专利名称：一种结核分枝杆菌快速变色药敏培养基的制备方法
技术领域：
本发明涉及结核病的防控技术领域，具体涉及一种杆菌快速变色药敏培养基的制 备方法。
背景技术：
以Bactec TB 460为代表的第一代分枝杆菌快速培养、药敏检测系统，对结核病 的快速诊断起到了重要作用。Bactec TB 460可显著缩短培养时间和药敏试验时间，同时 提高阳性检出率，操作简便、自动化强，还可进行快速菌型鉴定[3]。但存在液体培养基中 污染率高，仪器与试剂价格较贵、有放射性污染，难以全面推广应用等问题[4]。以Bactec MGIT 960为代表的第二代分枝杆菌快速培养、药敏检测系统，解决了 Bactec TB 460存在 的放射性污染问题，并保留了其快速的优点，使结核病细菌学检查方法又有了进一步发展 [5]。Bactec MGIT960的自动化程度虽然更高、操作更为简便，但价格昂贵[6]。与Bactec MGIT 960相似的还有BBL MGIT分枝杆菌快速手工培养、鉴定、药敏检测系统。该法所用培 养基同Bactec MGIT 960，只是培养和检测需手工操作，结果判断采用小型紫外检测仪或普 通紫外灯检测荧光强度，但其操作繁琐，紫外线使用存在对人体伤害的风险[7]。上述几种 分枝杆菌快速培养、药敏检测系统均设有内置定标管，每小时自动进行校正，严格保证检测 质量。但是样品的前处理、接种等操作不当，仍将影响检测结果。因此，必须加强质量控制。 对于仪器判断为阳性的样品，仍须进行涂片、抗酸染色、显微镜下找到抗酸杆菌后方能判定 阳性。Welson发明的噬菌体裂解法检测结核分枝杆菌具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、 安全等优点，并且检测出的是活菌分枝杆菌[8]。但是噬菌体裂解法为间接判断法，由于培 养环境的不同，噬菌斑的大小受培养环境的影响，结果判读不易标准化。液体变色培养基最 先由德国Heipha/Biotest公司研制，称为MB Redox系统[9]。其检测原理是液体变色培 养基中含有氧化还原显示器，为一种无色四唑鐺(tetrazolium)盐，当分枝杆菌在液体变 色培养基中生长时，通过氧化还原系统，使培养基中的无色四唑鐺盐还原成粉红色、红色或 紫色臢。由于甲臢不溶于水，以颗粒形式分泌至细胞表面，这样分枝杆菌菌落就变成了用肉 眼可以观察到的红或紫色，此时取培养液涂片，染色镜检。目前国内已有学者在此基础上研 发出此类培养基[10]。此类方法多以甲臢为显色剂，由于其水不溶性，而滞留于菌体表面， 易造成负反馈，不利于再增殖；另外也无菌种选择性，特别是与分枝杆菌生长周期接近的菌 类。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，研制出液体变色培养系统结合判读卡， 有操作简便、快速、可用肉眼判断结果、稳定性好、无需特殊仪器、便于推广等优势的培养 基。为结核病的防控提供一种简单、快速、廉价的诊断方法。本发明是通过以下技术方案实现的本发明包括以下步骤
①使用背景清晰的临床分离到的结核分枝杆菌，以快速培养系统培养基为基础，添加显色剂，从生长速度、标记物检测、细胞形态三个方面观察显色剂对结核分枝杆菌的影 响；②使用背景清晰的临床分离到的病原细菌，病原真菌，以快速培养系统培养基为 基础，观察显色剂对这些菌株的影响；③配制快速变色液体培养基，A液组分的百分数KH2P04 7.6%，七水MgS04 1.6%，柠檬酸镁3.0%，天冬酰胺12. 1%，琼脂粉75. 7%;B液:bovinealbumin牛血清白蛋 白 8. 6%, dextrose 葡萄糖 12. 3%,catalase 过氧化氢酶 3. 7%,oleic acid 油酸 73. 8%, ATP 0. 1%，辅酶Al.2%，细胞色素丙0. l%，alfa-萘乙酸0. 2%;A液中盐类完全溶解后加 入琼脂混勻后110°C高压20分钟，自然降温至45-50°C ；B液完全溶解后0. 22nm过滤，温育 至40°C后迅速加入A液中，完全混勻后尽快分装，制成斜面，以不添加显色剂的非变色液体 培养基和罗氏培养基、Bactec TB 460,Bactec TB 960为对照，在每种培养系统下绘制菌株 随时间变化的生长曲线图；④在快速变色液体培养基上接种背景清晰的临床分离到的结核分枝杆菌，测定显 色程度和菌体数目的关系，制备比色卡；⑤以罗氏培养基上的比例法为对照，确定变色快速液体培养基中抗结核药物的浓度。所述的病原细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。所述的病原真菌为白色念珠菌、毛霉菌。所述的抗结核药物为一线、二线抗结核药物、菌型鉴定药物。本发明与现有技术相比，具有操作简单、易控制等特点，选用无细胞毒性但对结核 分枝杆菌有选择性的显色剂，培养基的颜色和菌体数量成量化关系，使用目视，可量化的比 色卡，可快速得出药敏结果。这一培养基体系安全、无感染风险、可目视判读药敏结果。
图1为本发明的流程示意图；图2为本发明的变色剂对结核分枝杆菌生长影响图；图3为本发明的变色剂对结核分枝杆菌生长影响图；图4为本发明的菌株在不同培养系统下随时间生长变化5为本发明的变色快速液体培养基中抗结核药物的浓度图表指定图1为摘要附 具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。本发明包括以下步骤使用背景清晰的临床分离到的结核分枝杆菌，以快速培养系统培养基为基础，添 加显色剂，从生长速度、标记物检测、细胞形态三个方面观察显色剂对结核分枝杆菌的影 响；(参见图2)使用背景清晰的临床分离到的病原细菌，病原真菌，以快速培养系统培养基为基础，观察显色剂对这些菌株的影响；(参见图3)配制快速变色液体培养基配方A液KH2P04，MgSO4,柠檬酸镁，柠檬酸铁铵，天冬酰胺，琼脂粉B :bovine albumin ^ilif S S S dextrose ^^H, catalase ilfl^SBI, oleic acid油酸，ATP,辅酶A，细胞色素丙，alfa-萘乙酸
制作方法A液中盐类完全溶解后加入琼脂混勻后110°C高压20分钟，自然降温至 45-500C ；B液完全溶解后0. 22nm过滤，温育至40°C后迅速加入A液中，完全混勻后尽快分 装，制成斜面。以不添加显色剂的非变色液体培养基和罗氏培养基、Bactec TB 460, Bactec TB 960为对照，在每种培养系统下绘制菌株随时间变化的生长曲线图；(参见图4)在快速变色液体培养基上接种背景清晰的临床分离到的结核分枝杆菌，测定显色 程度和菌体数目的关系，制备比色卡；以罗氏培养基上的比例法为对照，确定变色快速液体培养基中抗结核药物的浓 度。(参见图5)
权利要求
一种结核分枝杆菌快速变色药敏培养基的制备方法，其特征在于步骤如下a.配制快速变色液体培养基，A液组分的百分数KH2PO4 7.6％，七水MgSO4 1.6％，柠檬酸镁3.0％，天冬酰胺12.1％，琼脂粉75.7％；B液bovinealbumin牛血清白蛋白8.6％，dextrose葡萄糖12.3％，catalase过氧化氢酶3.7％，oleic acid油酸73.8％，ATP 0.1％，辅酶A1.2％，细胞色素丙0.1％，alfa 萘乙酸0.2％；b.A液中盐类完全溶解后加入琼脂混匀后110℃高压20分钟，自然降温至45 50℃；B液完全溶解后0.22nm过滤，温育至40℃后迅速加入A液中，完全混匀后尽快分装，制成斜面；c.以不添加显色剂的非变色液体培养基和罗氏培养基、Bactec TB 460、Bactec TB 960为对照，在每种培养系统下绘制菌株随时间变化的生长曲线图；d.在快速变色液体培养基上接种背景清晰的临床分离到的结核分枝杆菌，测定显色程度和菌体数目的关系，制备比色卡；e.以罗氏培养基上的比例法为对照，确定变色快速液体培养基中抗结核药物的浓度。
全文摘要
本发明涉及结核病的防控技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌快速变色药敏培养基的制备方法，其特征在于在快速培养基体系下，进行变色快速药敏培养基的研发，选用无细胞毒性但对结核分枝杆菌有选择性的显色剂，培养基的颜色和菌体数量成量化关系，使用目视，可量化的比色卡，可快速得出药敏结果。这一培养基体系安全、无感染风险、可目视判读药敏结果。
文档编号C12Q1/04GK101935685SQ20101028716
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月20日 优先权日2010年9月20日
发明者刘军, 孙庆文, 孙战强, 张舒林, 王洪海 申请人:上海成海生物科技有限公司