专利名称：特异性抑制特定dna模板扩增的方法和基于该方法的一步定点诱变方法
技术领域：
本发明涉及一种特异性抑制特定DNA模板扩增的方法和基于该方法的一步定点诱变(One-step site-directed mutagenesis)方法。
背景技术：
现有的PCR扩增方法中，如果需要扩增多个DNA模板时，必须在一种DNA模板扩增完成后，去除这种DNA模板，然后再加入后续反应所需的模板。因此，要得到所需最终产物，必须经过多个PCR反应。这样，需要多次纯化中间产物并造成PCR反应的中断，会增加试验费用和工作量，给研究者带来极大的不利。
以PCR为基础的定点诱变技术属于一种在基因水平的、精确的体外诱变方法。常用于推断单个或多个氨基酸残基在蛋白质结构、催化活性或配基结合能力中的作用。
已报道的基于PCR的定点诱变(PCR-based，site-directedmutagenesis)方法，就实用性而言，有两种方法非常突出(Joseph Sambrooket al.，Molecular Cloning.A laboratory manual.Third edition.Chapter 1335)重叠延伸诱变方法(overlap extension mutagenesis)(Higuchi et al.，Nucleic Acids Res.，1988，167351；Ho et al.，Gene.，1989，7751)和大引物诱变方法(megaprimer mutagenesis)(Kammann et al.，NucleicAcids Res.，1989，175404；Sarkar et al.，BioTechniques.，1990，8404；Nucleic Acids Res.，1992，204937；Giebel et al.，Nucleic Acids Res.，1990，184947；Landt et al.，Gene.，1990，96125；Ke et al.，NucleicAcids Res.，1997，253371)。重叠延伸诱变方法的优点是诱变效率高，但是费时费力，需要多轮PCR反应和多次纯化回收，造成实验费用的增加和实验室工作的紧张。现在的大引物诱变方法由于可以做到无需“纯化和回收，，这一中间实验步骤，从实践上大大克服了上述重叠延伸诱变方法的不足。
大引物诱变方法是Kammann等人在1989年提出的，随后历经Sarkar和Sommer(1990，1992)，Giebel和Spritz(1990)以及Landt等人(1990)加以改进，但仍然存在费时费力的不足，难以推广应用。直到1997年，Ke和Madison等人(Ke et al.，Nucleic Acids Res.，1997，25；3371)设计出两条具有显著不同解链温度(melting temperature，Tm)的侧翼引物(flanking primer)，这种侧翼引物需通过先后两次加入反应管，引导两轮PCR，产生出目的突变体(targeted mutation or desired mutant)，大引物诱变技术才得以简化。这种方法由于可以做到无需“纯化和回收”这一中间实验步骤而呈现出实用、简单的特点。但是，该方法仍然存在需要两轮PCR且诱变效率只有82％的不足，同时，利用该方法产生出突变体通常需要挑选6个左右的转化子进行序列认证，同样造成实验费用的增加和实验室后期工作的紧张(Joseph Sambrook et al.，Molecular Cloning.Alaboratory manual.Third edition.Chapter 1335)，也常为研究者工作带来不可避免的不便。
现有的基于PCR的定点诱变方法，有一个共同的不足就是不能实现“一步”诱变。所谓“一步”诱变是指在反应开始时加入所有反应成分，在反应终止时获得诱变产物，反应过程中无需人工干预。同时，现有的各种方法，诱变效率都无法达到100％，因此，需要挑选转化子进行序列认证。因此，目前人们特别希望有一种能够实现“一步”诱变的方法，也希望能够提高诱变效率。
发明内容
通过研究，发明人设计出了一种特异性抑制特定DNA模板扩增的方法，该方法通过控制PCR扩增反应体系的温度为模板DNA的复性温度(Tra，reannealing temperature，其定义如下)±2℃的温度，使得反应体系中的模板DNA特异性双链化，而反应体系中的其余DNA不能同时实现双链化若(Gi+Ci)％＜(G+C)％，Tra＝{0.41*(Gi+Ci)％-[(Ai+Ti)％-(A+T)％]}*l00+69.3若(Gi+Ci)％＞(G+C)％，Tra＝0.4*(Gi+Ci)％*100+69.3-4.1其中，上述的Ai、Ti、Gi、Ci是指目的扩增区段的碱基；A、T、G.、C是指模板DNA的碱基。
所述Tra为模板DNA的复性温度(reannealing temperature)，即热变性的单链状态的同源DNA在重退火过程中形成完整双链分子所需的最高重退火温度。在本发明的方法中，由于核酸的热稳定性原因，为了达到模板DNA特异性双链化目的，所使用的模板DNA的复性温度可以是在上述限定的Tra数值上下变动-所变动的温度范围内的温度值通常是随反应体系中的模板量决定。
基于上述特异性抑制特定DNA模板扩增的方法，发明人设计了一种新的PCR诱变方法，该方法可以实现前述的“一步诱变”，而且，诱变效率可以达到100％。
本发明提供一种基于PCR的定点诱变方法，该方法将至少一条诱变引物和两条侧翼引物与其他PCR成分一次加入同一反应管后，通过PCR反应直接获得诱变的扩增DNA片段，其中所述诱变引物的解链温度显著高于侧翼引物的解链温度，所述方法包括以下步骤A)第一轮PCR反应，其中，在高温下进行退火，使得只有诱变引物与模板DNA结合并得到延伸，从而获得含有诱变引物的第一扩增片段；B)第二轮PCR反应，其中，首次循环分两步进行退火，第一步退火在模板DNA复性温度±2℃的温度下进行，使得模板DNA重新结合形成双链，而第一扩增片段保持单链状态，第二步退火在低温下进行，使得侧翼引物与第一扩增片段结合并以其为模板得到延伸，从而获得含有该侧翼引物的第二扩增片段；该轮反应中随后的循环都在模板DNA复性温度±2℃的温度下进行变性，使得模板DNA保持双链状态，而第一扩增片段形成单链，然后在与上述首次循环第二步退火相同的温度下进行退火，使得同一侧翼引物与第一扩增片段结合并以其为模板得到延伸，从而获得含有该侧翼引物的第二扩增片段；C)第三轮PCR反应，其中，在高温下进行退火，使得只有第二扩增片段单链与模板DNA结合并得到延伸，从而获得含有突变位点的第三扩增片段，即单链型突变体全长扩增片段；D)第四轮PCR反应，其中，首次循环分两步进行退火，第一步退火在模板DNA复性温度±2℃的温度下进行，使得模板DNA重新结合形成双链，而第三扩增片段保持单链状态，第二步退火在低温下进行，使得侧翼引物与第三扩增片段结合并以其为模板得到延伸，从而获得双链型突变体全长扩增片段；该轮反应中随后的循环都在模板DNA复性温度±2℃的温度下进行变性，使得模板DNA保持双链状态，而第三扩增片段形成单链，然后在与上述首次循环第二步退火相同的温度下进行退火，使得侧翼引物与第三扩增片段结合并以其为模板得到延伸，从而获得双链型突变体全长扩增片段。
在本发明的具体实施方案中，所述诱变引物可以是一条，也可以是两条。使用两条诱变引物时，在第一轮PCR反应中，生成两种第一扩增片段，分别含有两种诱变引物。在第二轮PCR反应中，生成两种第二扩增片段，分别含有两种侧翼引物。
两条侧翼引物的解链温度可以相同或者相近，也可以有显著差异，只要它们显著低于诱变引物的解链温度即可。优选侧翼引物的解链温度为36℃至46℃。
侧翼引物和诱变引物的长度可以由本领域技术人员根据具体情形确定。一般侧翼引物的长度控制在14至16个碱基。而诱变引物的长度不少于23个碱基，而且，诱变位点两侧通常不少于8个寡核苷酸。
诱变引物的解链温度应显著高于侧翼引物，优选其解链温度在66℃以上。
本发明的方法可以实现“高诱变效率”和“无需纯化和回收”这两个优点的统一，可以达到“无需人工干预PCR诱变过程”，而实现自动化的诱变目的。使得定点诱变方法操作简单、可靠性好且省时、节力。尤其是在同时处理需要定点诱变的多个样品时，该方法有着不可替代的优势。
图1为梯度退火PCR产物凝胶电泳结果。其中，泳道MDNA MarkerDL2000；泳道1，53.5℃；泳道2，55.3℃；泳道3，57.5℃；泳道4，60.1℃；泳道5，62.8℃；泳道6，65.5℃；泳道7，68℃；泳道8，70.1℃；泳道9，71.6℃；泳道10，72.5℃。
图2a为实施例1中实验1的梯度变性PCR产物凝胶电泳结果。其中，泳道MDNA Marker DL2000；泳道1，79.8℃；泳道2，80.0℃；泳道3，81.1℃；泳道4，82.4℃；泳道5，84.0℃；泳道6，85.9℃；泳道7，87.9℃；泳道8，89.9℃；泳道9，91.5 ℃；泳道10，94.1 ℃。
图2b为实施例1中实验2的梯度变性PCR产物凝胶电泳结果。其中，泳道MDNA Marker DL2000；泳道1，94.1℃；泳道2，91.5℃；泳道3，89.9℃；泳道4，87.9℃；泳道5，85.9℃；泳道6，84.0℃；泳道7，82.4℃；泳道8，81.1℃；泳道9，80.0℃；泳道10，79.8℃
图3显示一种诱变引物的方法的示意图。
图4显示两种诱变引物的方法的示意图。
图5显示实施例2中方法1的凝胶电泳结果。
图6显示实施例2中方法2的凝胶电泳结果。
图7显示实施例2中方法1的测序结果。
图8显示实施例2中方法1定点诱变产物部分测序结果。
图9显示实施例2中方法2的测序结果。
图10显示实施例2中方法2定点诱变产物部分测序结果。
具体实施例方式
以下详述本发明方法的各个方面。具体而言，本发明的方法涉及以下几个方面1、引物的设计；2、模板复性温度理论；3、PCR反应策略。具体叙述如下一、引物的设计本发明的PCR诱变方法中涉及的引物有两种1、侧翼引物；2、诱变引物。侧翼引物是指与位于目的基因上游和下游的序列互补的一段寡核苷酸片段，分别称为正向侧翼引物和反向侧翼引物。诱变引物是指与位于目的基因上游和下游之间的序列互补的一段寡核苷酸片段，分别称为正向诱变引物和反向诱变引物，其中在特定位点引入了新的、不同的核苷酸残基以取代原核苷酸残基。
按Tm＝0.41*(G+C)％*100+69.3计算解链温度(Tm)值(Marmur，J.etal.，nature.1959，1831427；Marmur，J.et al.，J.Mol.Biol.1962，5109)。所有的侧翼引物Tm设计在36℃至46℃之间，长度控制在14至16个碱基；而所有的诱变引物Tm设计在66℃以上，长度不少于23个碱基，但是，诱变引物中诱变位点的两侧通常不少于8个寡核苷酸残基。
在本发明的PCR诱变方法中，由于侧翼引物的Tm显著低于诱变引物，因此，在PCR反应循环中，如果在高于诱变引物Tm的温度下进行退火，野生型的DNA模板与Tm值较高的诱变引物之间可以选择性地产生退火效应，而与两条Tm值较低的侧翼引物的任何一条之间都不会产生退火效应。为了验证我们的这一设想，我们进行了如下试验。
根据GENBANK所报道的人钙调磷酸酶B亚基(CNB)序列(L03554)和http∥www.merckbiosciences.com/docs/docs/PROT/pET-21a-gb.html所报道的质粒pET-21a序列，以CNB重组子为例，根据pET-21a的多克隆位点附近的碱基序列设计侧翼引物，反应是通过一个梯度PCR反应体系和一个梯度退火PCR进行，说明如下。
侧翼引物序列的设计为反向侧翼引物5’-------CGGAGATATACATATG(SEQ ID NO.01)正向侧翼引物5’--------ATTGTCGACGGAGCT(SEQ ID NO.02)梯度PCR反应体系如下梯度PCR反应体系
反应条件如下1)94℃ 4分钟2)94℃ 45秒3)梯度退火 45秒4)72℃ 1分钟5)回到第2)步，重复30个循环6)72℃ 8分钟7)保存于4℃终产物经1.2％的琼脂糖胶分析，如图1，泳道MDNA MarkerDL2000；泳道1，53.5℃；泳道2，55.3℃；泳道3，57.5℃；泳道4，60.1℃；泳道5，62.8℃；泳道6，65.5℃；泳道7，68℃；泳道8，70.1℃；泳道9，71.6℃；泳道10，72.5℃.
在反应条件中“3)梯度退火”的温度如上所述，显然在泳道7，68℃至泳道10，72.5℃没有目的DNA的扩增产物。该试验说明，在较高温度下，侧翼引物不能与模板退火，从而无法得到扩增，即侧翼引物的活性在高温下受到了抑制。
二、模板复性温度理论以往的核酸研究发现，双链DNA在热变性的条件下可发生解链效应，由此Marmur等人提出了解链温度的计算方法即Tm＝0.41*(G+C)％*100+69.3，使得类似PCR的核酸变性问题得到了科学的解决。反之，热变性状态下的分开的同源DNA在重退火(reannealing)过程中可以形成完整的双链分子，所需的重退火温度称为DNA的复性温度(reannealing temperature，Tra)。在大量的实验中，我们发现当重组子的(G+C)％大于扩增子的(G+C)％时，扩增子的Tm和Tra的差值恰好是扩增子和重组子的(A+T)％差值的100倍；反之等于常数4.1。此等式以数学的语言表述如下当(Gi+Ci)％＜(G+C)％，Tra＝{0.41*(Gi+Ci)％-[(Ai+Ti)％-(A+T)％]}*100+69.3；当(Gi+Ci)％＞(G+C)％，Tra＝0.41*(Gi+Ci)％*100+69.3-4.1。
上述的Ai、Ti、Gi、Ci是指目的DNA所扩增区的碱基；A、T、G、C是指模板DNA的碱基。
基于我们的模板复性温度理论，在PCR循环中，如果反应体系中存在有多种DNA模板时，可以通过选择特定的温度，使得反应体系中特定的DNA模板在成为双链状态，从而不能被扩增。这就是本发明的特异性抑制特定DNA模板扩增的方法的原理。该方法可以用于在反应体系中存在有多种模板的各种方法中，尤其可以用于PCR诱变方法中。
更进一步，在PCR诱变反应中，变性后反应体系中存在有野生型模板DNA和另一种DNA时，如果先在野生型模板的Tra的温度下进行退火，则野生型模板DNA单链会结合形成双链，这样，反应体系中只存在有另一种DNA的单链，然后可以让引物与该DNA单链在合适温度下退火，从而实现对该DNA的特异性扩增。在接下来的循环中，则使用野生型模板的Tra作为变性温度，这样野生型模板仍保持双链状态，而扩增获得的DNA双链则打开形成单链，重复该步骤就可以实现对该DNA的特异性扩增。
在本发明的PCR诱变方法中，PCR循环中反应混合物中共存的两种DNA模板，一种是野生型质粒DNA模板；另一种是诱变引物来源的单链DNA模板，由于后者恰好是侧翼引物结合的目的诱变模板，因此，通过如上所述的温度选择，可以实现对诱变模板的特异性扩增。这样，使得一步产生定点诱变成为可能，同时也保证了诱变的高效性和可靠行。
本领域技术人员可以理解，上述限定的温度是实现发明效果的优选温度，偏离该限定温度一定值的特定温度也能够实现发明效果，即特异性抑制特定DNA模板的扩增。所述一定值可以是例如0.5℃、1℃、1.5℃或2℃甚至更多。该一定值的具体数值取决于使用的模板量，可以由本领域技术人员根据具体情形确定。
三、PCR反应策略结合上述的特定引物的设计和我们提出的模板复性温度理论，我们提出了具体的PCR反应策略。该反应策略可以实现在反应前一次加入所有反应成分，然后通过连续的四轮PCR循环，获得扩增的诱变产物。即，基于该反应策略，可以高效实现一步定点诱变。该反应策略详述如下。
1.第一轮PCR反应。在该轮PCR反应中，常规变性后，在高温下进行退火，使得只有诱变引物与模板DNA结合，然后按常规进行延伸，从而获得含有诱变引物的第一扩增片段。
该轮PCR反应中，变性、延伸步骤都按照常规(一般为94℃)进行，具体采用的反应条件取决于要扩增的片段和采用的引物，本领域技术人员可以根据具体反应确定合适的温度。
此处所谓“高温下退火”是在高于诱变引物的解链温度的温度下进行退火。具体采用的温度，根据不同的反应，可以由本领域技术人员考虑反应中的多种因素，如使用的引物，扩增的片段和使用的聚合酶，来具体确定。
由于诱变引物的解链温度显著高于侧翼引物，因此，在这种退火温度下，只有诱变引物结合模板DNA，而侧翼引物无法与模板DNA结合。因此，该轮PCR反应的结果是获得含有诱变引物的扩增片段。该扩增片段在第二轮PCR反应中将作为扩增的模板。
2.第二轮PCR反应。在该轮PCR反应中，首次循环中，在常规变性后，分两步进行退火，第一步退火在野生型模板DNA复性温度±2℃的温度下进行，第二步退火在低温下进行，然后常规进行延伸。其余PCR循环中，除不再进行上述首轮循环中的变性外，其余步骤同首轮循环。
在该轮PCR反应中，首次循环中先进行常规变性，使得反应体系中所有DNA包括野生型模板DNA和扩增获得的DNA都打开形成单链状态。然后在野生型模板DNA复性温度±2℃的温度下进行第一步退火，这样将使得打开成单链状态的模板DNA重新结合形成双链，而第一轮PCR反应中获得的扩增片段仍保持单链状态。野生型模板DNA的最高重退火温度可以按照本申请中提出的模板复性温度理论计算。
首次循环的第二步退火在较低的温度下进行，这样反应体系中的一条侧翼引物将和单链状态的第一轮PCR反应中获得的扩增片段结合。然后进行延伸，从而获得含有一条侧翼引物的新的扩增产物。
在接下来的PCR循环中，不再进行首次循环中的常规变性，而直接进入模板DNA复性温度±2℃的温度，此时，模板DNA仍保持双链状态，而新扩增产物和第一轮PCR反应的扩增片段结合的双链将在高温下被打开。也就是说，此时，首次循环中相对较高的野生型模板的最高重退火温度实际上起的作用是使得扩增片段变性。由于该变性温度相对于一般的变性温度较低，因此，此步在本文中也被称为“低温变性”。
在扩增的DNA片段打开成为单链之后，再在低温下退火，使得一条侧翼引物与单链状态的第一轮PCR反应中获得的扩增片段结合并得到延伸。因此，第二轮PCR反应的结果是获得含有侧翼引物的第二轮扩增片段。
3.第三轮PCR反应。这轮PCR反应实际上是重复第一轮PCR反应，只是与模板结合的引物不是诱变引物，而是在第二轮PCR反应中获得的扩增片段。该扩增片段作为大引物与模板DNA特异性结合并得到延伸，获得全长型单链突变体DNA，它将是下一轮PCR反应中的模板。
在第三轮PCR反应中，高温退火保证只有第二轮PCR反应获得的扩增片段与模板DNA结合，而侧翼引物将不与模板DNA结合，从而实现特异性扩增，避免侧翼引物与模板DNA结合后扩增得到的野生型扩增片段。
4.第四轮PCR反应。这轮PCR反应实际上是重复第二轮PCR反应，但是，作为模板的是第三轮PCR反应的产物，即全长型单链突变体DNA。PCR反应的结果是获得双链型突变体全长扩增片段。
在本发明方法中，诱变引物可以是一条，也可以是两条。
在使用两条诱变引物时，第一轮PCR反应将获得两种扩增片段。它们都将在接下来的第二轮PCR反应中作为扩增模板。在第二轮PCR反应中，第一轮PCR反应中获得的两种扩增片段都作为模板，反应体系中的两种侧翼引物分别与其结合并得到延伸，从而获得两种含有不同侧翼引物的新的扩增片段。在第三轮PCR反应中，第二轮PCR反应中获得的扩增片段分别作为大引物与野生型模板结合，延伸后获得两种全长型单链突变体扩增片段。第四轮PCR反应中，两种侧翼引物分别与两种全长型单链突变体扩增片段结合，延伸后获得双链型全长突变体扩增片段，即目标诱变产物。
在本发明方法中，第一到四轮PCR反应的循环次数可以由本领域普通技术人员根据具体情形确定。在使用一条诱变引物时，原则上，各轮PCR反应的循环次数应足以使得加入的引物全部被消耗。但在使用两条诱变引物时，第二轮PCR反应的循环次数必须受到控制，确保在该轮循环后，反应体系中仍有侧翼引物剩余，可以用于第四轮PCR反应中。优选，在使用两条诱变引物时，第二轮PCR反应和第四轮PCR反应的循环次数相同，这样可以实现最高的诱变效率。优选，第一轮和第三轮PCR反应的循环次数是第二轮和第四轮PCR反应的循环次数的2倍或2倍以上。
以下分别介绍使用一条诱变引物和两条诱变引物时本发明方法的具体操作。
一)一条诱变引物使用一条诱变引物时，在加入所有PCR反应成分后，本发明方法按照上述“三”部分介绍的PCR策略产生目标PCR产物。该方法的原理可参见图3。
所述的反应体系可使用如下方法调配，它包括一个诱变试剂盒体系(62ul)如上述“表1”和一个由实验者调配的新鲜的特异诱变溶液体系(38ul)如“表2”。以100ul体积为例表1诱变试剂盒体系(62ul)
说明100ul反应体系中，按诱变试剂盒体系取62ul组分。诱变试剂盒体系中的“侧翼引物管”和“2倍PCR反应混合液管”通常保存于-20℃。使用时4℃融化，并于冰上调配PCR定点诱变反应液，混匀各试利组分后，4℃离心4-6秒，收集液体。
表2特异诱变溶液体系(38ul)
说明100ul反应体系中，按特异诱变溶液体系取38ul组分按上述取量，使用时4℃融化，并于冰上调配PCR定点诱变反应液，混匀各试剂组分后，4℃离心4-6秒，收集液体。根据其基本原理设计反应条件，以eppendorf mastercycler gradient.PCR仪使用为例，依次行PCR自动化程序如下。
(1)94℃4分钟(2)94℃45秒(3)72℃n1秒(4)回到第(2)步重复6个循环(5)94℃45秒(6)Tra℃ 5秒(7)42℃1分钟(8)72℃n2秒(9)回到第(6)步重复3个循环(10)72℃延伸3分钟(11)回到第(2)步重复6个循环(12)保存于 4℃注意此处的n1和n2需要根据所延伸的DNA片断的长度计算，一般地，每分钟延伸1000个碱基。Tra需要根据不同DNA模板的A、T、G、C含量，通过本说明书所提供的公式或实验方法获得(如，梯度变性PCR，图2)。以下相同。
二)两条诱变引物使用两条诱变引物时，在加入所有PCR反应成分后，本发明方法按照上述“三”部分介绍的PCR策略产生目标PCR产物。该方法的原理可参见图4。
所述的反应体系可使用如下方法调配，它包括一个诱变试剂盒体系(62ul)如上述“表1”和一个由实验者调配的新鲜的特异诱变溶液体系(38ul)如“表3”。以100ul体积为例表1诱变试剂盒体系(62ul)
说明100ul反应体系中，按诱变试剂盒体系取62ul组分表3特异诱变溶液体系(38ul)
说明100ul反应体系中，按特异诱变溶液体系取38ul组分按上述取量，使用时4℃融化，并于冰上调配PCR定点诱变反应液，混匀各试剂组分后，4℃离心4-6秒，收集液体。根据其基本原理设计反应条件，以eppendorf mastercycler gradient.PCR仪使用为例，依次行PCR自动化程序如下。
(1)94℃4分钟(2)94℃45秒(3)72℃n1秒(4)回到第(2)步重复6个循环
(5)94℃45秒(6)Tra℃ 45秒(7)42℃1分钟(8)72℃n2秒(9)回到第(6)步重复3个循环(10)72℃延伸3分钟(11)回到第(2)步重复6个循环(12)保存于 4℃注意Tra需要根据不同DNA模板的A、T、G、C含量，通过本说明书所提供的公式和实验方法获得。
以下通过具体实施例进一步说明本发明的方法。其中以pET-21a为载体质粒，人钙调磷酸酶B亚基为目的基因。
以下通过实施例来进一步阐明本申请的内容。应当理解，实施例仅用于示例性说明申请的技术方案的具体实施方式
，而不是以任何方式限定本申请的范围。
实施例实施例1该实施例验证了本申请的特异性抑制特定DNA模板的方法。
根据GENBANK所报道的人钙调磷酸酶B亚基(CNB)序列(L03554)和http//www merckbiosciences.com/docs/docs/PROT/oET-21a-gb.html所报道的质粒pET-21a序列，以CNB重组子为例，根据pET-21a的多克隆位点附近的碱基序列设计引物，反应是通过一个梯度PCR反应体系和梯度变性PCR进行，说明如下。
引物序列的设计为反向引物5’-------CGGAGATATACATATG(SEQ ID NO.01)正向引物5’--------ATTGTCGACGGAGCT(SEQ ID NO.02)梯度PCR反应体系如下梯度PCR反应体系
梯度变性PCR反应条件如下1) 94℃4分钟2)梯度变性 45秒3)42℃ 1分钟4)72℃ 1分钟5)回到第2)步，重复30个循环6)72℃ 8分钟7)保存于 4℃终产物经1.2％的琼脂糖胶分析。图2a是实验1的结果。其中，泳道MDNA Marker DL2000；泳道1，78℃；泳道2，80.0℃；泳道3，81.1℃；泳道4，82.4℃；泳道5，84.0℃；泳道6，85.9℃；泳道7，87.9℃；泳道8，89.9℃；泳道9，91.5℃；泳道10，94.1℃，在反应条件中“2)梯度变性”的温度如上所述。由图中可以看到，在泳道1和2中没有目的DNA的扩增产物。
图2b是实验2的结果。其中，泳道MDNA Marker DL2000；泳道1，94.1 ℃；泳道2，91.5℃；泳道3，89.9℃；泳道4，87.9℃；泳道5，85.9℃；泳道6，84.0℃；泳道7，82.4℃；泳道8，81.1℃；泳道9，80.0℃；泳道10，78℃。在反应条件中“2)梯度变性”的温度如上所述。由图中可以看到，在泳道8、9和10中没有目的DNA的扩增产物。
利用BioEdit Version 4.7.2软件分析pET-21a-CNB序列可得其CNB的(G+C)％＝44.77％，pET-21a-CNB的(G+C)％＝52.28％，Tra＝80.1℃。
根据上述理论分析，在Tra＝80.1℃的温度下，模板DNA会产生自身重退火，因此，引物无法结合模板，而不能产生扩增产物。实验1中，结果证实78℃和80℃时没有扩增产物。实验2中，结果证实81.1℃、80.0℃和78℃时没有扩增产物。也就是说，实验结果验证了理论预测的结果。通过控制反应体系的温度，可以特异性抑制特定DNA模板的扩增。
实施例2本实施例说明本申请的一步定点诱变方法。其中方法1是使用一条引物的方法，方法2是使用两条引物的方法。
按http//www.merckbiosciences.com/docs/docs/PROT/pET-21a-gb.html所报道的质粒pET-21a序列，根据pET-21a的多克隆位点附近的碱基序列设计侧翼引物，如下反向侧翼引物5’-------CGGAGATATACATATG(SEQ ID NO.01)正向侧翼引物5’--------ATTGTCGACGGAGCT(SEQ ID NO.02)所设计的引物由上海生工合成，按侧翼引物管所需试剂量调节所含试剂组分，制备pET-21a侧翼引物试剂管，如表4。
表4pET-21a侧翼引物管所含试剂组分
说明100ul的反应体系中，取量为12ul物试剂所用的耐热DNA聚合酶，10倍PCR缓冲液，2.5mM dNTP以TAKARA公司PyrobestTMDNA Polymerase DR500A包装产品为例，进一步调试为2倍PCR反应混合液管通常所含试剂组分，表5表52倍PCR反应混合液管通常所含试剂组分
说明100ul的反应体系中，取量为50ul的2倍PCR反应混合液管通常所含试剂组分按上述的表4和表5调节方法1和2的诱变试剂盒体系反应共用体系，如表6表6诱变试剂盒体系(62ul)
说明100ul反应体系中，按诱变试剂盒体系取62ul组分按表2和表3所述，设计方法1和方法2的特异诱变溶液体系表7和表8，如下表7方法1.特异诱变溶液体系(38ul)
说明100ul反应体系中，按特异诱变溶液体系取38ul组分表8方法2.特异诱变溶液体系(38ul)
说明100ul反应体系中，按特异诱变溶液体系取38ul组分上述试剂管未特别说明时，均为负20度保存！方法1一条诱变引物的方法根据GENBANK所报道的人钙调磷酸酶B亚基(calcineurinbsubunit，CNB)序列(L03554)，设计酶切位点Nde1和BamH1，正向引入pET21a(+)质粒。构建的重组子pET21a-CNB作为PCR诱变反应的模板。利用primer premier 5.0软件设计如下诱变引物，以构建CNB/K134HCNB/K134R CNB/M118K CNB/V119R CNB/G120Y CNB/G120RCNB/L123R等7个突变体(如表9)，所设计的引物由上海生工合成，其中目的诱变在诱变引物序列中标示为XXX，如表9。按照100ul反应物体系调节反应物体系，按照如下反应条件行PCR，终产物经1.2％琼脂糖胶分析(如突变体CNB/M118K图5)，切下目的产物，按北京塞百盛基因技术有限公司的PCR片段回收试剂盒方法回收目的产物，按TAKARA产品说明书调节Nde1和BamH1酶切目的产物体系，通过上述的PCR片段回收试剂盒方法从酶切产物中回收目的产物，利用T4 DNA连接酶(TAKARA)，按TAKARA产品说明书，调节连接反应体系，16℃水浴16小时，所得的连接子转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经含抗生素氨苄的LB平板筛选，随机挑选1个转化子进行序列测定，7个突变体的转化子认证结果全为目的突变序列，单个突变体突变效率100％(1/1)，平均突变效率为100％(7/7)，如表9。诱变产物的测序结果见图7，突变位点附近部分测序结果见图8。
采用一条诱变引物的方法，实施CNB的突变体7例，以突变体CNB/M118K为例说明，结果如图5。
表9一条诱变引物的方法中突变体实例
按表6诱变试剂盒体系和表7方法1.特异诱变溶液体系调节上述CNB的7例突变体的反应体系，具体如下表6诱变试剂盒体系(62ul)
说明100ul反应体系中，按诱变试剂盒体系取62ul组分表7方法1.特异诱变溶液体系(38ul)
说明100ul反应体系中，按特异诱变溶液体系取38ul组分按上述取量，使用时4℃融化，并于冰上调配PCR定点诱变反应液，混匀各试剂组分后，4℃离心4-6秒，收集液体。根据其基本原理设计如下反应条件，以eppendorf mastercycler gradient.PCR仪使用为例，依次行PCR自动化程序如下。
(1)94℃4分钟(2)94℃45秒(3)72℃100秒(4)回到第(2)步重复6个循环(5)94℃45秒(6)Tra℃ 45秒(7)42℃1分钟(8)72℃45秒(9)回到第(6)步重复3个循环(10)72℃延伸3分钟(11)回到第(2)步依次按照从(2)到(10)的顺序重复6个循环(12)保存于4℃
突变产终物以突变体CNB/M118K为例，产物经1.2％琼脂糖胶分析(如图5)大约在DL2000 Marker的500bp条带附近可见到一个明亮的DNA条带，为目的突变体CNB/M118K的突变产终物，大约在DL2000Marker的100bp至250bp条带附近可见到一个很淡的DNA条带，这就是大引物条带。通过大量的实验发现，类似地，一个很淡的大引物DNA条带常常提示一个高效的诱变过程。
方法2两条诱变引物的方法根据GENBANK所报道的人钙调磷酸酶B亚基(calcineurin bsubunit，CNB)序列(L03554)，设计酶切位点Ndel和BamH1，正向引入pET21a(+)质粒。构建的重组子pET21a-CNB作为PCR诱变反应的模板。利用primer premier 5.0软件设计如下诱变引物，以构建CNB/M118K突变体(如表10)，所设计的引物由上海生工合成，其中目的诱变在诱变引物序列中标示为XXX，如表10。按照100ul反应物体系调节反应物体系，按照如下反应条件行PCR，终产物经1.2％琼脂糖胶分析(如突变体CNB/M118K图6)，切下目的产物，按北京塞百盛基因技术有限公司的PCR片段回收试剂盒方法回收目的产物，按TAKARA产品说明书调节Ndel和BamH1酶切目的产物体系，通过上述的PCR片段回收试剂盒方法从酶切产物中回收目的产物，利用T4 DNA连接酶(TAKARA)，按TAKARA产品说明书，调节连接反应体系，16℃水浴16小时，所得的连接子转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经含抗生素氨苄的LB平板筛选，随机挑选3个转化子进行序列测定，转化子认证结果全为目的突变序列，突变效率为100％(3/3)，如表10。诱变产物的测序结果见图9，突变位点附近部分测序结果见图10。
采用两条诱变引物的方法，实施CNB的突变体CNB/M118K，结果如图6。
表10四条引物，以PCR为基础的一步定点诱变技术突变体实例
按表6诱变试剂盒体系和表8方法2.特异诱变溶液体系调节上述CNB的1例突变体的反应体系，具体如下表6诱变试剂盒体系(62ul)
说明100ul反应体系中，按诱变试剂盒体系取62ul组分表8方法2.特异诱变溶液体系(38ul)
说明100ul反应体系中，按特异诱变溶液体系取38ul组分按上述取量，使用时4℃融化，并于冰上调配PCR定点诱变反应液，混匀各试剂组分后，4 ℃离心4-6秒，收集液体。根据其基本原理设计如下反应条件，以eppendorf mastercycler gradient.PCR仪使用为例，依次行PCR自动化程序如下。
(1)94℃4分钟(2)94℃45秒(3)72℃100秒(4)回到第(2)步重复6个循环(5)94℃45秒(6)Tra℃ 45秒(7)42℃1分钟
(8)72℃45秒(9)回到第(6)步重复3个循环(10)72℃延伸3分钟(11)回到第(2)步重复6个循环(12)保存于4℃突变产终物以突变体CNB/M118K为例，产物经1.2％琼脂糖胶分析(如图6)大约在DL2000 Marker的500bp条带附近可见到一个明亮的DNA条带，为目的突变体CNB/M118K的突变严终物，大约在DL2000Marker的250bp条带附近可见到两个很淡的DNA条带，这就是大引物条带，其中一条是源于正向诱变引物，约360bp，另一条是源于反向诱变引物约160bp。通过大量的实验发现，类似地，两个很淡的大引物DNA条带常常提示一个高效的诱变过程。
序列表<110>魏群<120>特异性抑制特定DNA模板扩增的方法和基于该方法的一步定点诱变方法<130>CP1050159<160>14<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1cggagatata catatg 16<210>2<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2attgtcgacg gagct 15<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3gcagattgta gaccacacca taataaacg29
<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4agattgtaga ccgcaccata ataaacgca 29<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5tgaagatgaa agtgggcaac aac 23<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6ttgaagatga tgcgtggcaa caacctgaaa gata 34<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7ttgaagatga tggtgtataa caacctgaaa g 31<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8ttgaagatga tggtgcgtaa caacc tgaaa g31<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9atggtgggca acaaccgcaa agatacgcag t 31<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10gttgttgccc actttcatct tca 23<210>11<211>679
<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(52)..(564)<220>
<221>misc_feature<222>(619)..(619)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(622)..(622)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221> misc_feature<222>(628)..(628)<223>n是a，c，g，或t<220>
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<221>misc_feature<222>(679)..(679)<223>n是a，c，g，或t<400>11caattcccct ctagaaataa tttcgtttaa ctttaagaag gagatataca t atg gga57Met Gly1aat gag gcg agt tac cct ttg gaa atg tgc tca cac ttc gat gct gat 105
Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Met Cys Ser His Phe Asp Ala Asp5 10 15gag att aaa agg cta gga aag aga ttc aag aag ctt gac ttg gac aac153Glu Ile Lys Arg Leu Gly Lys Arg Phe Lys Lys Leu Asp Leu Asp Asn20 25 30tct ggt tct ttg agc gtg gag gag ttc atg tct ctg cct gag tta caa201Ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser Leu Pro Glu Leu Gln35 40 45 50cag aac cct tta gta cag cgg gtc ata gat ata ttc gac aca gac ggg249Gln Asn Pro Leu Val Gln Arg Val Ile Asp Ile Phe Asp Thr Asp Gly55 60 65aat gga gaa gtg gac ttc aaa gaa ttc att gaa gga gtc tct cag ttc297Asn Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe Ile Glu Gly Val Ser Gln Phe70 75 80agt gtc aaa ggc gat aag gaa cag aag ttg agg ttc gct ttc cgt atc345Ser Val Lys Gly Asp Lys Glu Gln Lys Leu Arg Phe Ala Phe Arg Ile85 90 95tac gac atg gat aaa gac ggc tat att tcc aat gga gag ctc ttc cag393Tyr Asp Met Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu Phe Gln100 105 110gtg ttg aag atg aaa gtg ggc aac aac ctg aaa gat acg cag tta cag441Val Leu Lys Met Lys Val Gly Asn Asn Leu Lys Asp Thr Gln Leu Gln115 120 125130cag att gta gac aaa acc ata ata aac gca gat aag gac ggg gac ggg489Gln Ile Val Asp Lys Thr Ilc Ile Asn Ala Asp Lys Asp Gly Asp Gly135 140 145aga ata tcc ttt gag gag ttc tgt gct gtt gta ggt ggc cta gat atc537Arg Ile Ser Phe Glu Glu Phe Cys Ala Val Val Gly Gly Leu Asp Ile150 155 160cac aaa aag atg gtg gta gat gtg tga ggatccgaat tcgagc tccg 584His Lys Lys Met Val Val Asp Val165 170tcgacaagct tgcgggcgga ctcgagcacc accancanca ccantgagat ccggctgctt 644
acaanncccn aaggaaactg aattggc tgc tgccn 679<210>12<211>170<212>PRT<213>人<400>12Met Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Met Cys Ser His Phe Asp1 5 10 15Ala Asp Glu Ile Lys Arg Leu Gly Lys Arg Phe Lys Lys Leu Asp Leu20 25 30Asp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser Leu Pro Glu35 40 45Leu Gln Gln Asn Pro Leu Val Gln Arg Val Ile Asp Ile Phe Asp Thr50 55 60Asp Gly Asn Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe Ile Glu Gly Val Ser65 70 75 80Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp Lys Glu Gln Lys Leu Arg Phe Ala Phe85 90 95Arg Ile Tyr Asp Met Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu100 105 110Phe Gln Val Leu Lys Met Lys Val Gly Asn Asn Leu Lys Asp Thr Gln115 120 125Leu Gln Gln Ile Val Asp Lys Thr Ile Ile Asn Ala Asp Lys Asp Gly
130 135 140Asp Gly Arg Ile Ser Phe Glu Glu Phe Cys Ala Val Val Gly Gly Leu145150 155 160Asp Ile His Lys Lys Met Val Val Asp Val165 170<210>13<211>688<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(73)..(585)<220>
<221>misc_feature<222>(621)..(621)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(624)..(624)<223>n是a，c，g，或t<400>13gtgagcggct acaattcccc tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac60atagatatac at atg gga aat gag gcg agt tac cct ttg gaa atg tgc tca111Met Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Met Cys Ser1 5 10cac ttc gat gct gat gag att aaa agg cta gga aag aga ttc aag aag 159His Phe Asp Ala Asp Glu Ile Lys Arg Leu Gly Lys Arg Phe Lys Lys15 20 25ctt gac ttg gac aac tct ggt tct ttg agc gtg gag gag ttc atg tct 207Leu Asp Leu Asp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser
30 35 40 45ctg cct gag tta caa cag aac cct tta gta cag cgg gtc ata gat ata 255Leu Pro Glu Leu Gln Gln Asn Pro Leu Val Gln Arg Val Ile Asp Ile50 55 60ttc gac aca gac ggg aat gga gaa gtg gac ttc aaa gaa ttc att gaa 303Phe Asp Thr Asp Gly Asn Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe Ile Glu65 70 75gga gtc tct cag ttc agt gtc aaa ggc gat aag gaa cag aag ttg agg 351Gly Val Ser Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp Lys Glu Gln Lys Leu Arg80 85 90ttc gct ttc cgt atc tac gac atg gat aaa gac ggc tat att tcc aat 399Phe Ala Phe Arg Ile Tyr Asp Met Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Ser Asn95 100 105gga gag ctc ttc cag gtg ttg aag atg aaa gtg ggc aac aac ctg aaa 447Gly Glu Leu Phe Gln Val Leu Lys Met Lys Val Gly Asn Asn Leu Lys110 115 120 125gat acg cag tta cag cag att gta gac aaa acc ata ata aac gca gat 495Asp Thr Gln Leu Gln Gln Ile Val Asp Lys Thr Ile Ile Asn Ala Asp130 135 140aag gac ggg gac ggg aga ata tcc ttt gag gag ttc tgt gct gtt gta 543Lys Asp Gly Asp Gly Arg Ile Ser Phe Glu Glu Phe Cys Ala Val Val145 150 155ggt ggc cta gat atc cac aaa aag atg gtg gta gat gtg tga 585Gly Gly Leu Asp Ile His Lys Lys Met Val Val Asp Val160 165 170ggatccgaat tcgagctccg tcgacaagct tgcggncgna ctcgagcacc accaccacca 645ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gag 688<210>14<211>170<212>PRT<213>人
<400>14Met Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Met Cys Ser His Phe Aspl 5 10 15Ala Asp Glu Ile Lys Arg Leu Gly Lys Arg Phe Lys Lys Leu Asp Leu20 25 30Asp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser Leu Pro Glu35 40 45Leu Gln Gln Asn Pro Leu Val Gln Arg Val Ile Asp Ile Phe Asp Thr50 55 60Asp Gly Asn Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe Ile Glu Gly Val Ser65 70 75 80Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp Lys Glu Gln Lys Leu Arg Phe Ala Phe85 90 95Arg Ile Tyr Asp Met Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu100 105 110Phe Gln Val Leu Lys Met Lys Val Gly Asn Asn Leu Lys Asp Thr Gln115 120 125Leu Gln Gln Ile Val Asp Lys Thr Ile Ile Asn Ala Asp Lys Asp Gly130 135 140Asp Gly Arg Ile Ser Phe Glu Glu Phe Cys Ala Val Val Gly Gly Leu145150 155 160Asp Ile His Lys Lys Mct Val Val Asp Val165170
权利要求
1.一种特异性抑制特定DNA模板扩增的方法，该方法通过控制PCT扩增反应体系的温度为按照以下定义的Tra±2℃，使得反应体系中的模板DNA特异性双链化，而反应体系中的其余DNA不能同时实现双链化若(Gi+Ci)％＜(G+C)％，Tra＝{0.41*(Gi+Ci)％-[(Ai+Ti)％-(A+T)％]}*100+69.3若(Gi+Ci)％＞(G+C)％，Tra＝0.41*(Gi+Ci)％*100+69.3-4.1其中，上述的Ai、Ti、Gi、Ci是指目的DNA所扩增区段的碱基；A、T、G、C是指模板DNA的碱基。
2.一种基于PCR的一步定点诱变方法，该方法将至少一条诱变引物和两条侧翼引物与其他PCR成分一次加入同一反应管后，通过PCR反应直接获得诱变的扩增DNA片段，其中所述诱变引物的解链温度显著高于侧翼引物的解链温度，所述方法包括以下步骤A)第一轮PCR反应，其中，在高温下进行退火，使得只有诱变引物与模板DNA结合并得到延伸，从而获得含有诱变引物的第一扩增片段；B)第二轮PCR反应，其中，首次循环分两步进行退火，第一步退火在模板DNA复性温度±2℃的温度下进行，使得模板DNA重新结合形成双链，而第一扩增片段保持单链状态，第二步退火在低温下进行，使得侧翼引物与第一扩增片段结合并以其为模板得到延伸，从而获得含有该侧翼引物的第二扩增片段；该轮反应中随后的循环都在模板DNA复性温度±2℃的温度下进行变性，使得模板DNA保持双链状态，而第一扩增片段形成单链，然后在与上述首次循环第二步退火相同的温度下进行退火，使得同一侧翼引物与第一扩增片段结合并以其为模板得到延伸，从而获得含有该侧翼引物的第二扩增片段；C)第三轮PCR反应，其中，在高温下进行退火，使得只有第二扩增片段单链与模板DNA结合并得到延伸，从而获得含有突变位点的第三扩增片段，即单链型突变体全长扩增片段；D)第四轮PCR反应，其中，首次循环分两步进行退火，第一步退火在模板DNA复性温度±2℃的温度下进行，使得模板DNA重新结合形成双链，而第三扩增片段保持单链状态，第二步退火在低温下进行，使得侧翼引物与第三扩增片段结合并以其为模板得到延伸，从而获得双链型突变体全长扩增片段；该轮反应中随后的循环都在模板DNA复性温度±2℃的温度下进行变性，使得模板DNA保持双链状态，而第三扩增片段形成单链，然后在与上述首次循环第二步退火相同的温度下进行退火，使得同一侧翼引物与第三扩增片段结合并以其为模板得到延伸，从而获得双链型突变体全长扩增片段。
3.权利要求2的方法，其中所述两条侧翼引物的解链温度为36℃至46℃。
4.权利要求3的方法，其中所述两条侧翼引物的解链温度相同或相近。
5.权利要求2的方法，其中所述侧翼引物的长度为14至16个碱基。
6.权利要求2的方法，其中，所述诱变引物的解链温度在66℃以上。
7.权利要求2的方法，其中所述诱变引物的长度不少于23个碱基，而且，诱变位点两侧通常不少于8个寡核苷酸。
8.权利要求2的方法，其中第二轮和第四轮PCR反应的循环次数相同。
9.权利要求8的方法，其中第一轮和第三轮PCR反应的循环次数是第二轮和第四轮PCR反应的循环次数的2倍或2倍以上。
10.权利要求9的方法，其中第二轮和第四轮PCR反应的循环次数是3。
11.权利要求2-10之一的方法，其中诱变引物是两条。
全文摘要
本发明涉及一种特异性抑制特定DNA模板扩增的方法和基于该方法的一步定点诱变方法。所述特异性抑制特定DNA模板扩增的方法通过控制PCR扩增反应体系的温度可以特异性抑制特定模板DNA的扩增。而所述一步定点诱变方法将至少一条诱变引物和两条侧翼引物与其他PCR成分一次加入同一反应管后，通过PCR反应直接获得诱变的扩增DNA片段，而且诱变效率几乎为百分之百。
文档编号C12P19/00GK1880469SQ20051007663
公开日2006年12月20日 申请日期2005年6月13日 优先权日2005年6月13日
发明者吴武, 刘平, 魏群 申请人:魏群