umbellales,龙胆目(Gentianales)，花葱目(Polemoniales)，唇形目(Lamiales)，车 前目(Plantaginales)，玄参目(Scrophulariales)，风铃草目(Campanulales)，菌草 目(Rubiales)，川续断目(Dipsacales)，和紫菀目(Asterales)。本文所描述的方法 还可以用于属于下列各目的单子叶植物Alismatales，水鳖目(Hydrocharitales)， 茨藻目(Najadales)，霉草目(Triuridales)，鸭跖草目(Commelinales)，谷精草目 (Eriocaulales)，帚灯草目(Restionales)，早熟禾目(Poales)，灯心草目(Juncales)， 莎草目(Cyperales)，香蒲目(Typhales)，凤梨目(Bromeliales)，Zingiberales，模榔目 (Arecales)，巴拿马草目(Cyclanthales)，露5 树目(Pandanales), Arales, Lilliales, 和兰目(Orchidales)，或者用于属于Gymnospermae的植物，例如，松目(Pinales)，银杏目(Ginkgoales)，苏铁目(Cycadales)和买麻藤目(Gnetales)。本发明对十分广泛范围的植物种类都有应用，包括来自下列各属的种属葱 属(Allium)，油丹属(Alseodaphne)，腰果属(Anacardium)，落花生属(Arachis)，天 Π # 属(Asparagus)，真页 M (Atropa) ,MMM (Avena), 3 M (Beilschmiedia)， ^ 苔属(Brassica)，柑桔属(Citrus)，西瓜属(Citrullus)，辣椒属(Capsicum)，长春花 属(Catharanthus),红蓝花属(Carthamus),木防己属(Cocculus),椰子属(Cocos),咖 啡属(Coffea), Croton,香瓜属(Cucumis)，南瓜属(Cucurbita), Daucus, Duguetia, 油棕属(Elaeis)，花菱草属(Eschscholzia)，榕属(Ficus)，草莓属(Fragaria)，海 罂粟属(Glaucium)，大豆属(Glycine),棉属(Gossypium)，向日葵属(Helianthus)， Heterocallis，Hevea，大麦属(Hordeum)，天仙子属(Hyoscyamus)，莴苣属(Lactuca)， 胶藤属(Landolphia)，亚麻属(Linum)，木姜子属(Litsea)，黑麦草属(Lolium)，羽扇 豆属(Lupinus)，番爺属(Lycopersicon),苹果属(Malus)，Manihot, Majorana,苜猜属 (Medicago)，芭蕉属(Musa)，烟草属(Nicotiana)，木犀榄属(Olea)，稻属(Oryza)，稷属 (Panicum)， Pannesetum, S^M (Papaver)，IBI5IIM (Parthenium)，0ΜΜ (Persea)， 菜豆属(Phaseolus)，松属(Pinus)，Pistachia,豌豆属(Pisum)，梨属(Pyrus)，李属 (Prunus)，萝卜属(Raphanus), Rhizocarya,蓖麻属(Ricinus)，黑麦属(Secale),千 里光属(Senecio),防己属(Sinomenium),白芥属(Sinapis),爺属(Solanum),高梁属 (Sorghum)，千金藤属(St印hania)，可可树属(Theobroma)，胡卢巴属(Trigonella)，小麦 属(Triticum)，野豌豆属(Vicia)，长春花属(Vinca)，葡萄属(Vitis)，豇豆属(Vigna)和 玉蜀黍属Gea)。用来实施本发明的种类的适宜组包括产生生物碱的植物，例如，来自下列 各项的植物罂粟科(Papaveraceae)，小檗科(Berberickceae)，樟科(Lauraceae)， 防己禾斗(Menispermaceae)，大卓戈禾斗(Euphorbiaceae)，豆禾斗(Leguminosae)，紫 草禾斗(Boraginaceae)，夹竹桃禾斗(Apocynaceae)，萝蘑禾斗(Asclepiadaceae)，百 合科(Liliaceae)，买麻藤科(Gnetaceae)，古柯科(Erythroxylaceae)，旋花科 (Convolvulaceae),毛莫禾斗(Ranunculaeceae),菌草禾斗(Rubiaceae),爺禾斗(Solanaceae)， 和芸香科(Rntaceae)家族。罂粟科家族，例如，该家族含有大约250种主要在世界的 北温带发现物种，并且包括下列植物，诸如花菱草(Californiapoppy)和罂粟(Opium poppy)。罂粟科家族内可用的属包括罂粟属(Papaver)(例如，Papaver bracteatum， ^ S 1 (Papaver orientale), Papaversetigerum,禾口 § 1 (Papaver somniferum)), Sanguinaria，Dendromecon，海磐粟属(Glaucium)，绿绒蒿属(Meconopsis)，白屈菜 属(Chelidonium)，Eschscholzioideae (例如，花菱草属(Eschscholzia)，花菱草 (Eschscholziacalifornia))，禾口 粟属(Argemone)(例如，Argemone hispida, (Argeinone mexicma)，和Argemone munita)类属。用来实施本发明的其它产生生物碱的 禾中类包括 Croton salutaris，Croton balsamifera，防己(Sinomenium acutum)，台湾千金 ^ (Stephania cepharantha), Stephania zippeliana, Litsease biferea, Alseodaphne perakensis, t章 O十 7^ 防己(Cocculus laurifolius), Duguetia obovata, Rhizocarya racemifera，禾口 Beilschmiedia oreophila。用来实施本发明的种类的另一适宜的组包括产生类萜的植物，例如，来自下列属的植物七叶树属(Aesculus)，Anamirta，穿心莲属(Andrographis)，蒿属(Artemisia), 桦木属(Betula)，红木属(Bixa)，大麻属(Cannabis)，积雪草属(Centella)，茼蒿属 (Chrysanthemum),艾菊属(Tanacetum),樟属(Cinnamomum),柑桔属(Citrullus),丝瓜属 (Luffa)，Ifii^花属(Coleus)，姜HiS (Curcuma)，香茅属(Cymbopogan)，(Daphne)， 大卓戈属(Euphorbia)，大豆属(Glycine)，甘草属(Glycyrrhiza),棉属(Gossypium), Guayule, Hevea,香茶菜属(Isodon),香茶菜属(Rabdosia),香茶菜属(Rabdosia),薄荷 属(Mentha)，鼠尾草属(Salvia)，迷迭香属(Rosmarinus)，苦木属(Simarouba)，红豆杉属 (Taxus)，百里香(Thymus)，和雷公藤属(Tripterygium)。其它适宜的种类包括番茄(Lycopersicum esculentum)，烟草属(Nicotiana spp.)(例如，烟草(Nicotiana tabacum)),辣椒属(Capsicumspp.)(包括辣椒 (C. annuum)),灰白银胶菊(Parthenium argentatum Gray),留兰香(Mentha spicata), 唇萼薄荷(M. pulegium)，辣薄荷(M. piperita)，麝香草(Thymus vulgaris L.)， 牛至(Origanum vulgare),迷迭香(Rosmarinus officinalis),香蜂花(Melissa officinalis), bJ bJM (Theobroma cacao), ^^JfL (Lavandula augustifolia), M MjM 草(Salviaofficinalis),小果咖啡(Coffea arabica), Hevea benthamiana,秘、鲁橡胶 树(Hevea guianensus)，檢胶树(Hevea brasiliensis)，木薯胶(Manihot glaziovii), Manihot dichotoma,Castilla elastica,印度格(Ficus elastica),Funtimia elastica, Landolphia kirkii, Landolphia gentilli, Landolphiaheudelotii, Landolphia owariensis, ^ Bf (Crytostegia grandiflora)，Crytostegia niadagascariansis, Taraxacum megalorhiζon, 1 7^ (Palaquim gutta), Manilkara bidentata，禾口 ManilkarB zapatB。在某些情形中，转基因植物不是拟南芥或烟草植物。在一些情形中，转基因植物不 是茄科(Solanaceae)家族或十字花科(Brassicaceae)家族的成员。例如，在下述情形中， 转基因植物可以不是拟南芥或烟草植物，即，当它包括至少一种外源多聚核苷酸时，其中所 述至少一种外源多聚核苷酸包括编码这样的多肽的核酸(a)与SEQ ID NO 2列出的氨基酸序列有约85%或更多的序列同源性；或(b)与图2列出的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应。转基因植物可以表现出上述多肽的任意生化活性。例如，转基因植物可以表现出 拟南芥DWF4的至少一种生化活性，例如，22 α-羟化酶活性。用来评估生化活性的方法是为 本领域的普通技术人员所知的；参见，例如，上文。转基因植物可以用来产生具有改变的植物表型的植物(例如，与对照植物相比 较)。当在植物中表达时，例如，在适当的时间或在适当的组织中，多肽可以影响植物(例 如，转基因植物)的表型。表型效果典型地相对于不表达目的外源多聚核苷酸的对照植物， 诸如相对应的野生植物，没有转基因目的外源多聚核苷酸但是有同所述目的转基因植物是 同基因的相应植物，或者其中所述多肽的表达受到抑制、或没有诱导(即，当表达是在可诱 导的启动子控制下时)的相应的同基因植物，而进行评估。当植物表现出低于10% (例如， 低于 9%，8%，7%，6%，5%，4%，3%，2%，1%，0· 5%,0. 1%,0. 01%,0. 001% )量的由目 的植物所表现出的多肽或编码所述多肽的mRNA时，认为植物“没有表达”多肽。表达可以通 过本领域普通技术人员已知的方法进行评估，例如，RT-PCR扩增，RNA印迹，SlRNAse保护，引物延伸，蛋白质印迹；蛋白质凝胶电泳，免疫沉淀，酶联免疫检测，芯片检测，和质谱。应该 注意到，如果多肽在组织特意性或广泛表达启动子的控制下表达，表达可以在整个植物或 有选择地在需要的组织中进行评估。类似地，如果多肽在特定的时间表达，例如，在发育的 特定时间或诱导时，表达可以选择性地在需要的时期进行评估。表型效果可以是相对于对照植物改变的新陈代谢模式。例如，转基因植物可以表 现出增加水平的一种或多种下述代谢物蔗糖，谷氨酸盐/酯(谷氨酸)，或亚油酸。在某些 情形中，当本文所描述的多肽在转基因植物中表达时，所述转基因植物可以表现出比没有 表达所述多肽的植物从10%到约30%更多(例如，约12到约30% ；约15到约25%，约18 到约25%，或约10到约20%更多)的蔗糖浓度(例如，在叶片组织中)。在一些情形中， 当本文所描述的多肽在转基因植物中表达时，所述转基因植物可以表现出比没有表达所述 多肽的植物从约10%到约65%更多(例如，约10到约30% ；约20到约45% ；约30到约 60% ；约40到约65% ；约30到约55% ；约20到约30%更多)的谷氨酸浓度(例如，在叶 片组织中)。在其它情形中，当本文所描述的多肽在转基因植物中表达时，所述转基因植物 可以表现出比没有表达所述多肽的植物从约10%到约50%更多(例如，约15%到约35%; 约20%到约45%;约30%到约48%;约15%到约35%更多)的亚油酸浓度(例如，在叶片 组织中)。在某些情形中，相对于对照植物，转基因植物可以不表现出某些其它氨基酸，碳水 化合物，脂肪酸和有机酸水平的增加，例如，表3中显示的某些化合物。相对于对照植物，表型效果可以是增强的光合作用率。用来测定给出的植物种类 的光合作用率的方法是为本领域的普通技术人员已知的。例如，相对于对照植物，转基因植 物可以在特定的温度，光强度(例如，光合作用光子通量强度(PPFD))，湿度，或二氧化碳浓 度下表现出增强的光合作用率。评估光合作用率的温度可以从约5°C到约45°C，或之间的 任何值(例如，约10°C，约20°C，约25 V，约30°C，或约32°C )。湿度值可以从约5 %到约 80%范围，或之间的任何值(例如，约10%，约20%，约30%，约40%，约50%，约55%，约 60%，或约70%)。光强度(PPFD)可以从约Omol πΓ、—1到约4000mol πι 或之间的任何 值(例如，25，50，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400， 1500，1600，1700，1800，1900，2000，2200，2500，2750，2900，3000，3200，3400，3600，3800，或 3900mol πΓΥ1)。二氧化碳浓度可以在从约25ppm到约IOOOppm的范围，或之间的任何值 (例如，约 50，约 75，约 100，约 200，约 300，约 360，约 380，约 400，约 500，约 600，约 700，约 760，aboirt800，约900，或约950ppm)。可以应用温度，光强度，湿度，和二氧化碳浓度的任何 组合。例如，在一些情形中，在360ppm 二氧化碳浓度，约50-55%湿度水平，约25°C温度，约 1000到约2000mol JiT2iT1的PPFDs范围，转基因植物相对于对照植物表现出增强的光合作 用率。表型效果可以是在BL途径的化学中间体水平的增加或减少。例如，表型效果可以 是相对于对照植物的6-脱氧油菜素留酮水平的增加。表型效果可以是相对于对照植物的 菜油甾醇水平的减少。测定化学中间体的分析方法，包括BL途径的中间体，诸如菜油甾醇 和6-脱氧油菜素留酮，是本领域已知的，并且也在本文描述。增加或减少可以是相对于对 照植物的任何量，例如，相对于对照植物多于1. 2倍，1. 5倍，1. 8倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6 倍，8倍，10倍，50倍，或100倍的增加或减少。在某些情形中，相对于对照植物，6-脱氧油 菜素留酮的增加可以高于2倍，或高于3倍，或高于4倍，或高于5倍，或高于6倍。
相对于对照植物，转基因植物还可以表现出增加的生长潜力，增加的大小(例如， 高度)，增加的种子产量，更加均一的种子充实度(例如，在单子叶植物中，诸如稻属)，更快 的生长速率，或增强的耐干旱性。例如，当本文所描述的多肽在转基因植物中表达时，所述 转基因植物可以表现出比没有表达所述多肽的植物从约7%到约20%更高(例如，约10% 到约15% ；约12%到约18% ；约8%到约18% ；约15%到约20%更高)的高度。在其它 情形中，当本文所描述的多肽在转基因植物中表达时，所述转基因植物可以表现出比没有 表达所述多肽的植物从约10%到约95%更高(例如，从约10%到约20% ；从约10%到约 50% ；从约10%到约70% ；从约20%到约60% ；从约20%到约75% ；从约25%到约85% ； 从约30%到约70% ；从约35%到约90% ；从约40%到约60% ；从约40%到约85% ；从约 50%到约80% ；从约50%到约90% ；从约70%到约90%更高)的种子产量(每株植物的 种子数目)。在某些情形中，当本文所描述的多肽在转基因植物中表达时，所述转基因植物 可以表现出比没有表达所述多肽的植物从约5%到约20%更高(例如，从约5%到约10%; 从约8%到约12%;从约10%到约15%;从约8%到约18%更高)的每株植物的种子重量。应该注意到，表型效果典型地通过一种或多种实验分析统计学显著性而进行评 估。应该理解，当比较表型以评估多肽的作用时，用适当的参量或非参量统计如，Chi-方检 验，斯氏t-检验，Marm-Whitney检验，或F-检验，在ρ彡0. 05时认为多肽的差异是统计学 显著性的。其它表型效果可以通过本领域普通技术人员已知的方法进行评估，包括在发育的 特定时间细胞长度测定；BL应用的测定；固醇检测检验；反应产物或副产物的检测；对于给 出的酶促步骤底物和/或产物的水平的检测；和对于推定的酶促底物的剂量应答检测。方法本文所描述的多聚核苷酸和多肽可以用来产生具有改变的表型，例如，改变的表 型特征的植物。因此，提供了用于改变一种或多种表型特征的方法。表型特征可以是相对 于对照植物的下列各项的一种或多种改变的新陈代谢模式；改变的光合作用率；增加水 平的6-脱氧油菜素留酮；减少水平的菜油留醇；增加的种子产量；增加的每株植物的种子 重量；和增加的高度。本文所描述的方法典型地可以包括a)为了产生转化的植物细胞，向 植物细胞引入包括编码下列各项的核酸分子的分离的多聚核苷酸1)具有同SEQ ID NO 2 列出的氨基酸序列约85%或更多的序列同源性的多肽，或2)包括与图2列出的共有序列 (SEQ ID NO 4)相对应的氨基酸序列的多肽；(b)从所述转化的植物细胞产生转基因植物。 可以应用任何方法，包括本文所描述的那些，评估由此获得的植物的改变的表型特征。在某 些情形中，多于一种表型特征可以被改变，例如，6-脱氧油菜素留酮水平的增加和菜油甾醇 的减少。 改变的DWF4多肽表达水平过量表达如先前所描述，可以将本文所描述的多聚核苷酸，重组载体，宿主细胞，和转基因 植物加工成为产生目的多肽的过量表达。多肽的过量表达可以用来改变植物相对于对照植 物，例如，不表达所述多肽的对照植物的表型特征，诸如增加植物高度，改变新陈代谢模式， 增加6-脱氧油菜素留酮的水平，减少菜油留醇的水平，增加光合作用率，提高种子产量，等 等。另外，多肽可以与另一种多肽的过量表达组合过量表达，例如，另一种参与BL生物合成途径的P45tl多肽，诸如CPD。多肽的这样的共同表达可以对植物的生化活性(例如，酶促活 性)或表型(例如，高度)产生附加的或协同的作用。还可以应用融合多肽，并且典型地包 括本文所描述的在阅读框中与另一种多肽，诸如参与BL生物合成的多肽(例如，CPD)融合 的多肽。表达的抑制备选地，本文所描述的多聚核苷酸和重组载体可以用来阻抑或抑制内源&5(|蛋白， 诸如DWF4，在目的植物种类中的表达。有许多方法可以用来抑制基因在植物中的表达。反 义技术是一种公知的方法。在这种方法中，将内源基因的核酸片段克隆并且有效地连接到 启动子上，以便RNA的反义链得到转录。然后，将重组载体转化稻植物中，如上文所述那样， 并且产生RNA的反义链。所述核酸片段不必是要被抑制的内源基因的完整序列，但是典型 地基本上与要被抑制的内源基因的至少一部分相同。一般地，更高的同源性可以用来补偿 更短序列的应用。典型地，应用至少30个核苷酸的序列(例如，至少40，50，80，100，200， 500个核苷酸或更多)。催化性RNA分子或核酶也可以用来抑制表达。可以将核酶设计成基本上与任何靶 RNA特异性配对，并且在特殊位置裂解磷酸二酯骨架，由此功能性地使所述靶点RNA失活。 在核酶中包括核酶序列赋予它们RNA裂解活性，由此增加它们的抑制活性。设计和应用靶 点RNA特异性核酶的方法是本领域的技术人员已知的。皿，一般地，WO 02/46449和其所 引用的参考文献。还可以应用基于RNA干扰(RNAi)的方法。RNA干扰是一种调控基因表达和病毒 复制的细胞机制。这一机制由双链小干扰RNA分子(siRNA)介导。细胞通过破坏含有与 siRNA相同的序列的所有内在mRNA而应答引入所述细胞的外来双链RNA (例如，siRNA)。据信RNAi包括起始和效应器步骤。在起始步骤，输入的dsRNA被消化成21_23个 核苷酸的小干扰RNAs (siRNAs)，其还被叫作“指导RNAs”。当酶Dicer，dsRNA特异性核糖核 酸酶RNase III家族的一个成员，以ATP依赖型渐进的方式渐进地裂解dsRNA(例如，直接引 入或通过转基因或病毒)时，产生所述siRNAs。连续的裂解事件将RNA降解成为19_21bp 的双链体(siRNAs)，每个具有2-核苷酸3'突出端。在效应器步骤，所述siRNA双链体结 合核酸酶复合物以形成RNA-诱导的沉默复合物，或RISC。SiRNA双链体的ATP依赖型展开 是激活RISC所必需的。活性RISC通过碱基配对相互作用靶向同源转录物，并且从siRNA 的3 ’末端将mRNA裂解掉大约12个核苷酸。设计和制备靶向目标mRNA的siRNAs的方法是本领域的技术人员已知的，例 如，WO 99/3沈19和WO 01/75164。一种设计方法中，从目标转录物AUG起始密码子开始进 行AA 二核苷酸序列扫描。将每种AA序列和3'临近的19个核苷酸记录为潜在的siRNA靶 点位点。然后可以选择2种或4种序列，部分基于下述标准1)具有30-50% GC含量的siRNAs比那些具有更高的G/C含量的siRNAs更加有 活性；2)由于4-6个核苷酸多⑴作用为RNA pol III的终止信号，所以当设计要从RNA pol III启动子表达的序列时，在目标序列中多于4个T' s或A' s的片段应该避免；3)由于mRNA的一些区域可以由调控蛋白高度构成或结合，它可以有效用于在沿 着所述基因全长的不同位置选择siRNA靶点位点；并且比较潜在的靶点位点和适当的基因组数据库(人，小鼠，大鼠， 等)，并且排除考虑同其它非目的编码序列具有多于16-17个相邻碱基对的同源性的任何 靶点序列。在一些实施方案中，干扰RNA构建体包括转录成具有茎-环结构的双链RNA的序 列。双链RNA茎部分的一条链包括同目的多肽的有义编码序列相似或相同的序列，并且在 长度上那是从约10个核苷酸到约2，500个核苷酸。同有义编码序列相似或相同的序列的 长度可以从10个核苷酸到500个核苷酸，从15个核苷酸或300个核苷酸，从20个核苷酸 到100个核苷酸，或从25个核苷酸到100个核苷酸。双链RNA茎部分的另一条链包括目的 多肽的反义序列，并且可以具有比所述有义序列对应的长度更短，相同，或更长的长度。双 链RNA的环部分可以从10个核苷酸到5，000个核苷酸，例如，从15个核苷酸到1，000个核 苷酸，从20个核苷酸到500个核苷酸，或从25个核苷酸到200个核苷酸。RNA的环部分可 以包括内含子。例如，WO 99/53050。然后，可以应用化学合成，体外转录，SiRNA表达载体，和PCR表达盒来制备所设计 的 siRNA。制品本发明还提供制品。制品可以包括本文所描述的转基因植物，例如，在容器、袋子、 罐或培养器皿中的转基因植物。制品可以包括本文所描述的转基因植物的一颗或多颗种 子。典型地，基本上均一的种子混合物被通过本领域已知的方式调理并且装入包装材料，以 形成制品。这样的一袋种子优选地具有伴随袋子的包装标签，例如，系在包装材料上的标记 或标签，打印在包装材料上的标签，或插在袋内的标签。包装标签可以指明从所述种子长成 的植物适于生产指定的预先选择的多肽。包装标签还可以指明其中所含的种子结合可以提 供所需要的表型特征，如上文所讨论的那些的转基因。
实施例实施例l_p326:DWF4在水稻中表达对植物生长和发育的分析将Ti质粒，其含有指定的上游并且有效地连接到Hapl编码序列的启动子和 有效地连接到绿色荧光蛋白(GFP)编码序列的UASHapl (Hapl上游激活序列)，通过应用农 杆菌和能转化的胼胝体引入到水稻育种Kitaake中。Hapl编码序列的表达导致Hapl蛋白 和GFP的累积。GFP可检测到的表达被限制在水稻植物的茎和叶片中，在根组织中观察到更 少的表达。在根分裂组织、花或萌芽前的种子中没有检测到表达。将从这一转化事件衍生 的株系称为CRS-BIN1A 7。还向Kitaake中引入Ti质粒，其含有5个拷贝的UASllapl上游并且有效地连接到 拟南芥22-α羟化酶(DWF4)的基因组编码序列上。所述gDNA来自生态型WS。UAS的活化 (通过Hapl)导致DWF4 gDNA的转录和DWF4转录物的累积。将衍生于独立的转基因株系17和36并且称为17-3，36-5，和36-6的T2UAS:DWF4 株系用CRS-BIN1A 7植物授粉，以产生Fl代种子。将17_3，36_5，和36_6后代的3组Fl 代植物分别称为R150，R149和R147。通过荧光检测Fl代植物Hapl :GFP的存在，并且通过 PCR检测UAS: DWF4的存在。DWF4 gDNA转录物的存在通过RT-PCR证实。将称为R150P5， R150P7，R149P2和R149P5的Fl代植物的F2代种子发芽，并且与阴性对照在5个罐中并排生长，如表1中所示。 表 1.
权利要求
1.一种分离的多聚核苷酸，其包括编码具有下述的多肽的核酸分子(a)与SEQ ID NO :2列出的氨基酸序列有约85%或更多的序列同源性。
2.一种分离的多聚核苷酸，其包括编码与在图2中列出的共有序列(SEQID NO 4)相 对应的氨基酸序列的多肽的核酸分子，条件是所编码的多肽没有表现出同SEQ ID N0:1或 SEQ ID NO :3列出的氨基酸序列有93%或更多的序列同源性。
3.一种分离的多聚核苷酸，其包括编码与在图2中列出的共有序列(SEQID N0:4)相 对应的氨基酸序列的多肽的核酸分子，其中所述多聚核苷酸还包括有效连接到编码所述多 肽的所述核酸上的广泛表达型启动子控制元件。
4.权利要求1或2的分离的多聚核苷酸，其中所述多肽有效地催化菜油留醇在C-22氧 化以形成6-脱氧油菜素甾酮。
5.权利要求1的分离的多聚核苷酸，其中所述多肽包括SEQID NO :2。
6.权利要求1的分离的多聚核苷酸，其中所述多肽具有SEQID NO :2列出的序列。
7.权利要求1或2的分离的多聚核苷酸，其中所述多肽还包括有效连接到编码所述多 肽的所述核酸上的控制元件。
8.权利要求7的分离的多聚核苷酸，其中所述控制元件是广泛表达型启动子或组成型 启动子。
9.权利要求8的分离的多聚核苷酸，其中所述广泛表达型启动子是选自由p326， YPO158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144 和 YP0190 组成的组。
10.权利要求9的分离的多聚核苷酸，其中所述广泛表达型启动子是
11.权利要求8的分离的多聚核苷酸，其中所述组成型启动子是35S。
12.—种重组载体，其包括⑴权利要求1或权利要求2的多聚核苷酸；和(ii)有效 连接到所述多聚核苷酸上的控制元件。
13.—种重组载体，其包括权利要求3的多聚核苷酸。
14.一种宿主细胞，其包括权利要求12的重组载体。
15.一种宿主细胞，其包括权利要求13的重组载体。
16.一种转基因植物，其包括至少一种外源多聚核苷酸，所述至少一种外源多聚核苷酸 包括编码下列多肽的核酸(a)与SEQID NO :2列出的氨基酸序列有约85%或更多序列同源性；或者(b)与图2列出的共有序列(SEQID NO 4)相对应，条件是所编码的多肽没有展现出 同SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3列出的氨基酸序列有93%或更多的序列同源性。
17.权利要求16的转基因植物，其中所述多肽包括SEQID NO :2列出的氨基酸序列。
18.权利要求16的转基因植物，其中所述多肽具有SEQID NO :2中列出的序列。
19.权利要求16的转基因植物，其中所述外源多聚核苷酸还包括有效连接到编码所述 多肽的所述核酸上的控制元件。
20.权利要求18的转基因植物，其中所述控制元件是广泛表达型启动子或组成型启动子。
21.权利要求20的转基因植物，其中所述广泛表达行启动子是选自由下列各项组成的 组p326，YPO158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144 和 YP0190。
22.权利要求21的转基因植物，其中所述广泛表达型启动子是
23.权利要求21的转基因植物，其中所述启动子引起所述多肽在枝条和茎尖的表达。
24.权利要求20的转基因植物，其中所述转基因植物相对于对照植物展现出改变的表型。
25.权利要求M的转基因植物，其中所述改变的表型是选自由下列各项组成的组的一 种或多种相对于所述对照植物，改变的新陈代谢模式，6-脱氧油菜素留酮水平的增加，菜 油甾醇水平的减少，光合作用率的增加，增加的种子产量，增加的每株植物种子重量，和增 加的高度。
26.权利要求25的转基因植物，其中所述改变的新陈代谢模式是相对于对照植物增加 水平的蔗糖、谷氨酸盐/酯、或亚油酸。
27.权利要求16的转基因植物，其中所述转基因植物是白菜植物(Brassicaplant)。
28.权利要求16的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
29.权利要求观的转基因植物，其中所述转单子叶植物是稻属、小麦属、柳枝稷、黑麦 属、大麦属、高梁属、或玉蜀黍属。
30.权利要求16的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。
31.权利要求16的转基因植物，其中所述多肽有效地催化菜油留醇在C-22氧化以形成 6-脱氧油菜素甾酮。
32.—种转基因植物，条件是所述植物不是拟南芥或烟草植物，其包括至少一种外源多 聚核苷酸，所述至少一种外源多聚核苷酸包括编码下列多肽的核酸(a)与SEQID NO 2列出的氨基酸序列有约85%或更多序列同源性；或者(b)与图2列出的共有序列(SEQID NO 4)相对应。
33.权利要求32的转基因植物，其中所述多肽包括SEQID NO :2列出的氨基酸序列。
34.权利要求32的转基因植物，其中所述多肽具有SEQID NO :2列出的序列。
35.权利要求32的转基因植物，其中所述外源多聚核苷酸还包括有效连接到编码所述 多肽的所述核酸上的控制元件。
36.权利要求35的转基因植物，其中所述控制元件是广泛表达型启动子或组成型启动子。
37.权利要求36的转基因植物，其中所述广泛表达型启动子是选自由下列各项组成的 组p326，YPO158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144 和 YP0190。
38.权利要求37的转基因植物，其中所述广泛表达型启动子是
39.权利要求36的转基因植物，其中所述启动子引起所述多肽在枝条和茎尖的表达。
40.权利要求35的转基因植物，其中所述转基因植物相对于对照植物展现出改变的表型。
41.权利要求40的转基因植物，其中所述改变的表型是选自由下列各项组成的组的一 种或多种相对于所述对照植物，改变的新陈代谢模式，6-脱氧油菜素留酮水平的增加，菜 油甾醇水平的减少，增加的光合作用率，增加的种子产量，增加的每株植物种子重量，和增 加的高度。
42.权利要求41的转基因植物，其中所述改变的新陈代谢模式是相对于所述对照植物增加水平的蔗糖、谷氨酸盐/酯、或亚油酸。
43.权利要求32的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
44.权利要求43的转基因植物，其中所述单子叶植物是是稻属、小麦属、柳枝稷、黑麦 属、大麦属、高梁属、或玉蜀黍属。
45.权利要求32的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。
46.权利要求32的转基因植物，其中所述多肽有效地催化菜油留醇在C-22的氧化，以 形成6-脱氧油菜素甾酮。
47.一种包括至少一种外源多聚核苷酸的转基因植物，所述至少一种外源多聚核苷酸 包括编码下列多肽的核酸(a)与SEQID NO 2列出的氨基酸序列有约85%或更多序列同源性；或者(b)与图2列出的共有序列(SEQID NO :4)相对应，其中所述转基因植物相对于对照 植物展现出6-脱氧油菜素留酮水平的增加。
48.权利要求47的转基因植物，其中所述多肽包括SEQID NO :2列出的氨基酸序列。
49.权利要求47的转基因植物，其中所述多肽具有SEQID NO :2列出的序列。
50.权利要求47的转基因植物，其中所述外源多聚核苷酸还包括有效连接到编码所述 多肽的所述核酸上的控制元件。
51.权利要求50的转基因植物，其中所述控制元件是广泛表达型启动子或组成型启动子。
52.权利要求51的转基因植物，其中所述广泛表达型启动子选自由下列各项组成的 组p326，YPO158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144 和 YP0190。
53.权利要求52的转基因植物，其中所述广泛表达型启动子是
54.权利要求53的转基因植物，其中所述启动子引起所述多肽在枝条和茎尖的表达。
55.权利要求47的转基因植物，其中所述转基因植物还相对于对照植物展现出选自由 下列各项组成的组的一种或多种改变的表型相对于对照植物，改变的新陈代谢模式，菜油 甾醇水平的减少，增加的光合作用率，增加的种子产量，增加的每株植物种子重量，和增加 的高度。
56.权利要求55的转基因植物，其中所述改变的新陈代谢模式是相对于所述对照植物 增加水平的蔗糖、谷氨酸盐/酯、或亚油酸。
57.权利要求47的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
58.权利要求57的转基因植物，其中所述单子叶植物是是稻属、小麦属、柳枝稷、黑麦 属、大麦属、高梁属、或玉蜀黍属。
59.权利要求47的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。
60.权利要求47的转基因植物，其中所述多肽有效地催化菜油留醇在C-22氧化以形成 6-脱氧油菜素甾酮。
61.一种包括至少一种外源多聚核苷酸的转基因植物，所述至少一种外源多聚核苷酸 包括编码下列多肽的核酸(a)与SEQID NO 2列出的氨基酸序列有约85%或更多序列同源性；或者(b)与图2列出的共有序列(SEQID NO :4)相对应，其中所述转基因植物相对于对照植物展现出菜油留醇水平的减少。
62.权利要求61的转基因植物，其中所述多肽包括SEQID NO :2列出的氨基酸序列。
63.权利要求61的转基因植物，其中所述多肽具有SEQID NO :2列出的序列。
64.权利要求61的转基因植物，其中所述外源多聚核苷酸还包括有效连接到编码所述 多肽的所述核酸上的控制元件。
65.权利要求64的转基因植物，其中所述控制元件是广泛表达型启动子或组成型启动子。
66.权利要求65的转基因植物，其中所述广泛表达型启动子选自由下列各项组成的 组p326，YPO158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144 和 YP0190。
67.权利要求66的转基因植物，其中所述广泛表达型启动子是
68.权利要求67的转基因植物，其中所述启动子引起所述多肽在枝条和茎尖的表达。
69.权利要求61的转基因植物，其中所述转基因植物还相对于对照植物展现出选自 由下列各项组成的组的一种或多种改变的表型相对于对照植物，改变的新陈代谢模式， 6-脱氧油菜素留酮水平的增加，增加的光合作用率，增加的种子产量，增加的每株植物种子 重量，和增加的高度。
70.权利要求69的转基因植物，其中所述改变的新陈代谢模式是相对于所述对照植物 增加水平的蔗糖、谷氨酸盐/酯、或亚油酸。
71.权利要求61的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
72.权利要求71的转基因植物，其中所述单子叶植物是是稻属、小麦属、柳枝稷、黑麦 属、大麦属、高梁属、或玉蜀黍属。
73.权利要求61的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。
74.权利要求61的转基因植物，其中所述多肽有效地催化菜油留醇在C-22氧化以形成 6-脱氧油菜素甾酮。
75.—种包括至少一种外源多聚核苷酸的转基因植物，所述至少一种外源多聚核苷酸 包括编码下列多肽的核酸(a)与SEQID NO :2列出的氨基酸序列有约85%或更多序列同源性；或者(b)与图2列出的共有序列(SEQID NO 4)相对应，其中所述外源多肽还包括有效连 接到编码所述多肽的所述核酸上的广泛表达型控制元件。
76.权利要求75的转基因植物，其中所述多肽包括SEQID NO :2列出的氨基酸序列。
77.权利要求75的转基因植物，其中所述多肽具有SEQID NO :2列出的序列。
78.权利要求75的转基因植物，其中所述广泛表达型启动子选自由下列各项组成的 组p326，YPO158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144 和 YP0190。
79.权利要求78的转基因植物，其中所述广泛表达型启动子是
80.权利要求79的转基因植物，其中所述启动子引起所述多肽在枝条和茎尖的表达。
81.权利要求75的转基因植物，其中所述转基因植物还相对于对照植物展现出选自由 下列各项组成的组的一种或多种改变的表型相对于对照植物，改变的新陈代谢模式，菜油 甾醇水平的减少，6-脱氧油菜素留酮水平的增加，增加的光合作用率，增加的种子产量，增加的每株植物种子重量，和增加的高度。
82.权利要求81的转基因植物，其中所述改变的新陈代谢模式是相对于所述对照植物 增加水平的蔗糖、谷氨酸盐/酯、或亚油酸。
83.权利要求75的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
84.权利要求83的转基因植物，其中所述单子叶植物是是稻属、小麦属、柳枝稷、黑麦 属、大麦属、高梁属、或玉蜀黍属。
85.权利要求75的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。
86.权利要求75的转基因植物，其中所述多肽有效地催化菜油留醇在C-22氧化以形成 6-脱氧油菜素甾酮。
87.—种包括至少一种外源多聚核苷酸的转基因植物，所述至少一种外源多聚核苷酸 包括编码下列多肽的核酸(a)与SEQID NO 2列出的氨基酸序列有约85%或更多序列同源性；或者(b)与图2列出的共有序列(SEQID NO :4)相对应，其中所述转基因植物相对于对照 植物展现出增加的光合作用率。
88.权利要求87的转基因植物，其中所述多肽包括SEQID NO :2列出的氨基酸序列。
89.权利要求87的转基因植物，其中所述多肽具有SEQID NO :2列出的序列。
90.权利要求87的转基因植物，其中所述外源多聚核苷酸还包括有效连接到编码所述 多肽的所述核酸上的控制元件。
91.权利要求90的转基因植物，其中所述控制元件是广泛表达型启动子或组成型启动子。
92.权利要求91的转基因植物，其中所述广泛表达型启动子选自由下列各项组成的 组p326，YPO158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YPO144 和 YP0190。
93.权利要求92的转基因植物，其中所述广泛表达型启动子是
94.权利要求93的转基因植物，其中所述启动子引起所述多肽在枝条和茎尖的表达。
95.权利要求87的转基因植物，其中所述转基因植物还相对于对照植物展现出选自由 下列各项组成的组的一种或多种改变的表型相对于对照植物，改变的新陈代谢模式，菜油 甾醇水平的减少，6-脱氧油菜素留酮水平的增加，增加的种子产量，增加的每株植物种子重 量，和增加的高度。
96.权利要求95的转基因植物，其中所述改变的新陈代谢模式是相对于所述对照植物 增加水平的蔗糖、谷氨酸盐/酯、或亚油酸。
97.权利要求87的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
98.权利要求97的转基因植物，其中所述单子叶植物是是稻属、小麦属、柳枝稷、黑麦 属、大麦属、高梁属、或玉蜀黍属。
99.权利要求87的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。
100.权利要求87的转基因植物，其中所述多肽有效地催化菜油留醇在C-22氧化以形 成6-脱氧油菜素甾酮。
101.一种用于生产转基因植物的方法，其包括(a)将权利要求1，权利要求2，或权利要求3的多聚核苷酸引入植物细胞，以产生转化的植物细胞；和(b)从所述转化的植物细胞生产转基因植物。
102.按照权利要求16，32，47，61，75，或87的转基因植物的种子。
103.一种分离的多肽(a)具有与SEQID NO 2列出的氨基酸序列约85%或更多序列同源性；或者(b)与图2列出的共有序列(SEQID NO 4)相对应，条件是所编码的多肽不展现出同 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3列出的氨基酸序列有93%或更多的序列同源性。
104.一种用于在植物中增加选自由蔗糖、谷氨酸盐/酯、和亚油酸组成的组的一种或 多种代谢物的水平的方法，所述方法包括(a)将权利要求1，权利要求2，或权利要求3的多聚核苷酸引入植物细胞，以产生转化 的植物细胞；和(b)从所述转化的植物细胞生产转基因植物，其中所述转基因植物展现出增加的水平 的所述一种或多种代谢物。
105.一种用于在植物中增加选自由蔗糖、谷氨酸盐/酯、和亚油酸组成的组的一种或 多种代谢物的水平的方法，所述方法包括(a)为了产生转化的植物细胞，向植物细胞中引入包括编码下列多肽的核酸的分离的 多聚核苷酸1)与SEQ ID NO :2列出的氨基酸序列有约85%或更多序列同源性的多肽，或 2)包括与图2列出的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的氨基酸序列的多肽；和(b)从所述转化的植物细胞生产转基因植物，其中所述转基因植物展现出增加的水平 的所述一种或多种代谢物。
106.一种用于增加植物中6-脱氧油菜素留酮水平的方法，所述方法包括(a)将权利要求1，权利要求2，或权利要求3的多聚核苷酸引入植物细胞，以产生转化 的植物细胞；和(b)从所述转化的植物细胞生产转基因植物，其中所述转基因植物展现出增加的水平 的6-脱氧油菜素甾酮。
107.一种用于增加植物中6-脱氧油菜素留酮水平的方法，所述方法包括(a)为了产生转化的植物细胞，向植物细胞中引入包括编码下列多肽的核酸的分离的 多聚核苷酸1)与SEQ ID NO :2列出的氨基酸序列有约85%或更多序列同源性的多肽，或 2)包括与图2列出的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的氨基酸序列的多肽；和(b)从所述转化的植物细胞生产转基因植物，其中所述转基因植物展现出增加的水平 的6-脱氧油菜素甾酮。
108.一种用于减少植物中菜油留醇水平的方法，所述方法包括(a)将权利要求1，权利要求2，或权利要求3的多聚核苷酸引入植物细胞，以产生转化 的植物细胞；和(b)从所述转化的植物细胞生产转基因植物，其中所述转基因植物展现出减少的水平 的菜油甾醇。
109.一种用于减少植物中菜油留醇水平的方法，所述方法包括(a)为了产生转化的植物细胞，向植物细胞中引入包括编码下列多肽的核酸的分离的 多聚核苷酸1)与SEQ ID NO :2列出的氨基酸序列有约85%或更多序列同源性的多肽，或2)包括与图2列出的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的氨基酸序列的多肽；和(b)从所述转化的植物细胞生产转基因植物，其中所述转基因植物展现出减少的水平 的菜油甾醇。
110.一种用于增加植物光合作用率的方法，所述方法包括(a)将权利要求1，权利要求2，或权利要求3的多聚核苷酸引入植物细胞，以产生转化 的植物细胞；和(b)从所述转化的植物细胞生产转基因植物，其中所述转基因植物展现出增加的光合作用率。
111.一种用于增加植物光合作用率的方法，所述方法包括(a)为了产生转化的植物细胞，向植物细胞中引入包括编码下列多肽的核酸的分离的 多聚核苷酸1)与SEQ ID NO :2列出的氨基酸序列有约85%或更多序列同源性的多肽，或 2)包括与图2列出的共有序列(SEQ ID NO 4)相对应的氨基酸序列的多肽；和(b)从所述转化的植物细胞生产转基因植物，其中所述转基因植物展现出增加的光合作用率。
全文摘要
本发明描述了分离的多聚核苷酸，多肽，和转基因植物。相对于对照植物，所述转基因可以展现出一种或多种改变的表型特征，包括增加的高度，增加的种子重量，增加的光合作用率，减少水平的菜油甾醇，或增加水平的6-脱氧油菜素甾酮。
文档编号C12N15/82GK102102106SQ20101028790
公开日2011年6月22日 申请日期2005年4月22日 优先权日2004年4月23日
发明者R·I·彭内尔, T·塔塔林诺娃, 吴传银, 张红宇, 方绮雯, 陈志红 申请人:塞雷斯公司