专利名称：一种豆科植物活性多肽的分离提取方法及其氨基酸序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生化技术和生物杀虫剂的技术领域，特别涉及一种具有抗虫功能的豆科植物活性多肽的分离提取方法及其氨基酸序列。
背景技术：
经多年来的研究成果表明将谷物与豌豆(Pisum sativum)混合储藏时，米象(Sitophilus oryzae)、玉米象(Sitophilus zeamais)和谷象(Sitophilus granarius)等储粮害虫存活与繁殖现象明显减少；采用豌豆粗提取的蛋白成分对米象、玉米象、谷象和蚜虫等多种昆虫的喂食实验中，都表现出具有显著的毒性作用。作为自然界天然存在的生物杀虫剂，是未来安全性为首要特征的生物农药开发的重要资源，所以，有必要对豌豆的蛋白成分作较为详尽的分离、纯化，并对各蛋白组分的生理生化特性、毒理毒性以及其蛋白组成等进行彻底分析。
目前，我国在国家粮库和地方粮库中主要采用熏蒸剂和化学防护剂防治储粮害虫，由此产生的3R问题即残留(Residue)、抗性(Resistance)及害虫再猖獗(Resurgence)也日趋明显。因此，寻找更有效、安全的方法来控制储粮害虫的危害，一直都是我们所面临的紧迫课题。
利用植物次生代谢产物开发与环境和谐的杀虫剂是当今生物农药的研究热点。植物次生代谢产物是植物长期与昆虫协同进化过程中抵御昆虫植食行为而产生的化学物质，这些活性物质可以经过加工成为植物性杀虫剂，对害虫具有多种生物活性、对天敌影响小、在环境中容易降解、昆虫不易产生抗药性等特点，符合新世纪对农药的要求。随着我国可持续植保发展战略的实施，对农药的安全使用要求也日益严格，尤其对储粮害虫中应用的杀虫剂，要求既能防治害虫的发生，又不对储粮和环境产生污染，且不对人的健康造成威胁。但到目前为止，国内外虽然对植物源杀虫剂在储粮害虫防治中的应用有了很多的研究，但主要停留在对粗提物的直接应用和粗提物与化学农药的复配上，具体的活性物质并没有分离出来，对其作用机理的研究还很不深入，开发出的植物性杀虫剂产品还很少。因此，植物源高效低毒杀虫剂的研究与应用是储粮害虫防治工作中一个非常重要的研究课题。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种具有抗虫功能的豆科植物活性多肽的分离提取方法及其氨基酸序列。采用现代生化的技术手段，对豌豆中具有对粮储害虫有毒杀作用的蛋白成分进行跟踪，进行逐步的分离、纯化，并对此活性组分的生理生化特性、蛋白质组成等进行分析。
为了达到上述目的，本发明采用如下的技术方案一种具有抗虫功能的豆科植物活性多肽的分离提取方法，包括如下步骤(1)豌豆蛋白粗提物的制备将豌豆粉与醋酸缓冲液(pH4.9)搅拌混合，配制成浓度约为8.0％(w/v)的混合液，在温度低于25℃的条件下，混合液进行离心分离，取上清液进行膜(M5)超滤，再将滤液离心，收集上清液进行冷冻干燥，可得到粗提物冻干粉。
(2)对粗提物的离子交换树脂层析分离将步骤(1)获得的粗提物冻干粉与60％的甲醇混合，混合浓度约为10％(w/v)左右，在4℃下搅拌，然后离心分离，收集上清液，真空干燥；然后再添加水和Tris-HCl缓冲液，使Tris-HCl的终浓度为50mM；用阴离子交换层析柱分离可溶的蛋白组分；吸附蛋白组分在缓冲液A与缓冲液B的混合作用下析出；洗脱缓冲液流速为20ml/min，在280nm波长下收集DEAE II。所述缓冲液A为50mM pH8.8 Tris-HCl；缓冲液B为25mM pH8.8 Tris-HCl和250mM NaCl。
(3)对分离组分的反相HPLC层析纯化经阴离子交换层析柱分离得到的活性组分DEAE II，再进行反相HPLC(RT-HPLC)层析纯化分离；对滞留时间为14min左右的PT吸收峰组分洗脱液进行收集，真空干燥，得到豆科植物活性多肽PT蛋白组分。
所述步骤(3)中反相HPLC层析分离色谱条件分离柱为5μNucleosil-300C18(Hypersil)，洗脱液采用线性梯度乙腈(20％～100％，V/V，内含0.04％三氟乙酸)，流速3ml/min；洗脱程序为t＝0min，40％缓冲液B(乙腈，内含0.04％三氟乙酸)；t＝5min，40％缓冲液B；t＝17min，48％缓冲液B；t＝18min，80％缓冲液B，t＝23min，80％缓冲液B。所述缓冲液B为50mM pH8.8Tris-HCl和500mM NaCl。
所述阴离子交换层析柱为二乙氨乙基琼脂糖阴离子交换层析柱(DEAESEPHAROSE FAST FLOW，120×50mm)。
上述方法纯化的豆科植物活性多肽PT蛋白组分的氨基酸序列为-ASCNGVCSPFEMPPCGTSACRCIPVGLVIGYCRNPSG-。
经纯化的PT蛋白组分进行蛋白序列测定，其组成的氨基酸序列如图3所示。该活性蛋白由37个氨基酸残基组成，分子量为3741.4Da。该氨基酸序列与Higgins于1986年发表来源于豌豆白蛋白亚组分1b(PA1b)序列表现出高度的相似性，只是所测定的PT蛋白序列在第29位氨基酸残基是缬氨酸，而在PA1b序列中第29位氨基酸残基为异亮氨酸。同时，该序列也与来源与大豆的豆类胰岛素氨基酸序列表现出很高的相似性65％。更重要的是，这三个蛋白的氨基酸序列中，都包含有6个在维持蛋白构象中起关键作用的半胱氨酸残基，而且其在氨基酸序列中的位置都高度保守地一致，并构成3个分子内二硫键，使蛋白空间结构高度紧密、异常稳定。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本发明对豌豆中具有对粮储害虫有毒杀作用的蛋白成分进行跟踪，进行逐步的分离、纯化，并对此活性组分的生理生化特性、蛋白质组成等进行分析，为下一步进行DNA的异源重组，构建出能够表达活性成分的基因工程菌提供必要的基础。通过将来的液体深层发酵来实现资源的工业化生产，以解决植物活性成分大规模应用中遭遇资源来源上受极大限制的关键问题，为打破到目前为止，在国内登记应用的植物杀虫剂的主要成分只有除虫菊素、鱼藤酮、烟碱、茼蒿素、大蒜素、印楝素、苦楝和川楝素等少数几个品种的尴尬局面提供了一条可喜的途径。
图1为DEAE琼脂糖阴离子交换柱纯化豌豆粉中活性蛋白的层析示意图。
图2为高压液相色谱Nucleosil-300 C18柱纯化活性成分DEAE II的层析示意图。
图3为纯化PT蛋白组分、PA1b蛋白和豆类胰岛素氨基酸组成的序列比较图。
图4为从豌豆粉中分离纯化的PT蛋白组分对米象(Sitophilus oryzae)的毒性实验图。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1(1)富含豌豆白蛋白的粗提物制备10kg的豌豆粉在搅拌的情况下与140升pH4.9的醋酸缓冲液混合，继续搅拌1小时。混合液于7500转/分的转速下进行离心分离。在温度低于25℃的条件下，上清液进行M5膜超滤；收集滤液用相同的膜重复超滤一次，所得滤液在6000转/分的转速下离心20分钟，收集上清液进行冷冻干燥。得到大约为物料量1％的粗提物冻干粉，用于后面不同组分的分离以及各组分的毒性试验。
(2)阴离子交换层析分离取步骤(1)所得粗提物冻干粉10克与100毫升60％的甲醇混合，并在4℃下搅拌1小时。然后在4℃，9000×g下离心30分钟，收集上清液，在旋转蒸发仪上真空干燥。然后在添加100毫升水和1M Tris-HCl缓冲液(pH8.8)，使Tris-HCl的终浓度为50mM。用二乙氨乙基琼脂糖阴离子交换层析柱(DEAE SEPHAROSE FAST FLOW，120×50mm)进行分离可溶的蛋白组分。吸附蛋白组分在缓冲液A(Tris-HCl 50mM，pH8.8)与缓冲液B(Tris-HCl 25mM，pH8.8，NaCl 250mM)的混合作用下析出。洗脱缓冲液流速为20ml/min，在280nm波长下有吸收的组分收集体积共为80ml(如图1所示)，分别对应了洗脱时间为300min和600min两个主要的紫外吸收峰，即DEAE II(300min)和DEAE I(600min)。而只有对层析柱没有吸附的DEAE II组分包含了粗提物的全部毒性。将DEAE II组分进行水透析72小时，然后进行冷冻干燥，可获得大约450mg的冻干粉。
(3)HPLC的反相层析经二乙氨乙基琼脂糖阴离子交换层析柱分离得到的活性组分DEAE II，再进行反相HPLC(RT-HPLC)层析分离。分离柱为5μNucleosil-300 C18(Hypersil)，洗脱液采用线性梯度乙腈(20％～100％，V/V，内含0.04％三氟乙酸)，流速3ml/min。洗脱程序为t＝0min，40％缓冲液B(乙腈，内含0.04％三氟乙酸)；t＝5min，40％缓冲液B；t＝17min，48％缓冲液B；t＝18min，80％缓冲液B，t＝23min，80％缓冲液B。层析过程如图2所示。对析出的各组分进行测定，结果发现只在F1吸收峰和PT吸收峰(滞留时间为14min左右的PT吸收峰组分)出现蛋白毒性。分别对这两组分洗脱液进行收集，在旋转真空干燥仪中进行干燥，分别得到4mg的PT蛋白组分和5mg的F1蛋白组分。
(4)纯化活性蛋白组分的序列分析经纯化的PT组分送样进行蛋白序列测定，其组成的氨基酸序列如图3所示。该活性蛋白由37个氨基酸残基组成，分子量为3741.4Da。该氨基酸序列与Higgins于1986年发表来源于豌豆白蛋白亚组分1b(PA1b)序列表现出高度的相似性(HIGGINS et al，J.Biol.Chem.，261(24)，pp11124-11130，1986)，只是所测定的PT蛋白序列在第29位氨基酸残基是缬氨酸，而在PA1b序列中第29位氨基酸残基为异亮氨酸。同时，该序列也与来源与大豆的豆类胰岛素氨基酸序列表现出很高的相似性65％。更重要的是，这三个蛋白的氨基酸序列中，都包含有6个在维持蛋白构象中起关键作用的半胱氨酸残基，而且其在氨基酸序列中的位置都高度保守地一致，并构成3个分子内二硫键，使蛋白空间结构高度紧密、异常稳定。如图3中所示。
(5)活性蛋白组分的粮储象虫的毒性测定实验室中，象鼻虫(Sitophilusoryzae)在27.5℃和70％的相对湿度下生长，喂食小麦或豌豆。实验用象鼻虫约培养近30代。
将步骤(3)中得到的100μg PT蛋白组分溶于167μl水中，然后将其与250mg小麦粉混合，制成小团，充分干燥后，分别给30个抗性和敏感性成虫喂食，每天观察象鼻虫死亡个数，直到敏感性虫死亡率达到95％。分析其半致死剂量LC50发现，该蛋白组分和天然豌豆粉一样具有对粮储象虫同等的毒杀能力。结果如图4所示。
SEQUENCE LISTING<110>华南理工大学<120>一种豆科植物活性多肽的分离提取方法及其氨基酸序列<130>31<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>37<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>豆科植物活性多肽的氨基酸序列<400>1Ala Ser Cys Asn Gly Val Cys Ser Pro Phe Glu Met Pro Pro Cys Gly1 5 10 15Thr Ser Ala Cys Arg Cys Ile Pro Val Gly Leu Val Ile Gly Tyr Cys20 25 30Arg Asn Pro Ser Gly3权利要求
1.一种豆科植物活性多肽的分离提取方法，其特征在于包括如下步骤(1)豌豆蛋白粗提物的制备将豌豆粉与pH4.9醋酸缓冲液搅拌混合，配制成浓度为8.0％的混合液，在温度低于25℃的条件下，混合液进行离心分离，取上清液进行膜超滤，再将滤液离心，收集上清液进行冷冻干燥，可得到粗提物冻干粉；(2)对粗提物的离子交换树脂层析分离将粗提物冻干粉与60％的甲醇混合，混合浓度为10％；在4℃下搅拌，然后离心分离，收集上清液，真空干燥；然后再添加水和Tris-HCl缓冲液，使Tris-HCl的终浓度为50mM；用阴离子交换层析柱分离可溶的蛋白组分；吸附蛋白组分在缓冲液A与缓冲液B的混合作用下析出；洗脱缓冲液流速为20ml/min，在280nm波长下收集DEAE II；所述缓冲液A为50mM pH8.8 Tris-HCl；所述缓冲液B为25mM pH8.8 Tris-HCl和250mM NaCl；(3)对分离组分的反相HPLC层析纯化经阴离子交换层析柱分离得到的活性组分DEAE II，再进行反相HPLC层析纯化分离；对PT吸收峰组分洗脱液进行收集，真空干燥，得到豆科植物活性多肽PT蛋白组分。
2.根据权利要求1所述的一种豆科植物活性多肽的分离提取方法，其特征在于所述步骤(3)中反相HPLC层析分离色谱条件分离柱为5μNucleosil-300C18，洗脱液采用线性梯度乙腈，流速3ml/min；洗脱程序为t＝0min，40％缓冲液B；t＝5min，40％缓冲液B；t＝17min，48％缓冲液B；t＝18min，80％缓冲液B，t＝23min，80％缓冲液B；所述缓冲液B为50mM pH8.8 Tris-HCl和500mM NaCl。
3.根据权利要求1所述的一种豆科植物活性多肽的分离提取方法，其特征在于所述阴离子交换层析柱为二乙氨乙基琼脂糖阴离子交换层析柱。
4.权利要求1所述的豆科植物活性多肽的分离提取方法纯化的豆科植物活性多肽，其特征在于所述豆科植物活性多肽的氨基酸序列为-ASCNGVCSPFEMPPCGTSACRCIPVGLVIGYCRN PSG-。
5.根据权利要求4所述的豆科植物活性多肽，其特征在于所述豆科植物活性多肽由37个氨基酸残基组成，分子量为3741.4Da。
全文摘要
本发明公开了一种豆科植物活性多肽的分离提取方法，该方法包括豌豆蛋白粗提物的制备；对粗提物的离子交换树脂层析分离；对分离组分的反相HPLC层析纯化。本发明对豌豆中具有对粮储害虫有毒杀作用的蛋白成分进行跟踪，进行逐步的分离、纯化，并对此活性组分的生理生化特性、蛋白质组成等进行分析，为下一步进行DNA的异源重组，构建出能够表达活性成分的基因工程菌提供必要的基础。
文档编号C07K14/415GK101029076SQ20071002655
公开日2007年9月5日 申请日期2007年1月26日 优先权日2007年1月26日
发明者张毅, 许喜林 申请人:华南理工大学