专利名称：一种用于转基因大豆检测的五基因标准质粒分子及其构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种分子生物学技术领域的质粒分子，具体来说，涉及一种转基因大豆检测用标准质粒分子及其构建方法。
背景技术：
自1996年以来，全球转基因作物种植面积以年均10%以上的速率增长，2009年全球批准种植的转基因作物达1.34亿公顷，其中转基因大豆种植面积达到6900万公顷，占大豆总种植面积的77%。随着转基因作物的广泛种植，其安全性问题引起了全球公众的普遍重视。欧盟于1998年在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9%。随之，日本、澳大利亚、韩国等国家对转基因成分的最低含量做了不同的规定，阈值从1-5%不等。我国于2001年5月23日发布了《农业转基因生物安全管理条例》，2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。标识制度的实施依赖于转基因产品检测技术。目前主要有两类技术一类是基于核酸方法，如PCR、基因芯片等，另一类是基于蛋白质方法，如ELISA、试纸条等，其中PCR方法应用最广。针对插入的外源DNA序列，PCR检测策略可以分为四种，即通用元件筛选检测、 基因特异性检测、构建特异性检测和品系特异性检测。通用元件筛选PCR检测主要是以转基因通用元件CaMV35S启动子和NOS终止子为目的基因片段；基因特异性PCR检测是以插入外源基因的特异性DNA片段作为目的检测片段；品系特异性PCR检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝，所以品系特异性检测方法具有较高的特异性和准确性。品系特异性检测已经成为目前转基因检测研究的重点， 并逐步地为国际各检测实验室所采用。在进行PCR检测时，需要设置阳性对照以确保检测过程的有效性和检测结果的可靠性，特别是在定量PCR检测中需要用含量准确的转基因作物阳性标准品(CRMs)来制作标准曲线。然而，由于转基因作物存在生物安全性和和现有技术的限制，转基因作物阳性标准品很难获得，这种现状已成为检测方法和应用的瓶颈。因此亟需研制能够替代转基因作物标准物质的新型阳性对照材料，以满足不断发展的转基因检测需求。标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有转基因检测目的外源基因和/或内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子，研究表明质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准物质替代物。近年来，国内外众多学者报道了一些用于转基因产品检测的标准质粒分子。标准质粒分子的容量也有一个大的提升，从最初的单一目标基因的质粒分子到多目标基因的质粒分子，这些质粒分子可同时涉及不同物种的转基因作物的多个基因。目前，利用融合PCR技术可以实现多个基因片段的拼接，这样利用一个标准质粒分子就可以实现对多个转基因作物的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转基因大豆检测用标准质粒分子及其构建方法，使其可以代替阳性标准物质用于转基因大豆的定性和定量PCR检测。利用融合PCR技术的原理设计了大豆Lectin基因、35S启动子、NOS终止子、PAT基因、EPSPS基因的PCR融合弓丨物，经过融合PCR扩增获得了五基因的融合大片段。利用分子克隆技术将融合大片段插入到pMD 19-T Simple载体中，获得了重组质粒分子pTLE5。本发明构建的标准质粒分子pTLE5可以作为检测过程中的阳性对照，为解决转基因作物检测中标准物质缺乏的难题提供一条有效途径并能有效地保障检测工作的进行。本发明所述标准质粒分子含有大豆内参基因LeCtin、35S启动子、NOS终止子、PAT 基因、EPSPS基因的一段序列，可以替代转基因大豆品系GTS40-3-2和转PAT基因大豆，用于定性和定量PCR检测。本发明所述的一种转基因大豆检测用标准质粒分子及其构建方法，包括以下步骤(1)利用GenBank数据库查找并获得大豆内参基因LeCtin、35S启动子、NOS终止子、EPSPS基因、PAT基因；(2)利用I^rimer Premier 5. 0软件设计PCR特异性引物并进行blast验证；(3)分别扩增上述五个基因；(4)采用融合PCR方法将五个基因拼接成大片段；第一轮反应以转基因大豆品系GTS40-3-2、转基因大豆品系A2704-12基因组DNA 为模板，以权利要求3中对应引物进行PCR扩增；反应体系为总体积为50 μ 1，其中10倍 Taq 缓冲液 5μ l，dNTPs(10mM)4y 1，上下游引物(10 μ M)各 4μ 1，模板(IOng/μ 1) 1 μ 1，用 ddH20 补足至 50 μ 1。反应程序为95°C5min ;30 个循环(94 °C 30sec，56. 8-59. 5 °C 30sec，72°C 30sec-60sec) ；72°C IOmin ；4°C保存；产物标记为 PLeel、P35s、Pnqs、Ppat、Peps ；第二轮反应，分两步进行扩增第一步取第一轮反应产物各70ng，10倍Taq缓冲液5 μ 1，dNIPs (IOmM) 4 μ 1，用 ddH20补足至50 μ 1 ；其中P—与P35s相连接，Pnos与Ppat相连接；反应程序15个循环(94°C 20sec，58. 8-60°C 85sec)，4°C保存；第二步向第一步反应液中分别加入引物Lec-Pl和35S-P2各1 μ 1，引物Nos-Pl 禾口 ΡΑΤ-Ρ2 各 1 μ 1 ；反应程序94°C3minJ8 个循环(94°C 15sec，60°C lmin，72°C 2min)，4°C保存；将融合PCR产物割胶纯化后标记为P^_35S、 1 NOS-PAT ο第三轮反应将产物PLeel_35S、 1 NOS-PAT 和Peps进行融合PCR反应。取第一轮反应产物Peps与第二轮中的产物P^hp Pnos_pat各2 μ 1作为模板，引物为Lec-Pl和Eps_P2扩增；反应体系为总体积50 μ 1，其中10倍Taq缓冲液5 μ 1， dNTPs(10mM)4y 1，上下游引物(ΙΟμΜ)各 1μ 1，用 ddH20 补足至 50 μ 1 ；反应程序94°C30sec, 28 个循环(94°C 15sec,60°C lmin, 72°C 2min)，4°C保存；将I3Lecl-ms、Pnos-PAT 和Peps连接产物标记为 1 LE5°(5)回收纯化PlE5，连接于pMD 19-T Simple载体，转入大肠杆菌T0P10筛选得到标准质粒分子pTLE5。(6)标准质粒分子PTLE5的定性PCR检测方法验证。(7)标准质粒分子PTLE5的定量PCR检测方法验证。所述的定性PCR验证，是指用定性PCR方法分析构建的标准质粒分子PTLE5中能扩增出与转基因大豆品系GTS-40-3-2和A2704-12相同的大豆内源基因Lectin 1以及 35S、N0S, EPSPS和PAT基因的特异性序列，且对pTLE5中特异性基因的检测灵敏度能满足定性PCR检测的要求。所述的定量PCR验证，是指用定量PCR方法分析构建的标准质粒分子pTLE5中大豆内源基因Lectin 1和转基因大豆品系GTS_40_3_2外源基因EPSPS特异性序列的检测极限、定量极限以及重复性和重演性等特性，以鉴定该标准质粒分子代替阳性标准物质的能力，以及实际应用于定量PCR检测转基因大豆品系GTS-40-3-2测定有效性。本发明公开的有效制备转基因作物检测标准分子对照物Lectin 1+35S+N0S+PAT+EPSPS方法所具有的有益结果在于，利用融合PCR首次构建了含有五个基因的标准质粒分子PTLE5。此标准质粒分子可以代替阳性标准物质用于转基因大豆的定量 PCR检测，从而解决了检测过程中阳性标注物质缺乏的问题，在检测过程中无需提供多种阳性基因组DNA作为阳性对照；将该标准质粒分子转入大肠杆菌，可长期稳定保存；此外， 也可以在原有标准质粒分子的基础上加入新的外源基因片段，以满足日益增多的转基因作物材料检测的需要。此标准质粒分子PTLE5在实际检测中具有特异性好、灵敏度高等优点， 应用该标准质粒分子进行实际样品定量分析时，样品检测结果的偏差在国际上广泛认可的允许范围内。因此，本发明中构建的标准质粒分子PTLE5完全适用于对转基因大豆及其加工产品中的转基因成分含量的定量分析。
图1五基因及各融合片段PCR产物的凝胶电泳图Ml =DNA marker II ；M2 :DNA marker III ；1 =Lecl ；2 :35S ；3 :N0S ；4 :PAT ；5 EPSPS ；6 :Lecl+35S ；7 :N0S+PAT ；8 :LE5图2五基因标准质粒分子PTLE5的构建示意图及测序结果斜体加粗的为融合PCR引物所在位置，方框内为定量引物和探针所在位置。在八基因之间引入了四个限制性内切酶Not I , Sal I , EcoR I和Xba I。
具体实施例方式为了更充分的解释本发明的实施，下面提供转基因大豆标准分子对照物的制备实施实例。这些实施实例仅仅是解释而不是限制分发明的范围。下列实施例中未标明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作。实施例1 标准质粒分子的构建一、实验材料转基因大豆品系GTS40-3-2和A2704-12 ；非转基因大豆品种；转基因棉花品种。
二、实验试剂pMD 19-T Simple Vector购自大连宝生物工程公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA marker I、II和marker III购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶Not I ,Sal
I、EcoR I , Xba I购自NEB北京有限公司；质粒基因组DNA提取及纯化采用北京天根生化科技有限公司研制的质粒小量提取试剂盒；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。三、实验仪器TC-512型PCR扩增仪(英国TECHNE公司)；Geliance 200 DNA电泳凝胶成像仪 (美国PerkinElmer公司)；Nano-Drop ND-1000核酸蛋白仪(美国Nano Drop公司)；离心机；恒温水浴锅；培养箱；天平等。四、试验方法和过程1、植物基因组DNA提取-SDS法a、称取0. Ig经粉碎机粉碎的大豆样品，加入Iml 65°C预热的2% SDS抽提液， 10 μ 1 RNase-A混勻，于65°C温育30min，置于室温后13000r离心lOmin。b、取上清加0. 6倍体积的KAc，冰浴20min后，13000r离心lOmin，取上清加2倍体积预冷无水乙醇，混勻。c、于-20°C静置30min，13000r离心lOmin，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，短时间离心后弃上清，重复一次。自然干燥后加200μ1 TE溶沉淀，-20°c保存。d、取2 μ 1提取的DNA样品，用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。利用核酸仪测定所提取的DNA浓度和纯度。2、引物设计在GenBank中搜索大豆内源基因Lectin 1、转基因大豆筛选序列35S和NOS、转基因大豆外源基因PAT和EPSPS基因序列，利用软件I^rimer 5. 0设计5对定性PCR引物，分别用于扩增大豆内参基因特异性序列Lectin 1、转基因大豆筛选序列35S和N0S、转基因大豆外源基因PAT和EPSPS基因特异性序列。具体的引物序列见表1。表1构建标准质粒分子的PCR弓丨物序列
H标方向引物序列产物大基因小(bp)Lectin 1Lec-PlATAAGAATGCGGCCGCGGCTTGCCTTCTTTCTCLec-P2CAATGGAATCCGAGGAGT-CCCTTCGATCTGTCACATTT53035S35S-P1AAATGTGACAGATCGAAGG-GACTCCTCGGATTCCATTG35S-P2CCAAATGTTTGAACGATC-CCTCTCCAAATGAAATGAAC311NOSNos-PlGTTCATTTCATTTGGAGAGG-GATCGTTCAAACATTTGGNos-P2ACTCTTGTGGTGTTTGTGGC-GATCTAGTAACATAGATGA253PATPat-PlTCATCTATGTTACTAGATC-GCCACAAACACCACAAGAGTPat-P2GCGTCGACATGACGCACAATCCCACTATC-AACCAACATCATGCCATCCAC378Sad-P2GGAATTCGAGACCGCCGAACATGAA-CCTCAGCTTACCCACTTCAG335EPSPSEps-PlGGAATTCCTGAAGTGGGTAAGCTGAGG-TTCATGTTCGGCGGTCTCEps-P2GCTCTAGAATCATCGTGGCATCGTCC11993、五基因的独立PCR扩增根据表1的引物，以转基因大豆基因组DNA为模板，分别对大豆内源基因Lectin1、转基因大豆的35S启动子和NOS终止子、转基因大豆外源基因PAT和EPSPS基因进行PCR 扩增。按照常规PCR方法进行各目的片段的独立扩增。扩增使用Taq DNA聚合酶，各片段扩增的反应条件及扩增产物长度如表2所示。扩增产物用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测， 确定目的条带，切胶Gel Extraction MiniKit回收。凝胶制备过程中减少EB的加入量，要求EB浓度一般低于0. 15 μ g/ml。表2待融合片段扩增的反应条件及扩增产物长度
权利要求
1.一种转基因大豆检测用标准质粒分子，其特征在于，通过特异性PCR引物从转基因大豆基因组DNA中扩增出大豆内源基因Lectin 1、筛选序列35S和N0S、外源基因PAT和 EPSPS基因，利用融合PCR将这五个基因融合成一个片段，并构建到质粒载体PMDTM19-T Simple中，获得标准质粒分子PTLE5。
2.权利要求1所述的转基因大豆检测用标准质粒分子，其特征是，含有大豆内源基因特异性序列Lectin 1、筛选序列35S和N0S、转基因大豆品系A2704-12转化事件PAT基因特异性序列和转基因大豆品系GTS40-3-2转化事件EPSPS基因特异性序列，其先后顺序为 Lectinl+35S+N0S+PAT+EPSPSo
3.根据权利要求1所述的转基因大豆检测用标准质粒分子，其中 Lectinl+35S+N0S+PAT+EPSPS标准分子的引物序列如下
4. 一种如权利要求1所述的转基因大豆检测用标准质粒分子的构建方法，其特征在于，包括以下步骤(1)利用生物学数据库进行生物信息学分析，获得大豆内源基因Lectin1、转基因大豆筛选序列35S和N0S、转基因大豆品系A2704-12外源基因PAT和转基因大豆品系 GTS40-3-2外源基因EPSPS的特异性序列；(2)设计PCR特异性引物；(3)Lectin 1+35S+N0S+PAT+EPSPS 基因的融合 PCR 第一轮反应以转基因大豆品系GTS40-3-2、转基因大豆品系A2704-12基因组DNA为模板，以权利要求3中对应引物进行PCR扩增；反应体系为总体积为50 μ 1，其中10倍 Taq 缓冲液 5μ l，dNTPs(10mM)4y 1，上下游引物(10 μ M)各 4μ 1，模板(IOng/μ 1) 1 μ 1，用 ddH20 补足至 50 μ I0反应程序为95°C 5min ；30 个循环(94 °C 30sec，56. 8 59. 5 °C 30sec，72°C 30 60sec) ；72°C IOmin ；4°C保存；产物标记为 PLecl、P35S、PNOS、PPAT、PEPS ；第二轮反应，分两步进行扩增第一步取第一轮反应产物各70ng，10倍Taq缓冲液5μ l，dNIPs(10mM)4y 1，用ddH20 补足至50 μ 1 ；其中PLecl与P35S相连接，PNOS与PPAT相连接；反应程序15 个循环(94°C 20sec，58. 8 60°C 85sec)，4°C保存；第二步向第一步反应液中分别加入引物Lec-Pl和35S-P2各1 μ 1，引物Nos-Pl和PAT-P2 各 1 μ 1 ；反应程序94°C 3min,28 个循环(94°C 15sec，60°C lmin，72°C 2min)，4°C保存；将融合PCR产物割胶纯化后标记为PLecl-35S、PNOS-PAT0第三轮反应将产物PLecl-35S、PNOS-PAT和PEPS进行融合PCR反应。 取第一轮反应产物PEPS与第二轮中的产物PLecl-35S、PNOS-PAT各2 μ 1作为模板， 引物为Lec-Pl和Eps_P2扩增；反应体系为总体积50 μ 1，其中10倍Taq缓冲液5 μ 1， dNTPs(10mM)4y 1，上下游引物(ΙΟμΜ)各 1μ 1，用 ddH20 补足至 50 μ 1 ；反应程序94°C 30secJ8 个循环(94 °C 15sec,60°C lmin，72°C 2min)，4 °C 保存；将 PLecl-35S、PNOS-PAT 和 PEPS 连接产物标记为 PLE5。(4)回收纯化PLE5，连接于pMDTM19-T Simple载体，获得标准质粒分子pTLE5。
全文摘要
本发明公开了一种转基因作物检测中必要的标准质粒分子及其构建方法。一种转基因大豆检测用标准质粒分子及其构建方法，所述标准质粒分子包含大豆内源基因Lectin特异性片段、35S启动子和NOS终止子特异性片段、转基因大豆品系A2704-12中外源基因PAT特异性片段、转基因大豆GTS40-3-2品系中外源基因EPSPS特异性片段。通过分析这五个基因的特异性序列，设计了特异性PCR引物扩增获得了五个目的基因片段。通过融合PCR方法将这五个基因融合成一个长片段，克隆到质粒载体pMDTM19-T Simple上得到重组质粒分子pTLE5。本发明中构建的标准质粒分子完全可以代替阳性标准品，该标准质粒分子完全适用于对转基因大豆品系GTS40-3-2和转基因大豆品系A2704-12的筛选、结构基因特异性的定性和定量PCR分析和检测。如有新的转基因材料出现，可在原标准分子的基础上加入新的外源基因片段，满足日益增多的转基因作物材料的检测需要。
文档编号C12Q1/68GK102409082SQ201010286899
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月20日 优先权日2010年9月20日
发明者杨雅麟, 滕达, 王建华, 王秀敏 申请人:中国农业科学院饲料研究所