具有△⁶脂肪酸脱氢酶功能的突变基因及其应用的制作方法

专利名称：具有△⁶脂肪酸脱氢酶功能的突变基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物编码突变基因及其应用。具体地，涉及一个具有完整阅读框架的突变基因mRnD6D，其来源于黑茶薦子(Ribes nigrum L.)的一段DNA序列的突变。本发明还涉及该突变基因所编码具有Δ6脂肪酸脱氢酶功能的多肽，以及含有该DNA序列的低等真核细胞表达载体和植物表达载体、宿主细胞以及利用该基因分别转化低等真核生物和植物生产GLA和OTA的应用。
背景技术：
多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)是一类重要的生物营养物质，它是指含有两个或两个以上双键且碳链长为18 22个碳原子的直链脂肪酸。 PUFA在机体内具有较广泛的生理功能和生物学效应。其中，亚油酸(linoleic acid, LA, C18:2"9'12)及亚麻酸被公认为人体必需脂肪酸(essential fatty acids, EFA)，可进一步衍生为具有不同功能的高度不饱和脂肪酸，如花生四烯酸(arachidonic Acid,AA,C20:4"5' 8'"'4)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA, C20 5^8'11'14'17)、二十二碳六烯酸 (docosahexaenoic, DHA, C206Δ4'7'10'13'16'19)等[1](参见后附参考文献目录)。Y-亚麻酸(y-Iinolenic acid, GLA, C18 3Δ6'9'12)属于多不饱和脂肪酸，含有 3 个双键。GLA是生理活性物质ΑΑ、前列腺素、血栓烷素(thromboxanes)和白细胞三烯等的重要前体。同时作为一种人体必需的不饱和脂肪酸，GLA具有降血脂、抗脂质过氧化、减肥、 抑制溃疡、抗血栓性心血管疾病等一系列生物学功能[2]。目前国际上已将其作为一种新的维生素-维生素F进行研究利用[3]。GLA 存在于部分真菌、小球藻(Chlorella spp.)、螺旋藻(Spirulina spp.) 中。高等植物中只有柳叶菜科的月见草(Oenothera sp.)、紫草科的琉璃苣(Borago officinalis)和虎耳草科的黑茶薦子(黑穗醋栗，Ribes nigrum L.)等少数植物种子中发现含有较高的GUU4]。重要的油料作物油菜、大豆、花生等都不含GLA。目前GLA的主要来源是黑茶薦子油、月见草油和琉璃苣油。人体可少量合成GLA，但仍需要从部分藻类、真菌等天然食品中摄取GLA，也可从保健食品摄取，如以黑茶薦子油、月见草油和琉璃苣油为原料提取GLA，制成的胶囊或食品添加剂或兑制的食用油等。十八碳四烯酸(octadecatetraenoicacids, OTA, C18 4Δ6'9'12'15)是 EPA 和 DHA 的代谢前体，在人体内很容易转化为EPA和DHA，利用效率是α -亚麻酸(α -linolenic acid, ALA, 018:3Δ9'12'15)的4倍，可以有效缓解与EPA和DHA缺乏有关的生理疾病。当然通过直接补充EPA或DHA也可以获得同样效果。近期研究显示含有OTA的基因工程大豆油，可以作为具有保护心血管作用的ω-3脂肪酸的有效替代品[5]。在脂肪酸代谢过程中，Δ 6-脂肪酸脱氢酶(A6_fatty acid desaturase,D6D)催化LA和ALA的C-6位脱氢分别生成GLA和0ΤΑ。Δ6脂肪酸脱氢酶是GLA和OTA合成中的关键酶，近年来已被越来越多的研究和利用。迄今为止，Δ6脂肪酸脱氢酶基因已从动物W]、 植物[7]、真菌[8]和线虫[9]等不同生物中克隆获得，并在酿酒酵母[9，10]、番茄[11]、烟草[7，12]、芥菜[8，10]和大豆[13]中成功获得了表达。在植物中，GLA和OTA仅存在于月见草(Oenothera sp.)、琉璃苣(Borago officinalis L.)、黑茶薦子等少数几种植物中[14]，这些植物的种子油也是目前世界上 GLA和OTA的主要商业来源。利用产油真菌发酵也可提取获得GLA和0ΤΑ。但通过现有的这些生产方式获得的GLA和OTA产量都很低，远远不能满足日益增长的市场需求[15]。因此，利用酿酒酵母或转基因油料作物植株表达外源Δ6脂肪酸脱氢酶来生产GLA和OTA具有重要的研究意义和经济价值。此外，虽然琉璃苣[6]具有Δ 6脂肪酸脱氢酶基因在国外已有研究报道，本研究组也报道了两个来源于黑茶薦子的Δ6脂肪酸脱氢酶基因[16]，然而本申请的突变基因具有更高的Δ6脂肪酸脱氢酶催化能力，迄今在国内外未见报道。本发明涉及的基因foiD6D和foiD8A系本实验室从黑茶薦子中克隆得到的两个高度同源的基因，其编码框序列相似性达86%，它们同属于含Cytb5结构域的脂肪酸脱氢酶家族。然而尽管二者同源性很高，但是它们却在植物中行使不同的功能其中^iDSA是植物 Δ8鞘脂脱氢酶，可以催化高等植物鞘脂长链基(long chain base, LCB)的Δ8位脱氢；而 RnD6D是Δ6脂肪酸脱氢酶，以LA和ALA为底物，Δ6位脱氢生成GLA和SDA。Δ8鞘脂脱氢酶普遍存在于各种高等植物中，而Δ6脂肪酸脱氢酶仅存在于如琉璃苣、月见草等少数植物种群中。由于二者具有很高的同源性，但是却行使不同的催化功能，研究者试图将二者进行融合突变改造，期待发现一些与二者行使功能相关的重要功能域。

发明内容
本发明提供了一个突变基因mRnD6D，其核苷酸酸序列分别如SEQ ID N0:1所示， 这个基因来源于黑茶薦子(Ribes nigrum L.)的DNA片段的突变，所编码的多肽如SEQ ID NO 2所示。本发明的另一个目的是提供含基因mRnD6D的低等真核细胞表达载体如酵母表达载体，以及利用该表达载体转化的酵母细胞。在转化的酵母细胞中所表达的多肽具有Δ6脂肪酸脱氢酶功能，可以分别催化外加底物亚油酸和α-亚麻酸分别生成Y-亚麻酸(GLA) 和十八碳四烯酸(OTA)。由于这类基因所编码的是一个蛋白，可采用酿酒酵母表达体系来进行体外表达， 但由于该蛋白为膜蛋白，在体外表达体系中即使表达出来，亦较难分离纯化。故一般采用考察所表达的蛋白对外加底物的催化活性的方法来进行功能鉴定。在所采用的酿酒酵母表达体系中，受体菌是尿嘧啶缺陷型INV Sc I，本身不含 LA (亚油酸)、ALA ( α -亚麻酸)、GLA ( γ -亚麻酸)和0ΤΑ，因此，在添加底物亚油酸的条件下，如若在酵母工程菌中检测到催化产物GLA或0ΤΑ，就可以确定外源基因所编码蛋白在酿酒酵母表达体系中获得了表达，对外加底物产生了催化作用。所以酿酒酵母已经作为研究外源的Δ6、Δ12-脂肪酸脱氢酶基因功能性鉴定的最常用、最有效的表达体系，且已有许多成功的研究报道[7，8，9]。脂肪酸的检测主要采用GC-MS (气相色谱-质谱联用技术)来完成。其原理是通过GC (气相色谱)将不同的脂肪酸组分分离，然后通过MS (质谱)检测器分别对每种组分进行质谱定性分析，从而确定每一种组分的成分及含量的比较成熟的联用分析技术。本发明还涉及突变基因mRnD6D在生产GLA和OTA中的应用。
本发明利用来源于黑茶薦子(Ribes nigrum L. )DNA中的具有完整阅读框架的基因foiD6D的突变基因mRnD6D，将其在酵母表达体系中进行了表达。通过GC-MS分析表明，在酵母中这个突变基因所编码的蛋白可以分别催化外加底物亚油酸(LA)和α -亚麻酸(ALA) 分别生成Y-亚麻酸(GLA)和十八碳四烯酸(0ΤΑ)，具有Δ6脂肪酸脱氢酶功能，并且催化能力显著高于toD6D。本发明可应用于采用基因工程技术以低等真核细胞表达体系和植物表达体系生产GLA和OTA。更具体地，本发明提供以下各项1.具有Δ6脂肪酸脱氢酶活性的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。2.编码以上1所述的多肽的核苷酸序列，优选其为如SEQ ID NO :1所示的突变基因 mRnD6D。3. 一种表达载体，其特征在于包含以上2所述的核苷酸序列。4.以上3的表达载体，其为低等真核细胞表达载体或植物表达载体。5.以上4的表达载体，其中低等真核细胞表达载体选自PYES2等用于低等真核细胞表达的载体。6.以上4的表达载体，其中所述植物表达载体选自pBIN19、pBI121、pB221、 pCambia 1300、pGreen等的植物表达载体。这些植物表达载体都是现有技术中公知的和可商购的。7.以上3的表达载体，其特征在于还包含启动子，所述启动子选自花椰菜花叶病毒CaMV35S、Ubiqutin, Actin、或植物组织部位特异表达启动子，所述启动子单独使用或组合使用。这些启动子的结构和性质都是本领域技术人员所公知的。8. 一种宿主细胞，其特征在于包含以上3-7中任一项的表达载体。9.以上8的宿主细胞，其中所述表达载体是通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒表达载体、直接的DNA转化、微注射或电穿孔的方式导入所述宿主细胞。10.以上8或9的宿主细胞，其为低等真核细胞或植物细胞。11.以上10的宿主细胞，其中所述低等真核细胞为酵母、藻类等的细胞，所述植物细胞包括烟草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、芝麻、花生和芥菜等细胞。12.以上1的多肽、以上2的核苷酸序列、以上3-7中任一项的表达载体、以上8_11 中任一项的宿主细胞在将亚油酸(LA)和α-亚麻酸(ALA)分别酶促转化为亚麻酸 (GLA)和十八碳四烯酸(OTA)中的应用。13.功能结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示。14.编码以上13的功能结构域的核苷酸序列，优选其为SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列。


图 1. mRnD6D 片段核苷酸序列，SEQ ID NO :1。图2.基因mRnD6D所编码的多肽序列，SEQ ID NO :2。图3.基因mRnD6D的酵母表达载体图。图4.基因foiD6D和mRnD6D在酿酒酵母表达中表达的总脂肪酸GC-MS分析a) INV Sc I酵母菌株脂肪酸组成的GC-MS ；
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b)含空载pYES2表达质粒酵母的总脂肪酸GC-MS ；c)含空载pYES2表达质粒酵母在添加LA和ALA底物诱导后的总脂肪酸GC-MS ；d)表达foiD6D基因的酵母在添加LA和ALA底物诱导后的总脂肪酸GC-MS，左边 (红色)箭头所指为产物峰GLA，右边(黑色)箭头指示目的产物OTA ；e)表达mRnD6D基因的酵母在添加LA和ALA底物诱导后的总脂肪酸GC-MS，左边 (红色)箭头所指为产物峰GLA，右边(黑色)箭头指示目的产物OTA ；图5. PCR扩增法突变法的示意图；图6. mRnD6D与I nD6D及I nD8A的编码核苷酸序列比对图(带下划线部分是mRnD6D 基因与I nD6D基因不同的区段如SEQ ID NO 8所示)；和 图7. mRnD6D与I nD6D及I nD8A的氨基酸序列比对图(带下划线部分是mRnD6D与 RnD6D不同的区段如SEQ ID NO 7所示)；图8.mRnD6D与I nD6D相区别的功能结构域(如SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列)； 和图9.编码mRnD6D与I nD6D相区别的功能结构域的核苷酸序列(如SEQ ID NO 8 所示的核苷酸序列)。
具体实施例方式下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是， 下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。实施例一、mRnD6D基因的获得1.黑茶薦子基因组DNA的制备取黑茶薦子幼嫩叶片约0. 5g，加入液氮快速研磨成粉末，转入IOmL离心管中，加入2mL预热的CTAB抽提液，混勻；65°C温育池，期间缓慢颠倒混勻2 3次；加入等体积酚 /氯仿/异戊醇05 24 1 V/V/V)，缓慢颠倒混勻后抽提一次；加入等体积氯仿/异戊醇 (24 1 V/V)，缓慢颠倒混勻后再抽提一次；室温，3070 Xg离心lOmin，上清转入另一 IOmL 离心管；加等体积异丙醇，缓慢颠倒混勻，_20°C放置池；室温，3070 Xg离心lOmin，取上清； 70%乙醇2mL洗涤沉淀2次，吹干；用100 μ L含RNase Α(终浓度50ng/mL)的无菌dd H20 溶解沉淀；37°C消化30min ；直接使用或_20°C保存。2. RnD6D, RnD8A DNA 片段的克隆foiD6D DNA片段的克隆所用引物RnD6D L 5，CGCGGGTACCATGGGTGAAAATGGAAGG-3’ (SEQ ID NO 3)RnD6D R 5，CGCCGAGCTCTCAACCATAGGTGTTGAC-3 ’ (SEQ ID NO 4)foiDSA DNA片段的克隆所用引物RnD8A L :5，-CGCGGGTACCATGGCTGGTGTTGTTGAAAAG-3，(SEQ ID NO 5)RnD8A R :5，-CGCCGAGCTCTCAGCCATGGGTGTTGACAG-3，(SEQID NO 6)PCR 反应体系(50) =DNA 模板1 μ L (50ng)，Pyrobest (Takara) (5U/ μ L) :0. 5 μ L, IOXPCR 缓冲液5 μ L，PL :2. 5 μ L，PR :2. 5 μ L，dNTP(IOmM) :2 μ L，ddH20 :36. 5 μ L。PCR 程序预变性95°C 4min ；变性94°C 30s，退火55°C lmin，延伸72°C 3min,30个循环；延伸720C IOmin。将和foiDSA的PCR产物分别于1. 0 %琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得 RnD6D和foiD8A的PCR片段，平端连入克隆载体pEASY-blunt (Transgene,北京)，获得质粒 RnD6D-pb和I nD8A-pb，转化大肠杆菌DH5 α，测序验证并用作mRnD6D构建的模板。3. mRnD6D 的获得mRnD6D构建所用弓丨物RnD6D L :5，-CGCGGGTACCATGGGTGAAAATGGAAGG-3，(SEQ ID NO 3)RnD6D R :5，-CGCCGAGCTCTCAACCATAGGTGTTGAC-3，(SEQ ID NO 4)RnD8A R :5’ -CGCCGAGCTCTCAGCCATGGGTGTTGACAG-3，(SEQ ID NO 6)DA8R1 :GCTAGCACAAACATCACCCTCTCAGTCCAATTGGDA8L2 :CCAATTGGACTGAGAGGGTGATGTTTGTGCTAGCAD9R1 :CATATAATTATCAGCCGAGAAATGGTTCAAACAD9L2 :GTTTGAACCATTTCTCGGCTGATAATTATATG本文中融合基因和突变基因的克隆采用重叠PCR方法[17]，首先构建中间突变基因 mRnD6D-mid。第一轮PCR反应体系(50 μ L)目的片段1的扩增体系质粒模板foiD6D_pb lyL(50ng) ；pfu 酶(2. 5U/ μ L) :1 μ L ;10XPCR 缓冲液5 μ L ；引物 I nD6D L:lyL;引物 DA8R1 1 μ L ；dNTP (IOmM) :1 μ L ；ddH20 :40 μ L。目的片段2的扩增体系质粒模板RnD8A-pb 1 μ L (50ng) ；pfu酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L ； 10XPCR 缓冲液5μ L ；引物 DA8L2 :1 μ L ；引物 RnD8A R=IyL ；dNTP(IOmM) 1 μ L ； ddH20 :40μ L。PCR 程序预变性 95°C 4min ；变性 94°C 30sec，退火 55°C 40sec，延伸 72°C 2min 30sec，30 个循环；延伸 72°C IOmin0将第一轮两反应的PCR产物1.0%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，分别获得目的片段 1、2。第二轮PCR反应体系(50 μ L)将1、2等量混合(约各取IOOng) ；pfu酶O. 5U/ μ L) L :1 μ L ；引物 RnD8A R=IyL ；dNTP(IOmM) 1 μ L ；ddH20补充至50 μ L体系。PCR程序同第一轮。第二轮PCR产物于1. 0%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得mRnD6D-mid融合基因， 平端连入克隆载体pEASY-blunt，获得质粒mRnD6D-mid-pb，转化大肠杆菌DH5 α，测序验证并用作mRnD6D构建的模板。mRnD6D的获得第一轮PCR反应体系(50 μ L):目的片段3的扩增体系质粒模板 mRnD6D-mid-pb 1 μ L(50ng) ；pfu 酶(2. 5U/μ L) :1 μ L ;10XPCR 缓冲液5 μ L ；引物 I nD6D L 1 μ L ；引物 AD9R1 :1 μ L ；dNTP (IOmM) :1 μ L ；ddH20 :40 μ L。目的片段4 的扩增体系质粒模板 RnD6D 1 μ L (50ng) ；pfu g| (2. 5U/ μ L) : 1 μ L ； 10XPCR 缓冲液5μ L ；引物 AD9L2 :1 μ L ；引物 RnD6D R=IyL ； dNTP (IOmM) :1 μ L ； ddH20 40 μ L0PCR 程序预变性 95°C 4min ；变性 94°C 30sec，退火 55°C 40sec,延伸 72°C 2min 30sec，30 个循环；延伸 72°C IOmin0
将第一轮两反应的PCR产物1.0%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，分别获得目的片段 3、4。第二轮PCR反应体系(50 μ L)将3、4等量混合(约各取IOOng) ；pfu酶(2. 5U/ μ L) L :1 μ L ；引物 RnD6D R 1 μ L ;dNTP(IOmM) 1 μ L ；ddH20补充至50 μ L体系。PCR程序同第一轮。第二轮PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得mRnD6D融合基因，平端连入克隆载体pEASY-blimt，转化大肠杆菌DH5 α，测序验证并保存。为了清楚起见，在附图中提供了上述PCR扩增法突变的示意图(图5)，mRnD6D与 RnD6D及foiDSA编码核苷酸/氨基酸序列比对见附图6，7。实施例二、mRnD6D基因酵母载体的构建经PCR产物mRnD6D利用引物上带有的Kpn I, Sac I酶切位点，双切后获得 mRnD6D基因，定向克隆于酵母表达载体pYES2(购自Ivitrogen公司)，获得酵母表达质粒 PYmRnD6D，转化大肠杆菌DH-5 α (购自Ivitrogen公司)保存。其载体图见图3。实施例三、mRnD6D基因在酵母中的表达1.酵母的转化参照hvitrogen公司pYES2 Kit(Cat# V285-20)所述方法，将上述嵌合基因的酵母表达质粒PYmRnD6D，采用醋酸锂介导转化酿酒酵母营养缺陷型菌株INV Sc I (购于 Invitrogen公司)，以空载pYES2质粒为对照，获得含有各表达质粒的酵母细胞。2.转化酵母细胞的诱导表达取含目的基因的酵母表达质粒转化的酵母单菌落，接种于50ml SC_U培养液(参照Invitrogen公司pYES2 Kit所述配方)含2% (wt/v)棉籽糖的SC-U培养液中，250rpm， 28°C，培养过夜；加入Tergitol NP-40 (Fluka)(终浓度1 % (ν/ν))、外源亚油酸和α-亚麻酸底物(Sigma)(终浓度为0. 003% (wt/v)),以及酵母表达诱导物D-半乳糖(Amresco) (终浓度为2% (wt/V))250rpm，22°C培养7 诱导表达。实施例四、mRnD6D基因酵母表达物对Δ6脂肪酸脱氢酶底物催化产物的GC-MS分析脂肪酸的提取与甲酯化。离心收集取诱导后的酵母菌体，去离子水洗涤，50°C烘干。取40mg酵母粉(在实例3. 2中所诱导获得的酵母经50°C烘干即得)充分研磨，加入:3ml 7. 5% KOH-CH3OH, 70°C水浴3h后加入HCl酸化至其pH值达2.0。再加入anl 14% BF3-CH3OH (购自Aldtich公司) 溶液，70°C水浴1.釙。加入Iml 0.9% NaCl溶液，混勻后静止片刻。加入2ml正己烷抽提两次，吸取抽提液，N2吹干。最后溶于100 μ 1乙酸乙酯。终产物GC-MS检测分析实验。所用GC-/MS 仪为 TurboMass (PerkinElmer 公司)，柱子ΒΡΧ-90， 30mX0. 25mmX0. 25vm，柱温120°C，气化室温度230°C。取1 μ 1终产物上样，分流比10 1。GC-MS结果分析。对比图4(a)、4(b)，表明在不添加亚油酸(LA)、α -亚麻酸(ALA)底物条件下，所用酵母工程植株以及含经诱导的空载PYES2表达质粒酵母中没有新的产物峰出现，说明所用酵母工程菌株及空载PYES2表达质粒酵母的总脂肪酸中不含外加底物LA和ALA及催化产物Y -亚麻酸(GLA)、十八碳四烯酸(OTA)。当添加LA和ALA底物，并进行诱导表达时，对照(空载pYES2)亦没有产物峰GLA 和OTA的出现(参见图4 (c))。而含RnD6D和mRnD6D的酵母表达菌被诱导后，外加底物LA 和ALA可以被催化生成GLA和OTA(参见图4(d)和图4(e))；且mRnD6D的催化能力大大高于RnD6D，mRnD6D对LA的转化能力约为RnD6D的2. 5倍，对ALA的转化能力约为RnD6D的 2倍(三次实验的平均值，见表1)。表1转基因酵母对底物LA和ALA转化效率的比较(数值代表转化效率即产物量/底物量)
权利要求
1.具有Δ6脂肪酸脱氢酶活性的多肽，其氨基酸序列如SEQID Ν0:2所示。
2.编码权利要求1所述的多肽的核苷酸序列，优选其为如SEQID NO :1所示的突变基因 mRnD6D。
3.—种表达载体，其特征在于包含权利要求2所述的核苷酸序列，优选其为低等真核细胞表达载体或植物表达载体，更优选其中低等真核细胞表达载体选自PYES2等用于低等真核细胞表达的载体。
4.权利要求3的表达载体，其中所述植物表达载体选自pBIN19、pBI121、pB221、 pCambia 1300、pGreen等的植物表达载体。
5.权利要求3的表达载体，其特征在于还包含启动子，所述启动子选自花椰菜花叶病毒CaMV35S、Ubiqutin, Actin、或植物组织部位特异表达启动子，所述启动子单独使用或组合使用。
6.一种宿主细胞，其特征在于包含权利要求3-5中任一项的表达载体，优选其中所述表达载体是通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒表达载体、直接的DNA转化、微注射或电穿孔的方式导入所述宿主细胞。
7.权利要求6的宿主细胞，其为低等真核细胞或植物细胞，优选其中所述低等真核细胞为酵母、藻类等的细胞，所述植物细胞包括烟草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、芝麻、花生和芥菜等细胞。
8.权利要求1的多肽、权利要求2的核苷酸序列、权利要求3-5中任一项的表达载体、 权利要求6-7中任一项的宿主细胞在将亚油酸(LA)和α -亚麻酸(ALA)分别转化为γ-亚麻酸(GLA)和十八碳四烯酸(OTA)中的应用。
9.功能结构域，其氨基酸序列如SEQID Ν0:7所示。
10.编码权利要求9的功能结构域的核苷酸序列，优选其为SEQID NO :8所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了具有Δ6脂肪酸脱氢酶功能的突变基因及其应用。本发明创制了在来源于黑茶藨子(Ribes nigrum L.)DNA中的具有完整阅读框架的基因RnD6D的基础上，创制了突变基因mRnD6D，将其在酵母表达体系中进行了表达。通过GC-MS分析表明，在酵母中这个突变基因所编码的蛋白可以分别催化外加底物亚油酸(LA)和α-亚麻酸(ALA)分别生成γ一亚麻酸(GLA)和十八碳四烯酸(OTA)，具有Δ6脂肪酸脱氢酶功能，并且催化能力显著高于RnD6D。本发明可应用于采用基因工程技术以低等真核细胞表达体系和植物表达体系生产GLA和OTA。
文档编号C12N9/02GK102399758SQ20101028751
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者宋丽英, 尹维波, 胡赞民, 陈宇红 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所