专利名称：通过载体核酸增强核酸扩增的特异性的制作方法
技术领域：
本发明涉及扩增核酸的方法，尤其是用于传染性微生物的诊断试验中的方法。
使用聚合酶链式反应(PCR)的对核酸序列的扩增需要至少两个与靶核酸中的不同序列杂交的寡核苷酸扩增引物。通常，希望避免使用在其3’末端具有同源序列的寡核苷酸引物。具有同源3’末端的引物可能相互杂交，产生各种扩增人为结构，包括引物二聚体。
一旦所有PCR反应成分被混合，但是在扩增开始前，通过由于在反应混合物中镁的存在，低温下稳定引物杂交物，可发生具有3’末端互补性的引物的杂交。在室温或低于室温下，通过DNA聚合酶延伸杂交的引物导致引物-二聚体的形成。与引物和聚合酶的靶核酸发生竞争，产生的引物-二聚体产物在PCR期间将扩增。如果在起始期形成引物-二聚体产物，该产物随后的PCR扩增可竞争超过指定的靶，导致(i)阴性的阴性结果，即当实际上序列存在时，样品看来缺乏特定的序列或(ii)“未检测出”的结果，即从内部阳性对照中没有获得信号。
除开引物组的一级序列，引物-二聚体形成的主要贡献者为分析特异性标准混合物(ASMM)中高摩尔水平的引物；加入反应物的顺序(例如加入ASMM，接着MgCl2溶液，随后靶/样品将促进引物-二聚体的形成)；将MgCl2加入到ASMM至加入靶之间的保温期；和在PCR热循环开始前，保温全部扩增反应混合物，即包含所有扩增所需成分，包括靶和聚合酶的时间段。
业已知一些减少引物和聚合酶的核酸扩增混合物中引物-二聚体形成的方法。这些方法包括；1.仔细设计PCR引物以将其与特定反应混合物中所有其它引物的3’-末端同源性减至最小。然而，在多重反应，即包含一些针对不同的靶核酸序列的扩增引物对的反应中，该方法是困难的。而且，即使使用一个引物对，由于其它制约因素，如相同或保守的区域，实现它可能很困难。
2.在制备分析特异性反应混合物后立即进行热循环/扩增反应以减少可用于引物-二聚体形成的时间。然而，这在实践中可能很困难，尤其是如果将筛选大量的样品时。
3.改变加入试剂的顺序以使可能的引物-二聚体去稳定。例如，加入MgCl2作为最后的成分可减少引物-二聚体的形成。然而，该方法是不希望的，因为(i)它未消除引物-二聚体的形成，(ii)它不方便，和(iii)它可能导致来自样品中的靶对氯化镁溶液的污染。
4.使用“触发”抗体，它为在可能形成引物-杂交物的温度下阻断聚合酶活性，但在高温下被灭活的抗聚合酶抗体。因此，聚合酶仅在太高而不能形成引物-二聚体的温度下活化(参见美国专利号5,338,671和5,587,287；和欧洲专利申请号0592935)。然而，由于抗体/聚合酶结合是一个平衡过程，不能实现所有聚合酶的完全结合。因此，基于抗体的PCR触发不需是100％有效，尤其是在复杂的扩增反应中。
5.进行热启动PCR(Chou等，核酸研究201717-1723，1992)。这包括将除开热稳定DNA聚合酶外的所有成分加入至反应混合物中，用产物变性步骤启动反应，接着打开反应试管并将聚合酶加入至反应混合物中。虽然该方法在减少引物-二聚体形成中有效，但由于许多原因，它在实践上是不可行的。最明显的是，它极为麻烦并明显增加扩增子遗留的可能性。
6.使用热稳定DNA聚合酶进行热启动PCR，如AmpliTaq Gold，它直至加热才相对活化(参见欧洲专利申请号624641和美国专利号5,4910,86)。然而，AmpliTaq Gold在低温下保留明显残余的酶活性，因此仍易产生副产物。
这些方法可预测性地认为在消除引物-二聚体形成中均不成功。仔细的引物设计和AmpliTaq Gold的使用或触发抗体并结合Taq聚合酶可减少引物-二聚体形成，但未消除它。因此，现有技术需要改进的用于在PCR反应，尤其是多重反应中进一步减少或消除引物-二聚体形成的方法。
本发明提供提高靶核酸扩增特异性的方法。它可用于所有需要特异于靶和核酸聚合酶的寡核苷酸扩增引物的反应中。因此，在一个方面，本发明涉及一种在扩增反应中提高靶核酸扩增特异性的方法，其中扩增反应混合物包含一种或多种特异于靶的寡核苷酸扩增引物，核酸聚合酶和一种或多种镁盐，该方法包括制备包含一种或多种引物和载体核酸的引物-载体混合物，并将引物-载体混合物与靶核酸，一种或多种镁盐和聚合酶接触。
另一个方面，本发明涉及一种在扩增反应中提高靶核酸扩增特异性的方法，其中扩增反应混合物包含一种或多种特异于靶核酸的寡核苷酸扩增引物，Taq聚合酶和氯化镁，该方法包括制备包含一种或多种引物和包括牛胸腺DNA的载体核酸的引物-载体混合物，其中载体核酸的浓度变化范围为约1至约100μg/ml扩增反应混合物，并在小于约100EC的温度下，将引物-载体混合物与靶核酸，Taq聚合酶和氯化镁接触。
另一个方面，本发明涉及一种在扩增靶核酸的反应中降低非靶核酸的聚合酶延伸的方法，其中扩增反应混合物包含一种或多种特异于靶核酸的寡核苷酸扩增引物，聚合酶和一种或多种镁盐，该方法包括制备包含一种或多种扩增引物和载体核酸的寡核苷酸引物-载体核酸混合物，并将引物-载体混合物与靶核酸，聚合酶和镁盐接触。
在第四个方面，本发明涉及一种在扩增靶核酸的反应中降低非靶核酸的聚合酶延伸的方法，其中扩增反应混合物包含一种或多种特异于靶的寡核苷酸扩增引物，聚合酶和一种或多种镁盐，该方法包括制备包含一种或多种引物和载体核酸的引物-载体核酸混合物，并将引物-载体混合物与靶核酸，聚合酶和镁盐接触。
任何核酸可被用作载体核酸，包括DNA，RNA和肽核酸。优选地，载体为DNA，最优选牛胸腺DNA。通常，加入载体使在最终扩增反应混合物中的浓度为约1至约100μg/ml之间，优选约5至约75μg/ml之间，最优选约25至约50μg/ml之间。
本发明的方法在扩增活性期间减少非靶核酸的聚合酶延伸中尤为有利。当扩增反应混合物保持在启动扩增反应之前使靶核酸变性所需温度以下(即低于100EC)时，该方法尤为有用。这些条件包括例如将扩增反应混合物保持在室温下或稍低于室温达约1至约24小时。
本发明基于此发现，即将载体核酸加入至核酸扩增混合物中显著增加靶核酸扩增的功效和特异性。具体地说，本发明的方法在扩增分析中通过在热循环中升高扩增混合物的温度之前降低引物-二聚体形成的量导致非靶核酸的聚合酶延伸减少。
分子生物学、微生物学、重组DNA和蛋白质生物化学中的许多技术被用于实施本发明，如Sambrook等，1989，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约；DNA克隆；实验方法，卷I和II，1985(D.N.Glover编)；寡核苷酸合成，1984，(M.L.Gait编)；转录和转译，1984(Hames和Higgins编)；分子克隆实验指导；丛书，酶学方法(Academic Press，Inc.)；和蛋白质纯化原理和实践，第二版(Springer-Verlag，N.Y.)所述的方法。
本文所用的扩增反应混合物指为足以能进行核酸扩增反应的量的至少扩增引物，靶核酸，脱氧核苷酸，聚合酶，一种或多种镁盐和缓冲液的扩增-活性混合物。
本文所用的“核酸”或“多核苷酸”指任何长度的包含嘌呤和嘧啶的聚合物，多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸或混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。这包括单链和双链分子，如DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA杂交物，以及通过将碱基结合至氨基酸骨架上形成的“肽核酸”(PNA)。这还包括包含修饰碱基的核酸。
本文所用的“互补”核酸序列指参与与原始序列Watson-Crick碱基配对的反义序列。
本文所用的“引物”为长度为约6至约50个核苷酸的寡核苷酸，优选为约12至约25个核苷酸长度，最优选约12至约18个核苷酸长度，它与感兴趣的单链核酸序列形成双螺旋并使用例如逆转录酶或DNA聚合酶使互补链聚合。
本文所用的扩增指复制核酸的重复过程。适宜的扩增方法包括但不限制于聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链置换扩增、核酸单碱基扩增和转录介导扩增。
本文所用的“靶核酸”指核酸模板、在PCR反应期间扩增的亚序列。
内部阳性对照(IPC)靶核酸为克隆至随后通常通过限制性内切酶作用被线性化的质粒载体中的合成核酸序列。IPC通常在属探针结合区周围具有多个引物结合序列，并起与核酸扩增反应中的阴性结果相对的属对照的作用。
优选的内部阳性对照靶DNA的序列为5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATTGAACGCACAGGCGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3’(SEQ ID NO1)
本发明可用于其中将一个或多个寡核苷酸与靶核酸保温以与靶核酸杂交并引发靶核酸的酶复制的任何反应中。这些反应包括例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应、链置换扩增、核酸单碱基扩增和转录介导扩增。
在这些反应中，制备分析特异性标准混合物，其中包含寡核苷酸引物，缓冲液和盐，脱氧核苷酸和任选其它成分。接着加入靶核酸，随后加入酶，例如催化反应的Taq聚合酶和/或为反应进程所必需的镁盐，例如氯化镁。
适用于本发明方法的其它成分包括，但不局限于抗聚合酶抗体，它在低温下与聚合酶结合并使之失活，但在高温下其本身失活，因此在高温下可活化聚合酶。外切核酸酶和糖基化酶也可包括在反应混合物中。
在进行本发明中，在与靶核酸聚合酶或镁盐混合之前，将寡核苷酸引物与载体核酸接触。
根据本发明的载体核酸可包含任何核酸，包括，但不局限于原核或真核DNA和/或RNA、合成DNA和/或RNA，或随机和/或特异性PNA(肽核酸)。优选载体包含DNA，最优选牛胸腺DNA。
用于本发明的载体核酸可通过常规方法制备。例如，可通过去蛋白作用从细胞中分离DNA或RNA。可使用例如Matteucci等1981，美国化学会志1033185的亚磷酰胺固体载体法，Yoo等，1989生物化学杂志76417078的方法或其它已知方法来化学合成DNA。也可通过现有技术已知的任何方法修饰用于本发明的核酸。这些修饰的非限制性实例包括甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然产生的核苷酸，和核苷酸内的修饰，如具有不带电荷键合的那些(例如磷酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸盐、碳酸盐等)或带电荷键合的那些(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。核酸可包含一个或多个其它共价连接的部分，如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、单肽、聚-L-赖氨酸)、嵌入剂(例如丫啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如金属、放射性金属、铁、氧化性金属等)和烷基化剂。可通过形成磷酸三甲酯或磷酸三乙酯或氨基磷酸烷基酯键衍生核酸。可通过例如Eckstein等生物化学年鉴54367(1985)；Zon等，抗癌药物设计6539(1991)；和Olson等，PNAS 831451(1990)描述的方法合成硫醇化的扩增引物，其中磷酸基团的一个或多个氧原子被一个硫原子置换。
将载体核酸以足够的量加入至包含引物的标准混合物中以致载体核酸在扩增反应体积中的最终浓度范围为约1至约100μg/ml，优选约5至约75μg/ml，最优选约25至约50μg/ml。反应中的引物的通常量为浓度范围为约0.1至约1M。载体的最佳量可对于具体的分析独立确定。可通过将增加量的载体核酸加入至标准化的标准混合物中，加入靶核酸和酶，接着随着反应监测特异性和非特异性扩增产物的水平(参见例如下面实施例1)来进行该测定。
在加入靶核酸之前，优选将载体核酸与寡核苷酸引物混合。接着将引物-载体混合物与靶核酸，催化扩增反应的聚合酶和聚合酶有效作用所必需的镁盐混合。通常，在启动扩增反应前，将反应混合物保持在小于约90至约100EC的温度下。优选地，通过热循环进行扩增，在启动热循环之前，将混合物的温度保持小于约90至约100EC。最优选，在启动扩增反应前，将反应混合物保持在约室温下。
不希望受理论所约束，认为引物-二聚体的形成通过一些不同的机理进行。首先，聚合酶与载体核酸结合。当抗聚合酶抗体也存在于混合物中时这尤为有利，因为不被抗聚合酶抗体结合的聚合酶分子与载体核酸结合，因此进一步减少可能存在的任何杂交引物延伸的可能性。第二，载体核酸被认为降低了混合物中的杂交引物的数量，因为引物将也对载体DNA微弱地退火。在PCR的靶扩增期，从引物与载体核酸结合形成的非特异性延伸产物不扩增，因为这些非特异性位点的配对引物不存在。因此，减少了引物-二聚体的形成(和其它非特异性核酸产物的形成)。
下面的实施例意在非限制性地说明本发明。实施例1载体核酸对HIV序列的PCR扩增的作用进行下面的实验以监测将载体核酸加入至HIV扩增反应中的作用。
配制包含表1所示11种引物，Tris缓冲液、dNTPs，AmpliTaq和两种AmpliTaq触发抗体(美国专利5,338,671和5,587,287；欧洲专利号0592035)的标准混合物。制备不包含和包含牛胸腺DNA的标准混合物(分别为组I和组II)。
向组I和组II标准混合物的501等份试样中加入25116mM MgCl2中，接着加入25l靶混合物(包含13.3拷贝的内部阳性对照靶核酸的20mM NaOH溶液)。对于每一组，采用三种不同的实验方法，它们示于下面表2中
I(a，b，c)＝在标准混合物中没有载体DNAII(a，b，c)＝在标准混合物中的载体(牛胸腺)DNA在被设计为A的一组反应混合物中，IPC引物为未硫醇化的，而在被设计为B的第二组中，IPC引物被硫醇化。
重复进行所用反应。将75l等份试样的混合物加入至空白核酸盒(OrthoClinical Diagnostics，Rochester，NY)中。PCR扩增条件如下(1)96 EC 3分钟以使DNA和AmpliTaq触发抗体完全变性；(2)5个循环的96EC，5秒，接着为62 EC 40秒；(3)35个循环的96 EC，5秒，接着为68 EC 40秒。将扩增产物从盒中取出并在4％琼脂糖上在Tris-硼酸缓冲液中电泳分离。使用溴化乙啶染色检测扩增的DNA产物。
通过肉眼检测凝胶照相(表3)中的特异性(IPC)和非特异性产物(引物-二聚体和其它阴性的引导产物)的强度来评价实验结果。特异性和非特异性产物带的强度以0-10的等级肉眼进行评价，其中0代表不存在可检测的带，′10′代表最大强度。NA代表未评价。
>在所有三个亚组中(a-c)，组II扩增反应产生与组I相比更强特异性产物带和较弱的非特异性产物的带。这对于实验的A部分(采用未硫醇化的IPC引物)以及实验的B部分(采用硫醇化的IPC引物)是如此。在所有四组中，随着混合物放置在逐渐有利于引物-二聚体形成的条件下(a-c)，包括在热循环前将混合物在室温下保温约4小时，引物-二聚体产物水平增加，特异性产物水平降低。相反，在II-c反应中见到深的产物带和成比例极少的引物-二聚体产物。最后，虽然IPC引物的硫醇化(B部分)导致弱微增加的特异性产物的合成，这几乎不与含有载体核酸的标准混合物制备物一样有效。
本文提及的所有专利，申请，文章，公开物和试验方法在此全文被引作参考。
根据上面的详细描述，对于本领域技术人员来讲，本发明的许多变化是显而易见的。这些显而易见的改变落在所附权利要求书的全部指定范围内。
权利要求
1.一种提高扩增反应中靶核酸扩增特异性的方法，其中扩增反应试剂包含一种或多种特异于靶核酸的寡核苷酸扩增引物、靶核酸、核酸聚合酶和一种或多种镁盐，该方法包括(a)制备包含一种或多种寡核苷酸扩增引物和载体核酸的引物/载体混合物，和(b)并将所述引物/载体混合物与靶核酸、一种或多种镁盐和核酸聚合酶接触。
2.权利要求1所述方法，其中所述载体核酸选自DNA、RNA和肽核酸(PNA)。
3.权利要求2所述的方法，其中所述DNA为牛胸腺DNA。
4.权利要求1所述的方法，其中所述载体核酸以约1至约100μg/ml的浓度存在于所述扩增反应中。
5.权利要求4所述的方法，其中所述载体核酸以约5至约75μg/ml的浓度存在于所述扩增反应中。
6.权利要求1所述的方法，其中在启动扩增反应前，将所述混合物保持在小于约90至约100EC的温度下。
7.权利要求6所述的方法，其中在启动热循环前，保持所述温度。
8.权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶包括Taq聚合酶。
9.权利要求1所述的方法，其中所述镁盐包括氯化镁。
10.权利要求1所述的方法，其中所述混合物进一步包含选自抗聚合酶抗体、外切核酸酶、糖基化酶中的一个成员或它们的混合物。
11.一种提高扩增反应中靶核酸扩增特异性的方法，其中扩增反应试剂包含一种或多种特异于靶核酸的寡核苷酸扩增引物，Taq聚合酶和氯化镁，该方法包括(a)制备一种引物-载体混合物，它包括一种或多种引物和含有牛胸腺DNA的载体核酸；和(b)并将所述引物-载体混合物与靶核酸、Taq聚合酶和氯化镁接触；其中载体核酸在所述扩增反应中的浓度范围为每ml扩增反应体积约1至约100μg。
12.一种在用于扩增靶核酸的反应中降低非靶核酸的聚合酶延伸的方法，其中扩增反应试剂包含一种或多种特异于所述所述靶的寡核苷酸扩增引物、聚合酶和一种或多种镁盐，该方法包括(a)制备包含一种或多种扩增引物和载体核酸的寡核苷酸引物-载体核酸混合物，(b)将该引物-载体混合物与靶核酸、聚合酶和一种或多种镁盐接触。
13.权利要求12所述方法，其中所述载体核酸选自DNA、RNA和肽核酸(PNA)。
14.权利要求13所述方法，其中所述DNA为牛胸腺DNA。
15.权利要求12所述的方法，其中所述载体核酸以约1至约100μg/ml的浓度存在于所述扩增反应中。
16.权利要求15所述的方法，其中所述载体核酸以约5至约75μg/ml的浓度存在于所述扩增反应中。
17.权利要求16所述的方法，其中在启动扩增反应之前，将所述混合物保持小于在约90至约100EC的温度下。
18.权利要求17所述的方法，其中在启动热循环前，保持所述温度。
19.权利要求12所述的方法，其中所述聚合酶包括Taq聚合酶。
20.权利要求12所述的方法，其中所述镁盐包括氯化镁。
21.权利要求12所述的方法，其中所述混合物进一步包含选自抗聚合酶抗体、外切核酸酶、糖基化酶中的一个成员或它们的混合物。
22.一种在用于扩增靶核酸的反应中减少形成引物-二聚体或其它非特异性核酸扩增产物的方法，其中扩增反应试剂包含一种或多种特异于所述靶的寡核苷酸扩增引物、聚合酶和一种或多种镁盐，该方法包括(a)制备包含一种或多种引物和载体核酸的引物-载体核酸混合物；和(b)将该引物-载体混合物与靶核酸、聚合酶和镁盐接触；其中在将所述引物与一种选自聚合酶、一种或多种镁盐及其混合物的成员接触之前制备所述引物-载体混合物。
23.权利要求22所述方法，其中所述载体核酸选自DNA、RNA和肽核酸(PNA)。
24.权利要求23所述方法，其中所述载体核酸为DNA。
25.权利要求24所述的方法，其中所述DNA为牛胸腺DNA。
26.权利要求22所述的方法，其中所述载体核酸以约1至约100μg/ml的浓度存在于所述扩增反应中。
27.权利要求26所述的方法，其中所述载体核酸以约5至约75μg/ml的浓度存在于所述扩增反应中。
28.权利要求22所述的方法，其中在启动扩增反应之前，将所述混合物保持在低于约90至约100EC的温度下。
29.权利要求28所述的方法，其中在启动热循环前，保持所述温度。
30.权利要求22所述的方法，其中所述聚合酶包括Taq聚合酶。
31.权利要求22所述的方法，其中所述镁盐包括氯化镁。
32.权利要求22所述的方法，其中所述混合物进一步包含选自抗聚合酶抗体、缓冲液、脱氧核苷酸三磷酸、外切核酸酶、糖基化酶中的一个成员或它们的混合物。
33.权利要求6所述方法，其中所述温度约为室温。
34.权利要求17所述方法，其中所述温度约为室温。
35.权利要求28所述方法，其中所述温度约为室温。
全文摘要
本文公开了改进的扩增核酸的方法。这些方法包括一种提高扩增反应中靶核酸扩增特异性的方法,其中反应试剂包含一种或多种特异于靶核酸的寡核苷酸扩增引物,靶核酸、核酸聚合酶和一种或多种镁盐,该方法包括:(a )制备包含一种或多种寡核苷酸扩增引物和载体核酸的引物/载体混合物,和(b )并将引物/载体混合物与靶核酸,一种或多种镁盐和核酸聚合酶接触。
文档编号C12Q1/68GK1271019SQ00104638
公开日2000年10月25日 申请日期2000年2月3日 优先权日1999年2月3日
发明者G·M·普雷斯顿, J·W·巴库斯 申请人:奥索临床诊断有限公司