专利名称：自体特异性t细胞的体外扩增方法及所制备的t细胞体系、体系的药物应用和组分监测方法
技术领域：
本发明涉及一种自体 特异性T细胞的体外扩增方法，还涉及采用该方法扩增后得到的自体特异性T细胞体系、该细胞体系在药物制备中的应用及对该细胞体系的组分监测方法。
背景技术：
肿瘤的治疗一直采用三种传统治疗方法，即放疗、化疗及手术治疗。传统的手术治疗只能解决局部问题，放疗及化疗在杀伤癌细胞的同时还会使人体正常组织和细胞受到损伤，尤其是对主导细胞免疫的T细胞的免疫功能影响极大，易形成二次肿瘤。因此，放疗、化疗及手术三大传统治疗方式一直存在着不彻底、易转移、副作用大等弊端。近年来,一个新的肿瘤自体细胞免疫治疗方法(也称肿瘤生物治疗)已成为现代肿瘤治疗的第四种模式。包括CIK (Cytokine Induced Killer,细胞因子诱导的杀伤细胞)细胞免疫疗法、LAK细胞(Lymphokine Activated Killer Cells,淋巴因子激活的杀伤细胞)免疫疗法、TIL细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte,肿瘤浸润淋巴细胞)免疫疗法和DC细胞(树突状细胞)免疫疗法等。其中，CIK细胞是用⑶3单克隆抗体激活的杀伤细胞(又称⑶3AK细胞)，是LAK和TIL之后出现的一种较新型的抗肿瘤效应细胞，目前在国内应用较多。CIK细胞具有体外扩增能力强和一定的抗瘤能力等特点，克服了 LAK和TIL细胞在肿瘤治疗中的一些不足，但是CIK疗法的主要局限性是此法细胞体外激活具有广谱性，缺乏对某些肿瘤细胞特异的杀伤作用。总之，目前，肿瘤自体细胞免疫疗法遇到的瓶颈主要在以下两个方面
1.自体细胞进行体外细胞培养的体系不够完善，存在很多不可控制的因素，从而导致细胞扩增数量不足或扩增失败，更关键的是培养后的细胞缺乏杀伤肿瘤的特异性；
2.缺乏体外细胞培养制备的质控监测与评价方法，回输患者体内后其疗效又不能被准确和及时的评价，阻碍了这项新技术规范化与标准化的实施。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种自体特异性T细胞的体外扩增方法及培养得到的产品(自体特异性T细胞体系)、该产品在制药中的应用和对该产品组分的监测方法，采用该体外扩增方法可以在GMP的环境下根据临床的不同需要制备出不同功能性的多克隆免疫活性细胞，可用于肿瘤、病毒感染或放、化疗引起的免疫损伤后的免疫重建，也可制备出具有杀伤病毒或肿瘤作用的高度特异性的克隆化T细胞，称为CTC (The Cloned T cells, CTC)，用于抗肿瘤及抗病毒的细胞免疫治疗，相应的组分监测方法可用于所制备的自体特异性T细胞体系或药物的质量监控与评价，以保证该体外扩增方法及其制备的自体特异性T细胞体系的规范化与标准化，并可以对临床疗效进行有效的评价。本发明采用的主要技术方案是
一种自体特异性T细胞的体外扩增方法，包括如下步骤
步骤(I )，从患者的外周血中分离外周血单个核细胞(即PBMCs)；
步骤(2)，根据需要加入相应的T细胞刺激因子，加入或不加入相应的细胞生长因子，在相应的培养基中对步骤(I)分离出的外周血单个核细胞进行体外培养来扩增T细胞。在所述步骤(2)中，还可以生产也可以不生产DC细胞疫苗，所述生产DC细胞疫苗的方式为在所述外周血单个核细胞体外培养时加入相应的DC细胞成熟因子以获取成熟 的DC细胞，在获取的成熟的DC细胞中加入相应的肿瘤或病毒特异性抗原进行抗原刺激以生产DC细胞疫苗。所述促进DC成熟因子优选在体外培养之前加入。优选地，根据特异性要求及培养需要，所述T细胞刺激因子可以包括下列中的任意一种、任意几种或全部细胞因子SUPF-1、SUPF-2、SUPF-3、SUPF-4, SUPF-5, SUPF-6,SUPF-7、SUPF-8、SUPF-9, SUPF-10和SUPF-31，当加入多种T细胞刺激因子时，各种T细胞刺激因子的比例可以依特异性要求确定，可以根据实验验证、理论推导或者在实验指导下确定在不同情况下所要加入的T细胞刺激因子种类以及所加入的T细胞刺激因子的加入量以及各种T细胞刺激因子的比例关系。所述培养基通常可以采用或者包括无血清培养基。所述无血清培养基优选采用或者包括培养基MED0-A。优选地,所述步骤(2)包括
步骤(2. 1)，用培养基MEDO-A将所述步骤(I)分离得到的外周血单个核细胞制成细胞密度为lxl06/ml-2X107ml的细胞悬液；
步骤(2. 2)，所述步骤(2. I)之后，加入SUPF-31、SUPF-5、SUPF-6和SUPF-7进行供培养，培养时间一般为48-72小时左右，之后，去除或不去除T细胞刺激因子的附加物，所述加入SUPF-31、SUPF-5、SUPF-6和SUPF-7的方式优选为先分别制成SUPF - 31和SUPF-5的混合物以及SUPF-6和SUPF-7的混合物，然后再分别添加；
步骤(2. 3)，所述步骤(2. 2)之后再加入SUPF-3和SUPF-10在培养基MEDO-A里继续培养，所述加入SUPF-3和SUPF-10的方式优选为二者分别添加。通常,所述步骤(2. 3)之后还包括步骤(2. 4),收获T细胞。可以根据细胞数量确定培养时间，例如，通常，所述收获T细胞的条件可以为下列任一条件所述步骤(2. 3)的培养时间达到10-12天(用于免疫重建时)或10-14天(用于免疫治疗时)；或者，T细胞数量达到培养要求；或者，全程体外培养时间达到10-12天(用于免疫重建时)或10-14天(用于免疫治疗时)。优选地，所述步骤(I)中的外周血可以用EDTA或肝素抗凝，可以采用密度梯度法分离外周血单个核细胞。优选为地，对于上述任意一种所述的自体特异性T细胞的体外扩增方法，所述步骤(2)中，还通过添加肿瘤抗原进行刺激以便增加扩增后的T细胞中具有抗肿瘤能力和免疫活性的CTC细胞前体。所述进行肿瘤抗原刺激的方式可以为添加肿瘤或病毒特异性抗原直接刺激，和/或，由自体抗原递呈细胞携带所述特异性抗原刺激。优选为，所述肿瘤抗原包括下列中的任意一种、任意几种或全部TAG_1、TAG-2、TAG-3、TAG-4、TAG-5, TAG-6, TAG-7, TAG-9, TAG-10、TAG-11, TAG-12, TAG-13, TAG-14,TAG-15、TAG-16、TAG-17, TAG-18, TAG 19 和 TAG-20。可以采用下列方式对所述步骤(2)进行改进，将所述步骤(2. I)制得的细胞悬液首先进行贴壁培养，再将贴壁培养后的细胞悬液和贴壁细胞分别单独进行培养，然后，将细胞悬液单独培养所得的细胞悬液和贴壁细胞单独培养所得的贴壁细胞混合，混合后加SUPF-6和SUPF-7，之后执行所述步骤(2. 3)。所述贴壁培养的条件可以为37°C 5% CO2贴壁培养2小时_3小时。
所述贴壁培养后的贴壁细胞的单独培养可以按如下步骤进行
(i )加入 TAG-I 或 TAG-2 中的任意一种以及 TAG-3、TAG-4、TAG-5、TAG-6、TAG-7、TAG-9、TAG-10, TAG-11, TAG-12, TAG-13, TAG-14、TAG-15, TAG-16、TAG-17, TAG-18、TAG19和TAG-20，所述TAG19和TAG-20混合后加入，在培养基MEDO-A里培养，培养时间可以为48小时左右；
(ii)，步骤(i)之后再加入TAG-4和TAG-5继续培养，培养时间可以为24小时左右，例如，可以培养至次日；
(iii)，步骤(ii)之后再加入相应的肿瘤或病毒抗原多肽共培养，培养时间可以为3小时。所述贴壁培养后的细胞悬液的单独培养可以按所述步骤(2. 2)进行。一种自体特异性T细胞体系，其中的全部或部分T细胞为采用上述任意一种自体特异性T细胞的体外扩增方法(或权利要求1-15中的任意一方法)经体外扩增制得的。优选地，其中的T细胞总量(⑶3+ T细胞)高于98%。当所述体系用于免疫重建时，其中的⑶4 T细胞亚群(⑶3+⑶4+ T细胞)含量高于60%;当所述体系用于免疫治疗时，其中的⑶4 T细胞亚群(⑶3+⑶4+ T细胞)含量不低于15%。当所述体系用于免疫重建时，其中的⑶8 T细胞亚群(⑶3+⑶8+ T细胞)含量不高于40%且不低于20%;当所述体系用于免疫治疗时，其中的⑶8 T细胞亚群(⑶3+⑶8+ T细胞)含量高于80%，优选为高于90%。其中T细胞含量高于90%，优选为高于95%。所述活化的T细胞亚群通常应包括CD4+ CD38+ HLADR+和 CD8+ CD38+ HLADR+两个 T 细胞亚群，优选地，CD4+ CD38+ HLADR+和 CD8+⑶38+ HLADR+各自的含量均高于45%。其中的抗肿瘤活性T细胞亚群(⑶8+⑶45R0+CD62L+，Tcm)含量高于70%，优选为高于90%。所述抗肿瘤活性T细胞亚群(CD8+ CD45R0+CD62L+，Tcm)不超过5%不表达CD62L，优选为不超过1%不表达⑶62L，更优选为不超过O. 1%不表达⑶62L。其中的记忆T细胞亚群含量高于95%。所述记忆T细胞亚群通常应为CD8+⑶45R0+，优选地，⑶8+⑶45R0+的含量高于95%。优选为，上述任一种自体特异性T细胞体系，其中的调节性T细胞亚群(CD4+CD25+FoxP3+，Treg)含量低于 5%。
一种自体特异性T细胞体系在制备用于免疫系统重建和免疫治疗的药物中的应用，所述自体特异性T细胞体系由上述任意一种自体特异性T细胞体系(或由权利要求16-28中任意一项权利要求所述的自体特异性T细胞体系)构成。通常,所述免疫系统重建主要指对于因肿瘤、病毒感染或放疗、化疗引起的免疫系统损伤后的免疫系统重建，所述免疫治疗主要指对于肿瘤、病毒感染的细胞免疫生物治疗。上述任一种所述自体特异性T细胞体系在制备药物中的应用，其药物中的有效成分可以全部为所述自体特异性T细胞体系(即该体系的独立应用)，也可以部分为所述自体特异性T细胞体系(即该体系与其它成分的混合应用)。一种自体特异性T细胞体系的组分监测方法，可以用于上述任一种自体特异性T细胞体系(或权利要求16-31中任一项权利要求所述的体系)的组分监测，包括细胞表型分析和/或TCR克隆化分析。
可以采用流式细胞分析术进行所述的细胞表型分析。例如，可以首先采用荧光标记单克隆抗体与所述体系中的细胞进行组合，然后进行细胞表型的定量分析。所述单克隆抗体可以包括下列中的任意一种、任意几种或全部抗⑶3+，⑶4+，CD8+，CD45RA+，CD45R0+，CD38+，CD62L+，HLADR+, CD25+，FoxP3+，CD28+ 和 CD57+。所述细胞表型分析的具体监测项目包括T细胞总量(⑶3+ T细胞)、⑶4 T细胞亚群(CD3. CD4. T细胞)、CD8 T细胞亚群(CD3+ CD8+ T细胞)、活化的T细胞亚群(CD4+⑶38+HLADR+和 / 或 CD8+ CD38+ HLADR+)、抗肿瘤活性 T 细胞亚群(CD8+ CD45R0+CD62L+，Tcm)、调节性T细胞亚群(⑶4+⑶25+FoxP3+，Treg,和/或⑶8+⑶287⑶8+⑶57+)、记忆T细胞亚群(CD4+CD45R0+ 和 / 或 CD8+ CD45R0+)。所述TCR克隆化分析可以包括对T细胞受体的22个V β基因家族进行可视化和/或定量化分析。所述TCR克隆化分析的具体方法可以为通过测定TCR⑶R3基因区的克隆化出现的频率、长度以及分布状态定量化的来反映抗原特定T细胞的抗病毒或肿瘤的功能状态。本发明的有益效果是
本发明提供了自体细胞进行体外培养的标准方法，细胞体外扩增效果稳定，成功率高，可以根据临床的各种需求制备相应功能的免疫活性细胞，如对于因肿瘤、病毒感染或放疗、化疗引起免疫损伤的患者，可以通过体外培养使其紊乱的T细胞体系恢复常态，并能达到百倍的多克隆化的扩增，回输至患者体内后可以用于患者的免疫系统重建，另外，也可以培养出具有杀伤病毒和肿瘤作用的高度特异性的克隆化T细胞，可以用于抗肿瘤和抗病毒的细胞免疫治疗，尤其是可以在培养体系中产生大量的具有抗肿瘤能力和免疫活性的CTC细胞iu体，使得克隆化的τ细胞在患者体内的存留更加持久，有利于提闻疗效；
经实验验证，对于同源的平行样本，采用本发明的方法培养后，CD3+CD8+ T细胞表达高达92. 46%，远高于现有技术的49. 25%，且几乎全部为高表达的⑶8+ T细胞，尤其是几乎全部表达⑶3⑶8细胞，与现有技术的方法培养后尚有很多低表达的⑶8+ T细胞和不表达的CD3CD8细胞相比有益效果明显，更为重要的是，采用本发明的方法培养后的样本中，表型为⑶8⑶45R0⑶62L具有高度肿瘤杀伤作用的中央型记忆细胞(Tcm)高达92. 85%，且其中仅仅O. 09%不表达⑶62L，而用现有技术的方法培养后的样本中，其Tcm只占39. 64%，且其中有47. 77%的记忆细胞(CD45R0)不表达CD62L ；本发明的组分监测方法可以对培养后的细胞体系进行有效的分析和评价，不仅可以在应用前、后分别进行分析和评价，尤其是可以全程追踪T细胞的克隆化变化，可以准确反应细胞体系中的有效成分含量，为评价细胞体系的疗效及患者的恢复状况提供了有效的监测，有助于治疗方案的调整，有助于达到最佳的疗效。
图I是本发明的抗肿瘤特异性T细胞的体外扩增方法、抗肿瘤特异性T细胞体系的应用及抗肿瘤特异性T细胞 杀伤肿瘤的原理 图2是本发明的自体特异性T细胞的体外扩增方法的一个实施例的流程示意图(制备后的自体特异性T细胞体系可以用于免疫重建)；
图3是本发明的自体特异性T细胞的体外扩增方法的另一个实施例的流程示意图(制备后的自体特异性T细胞体系可以用于细胞免疫治疗)；
图4是采用本发明的自体特异性T细胞的体外扩增方法与现有技术对同一份样本进行培养，并采用本发明的监测方法对得到的体系进行细胞表型分析所得到的结果对照示意图(主要示出了具有杀伤病毒和肿瘤的CD8+ T细胞亚群，其中，A1、A2为采用现有技术和本发明的方法分别培养之后得到的T细胞体系中的CD3+ CD8+ T细胞亚群含量分析、B1、B2为采用现有技术和本发明的方法分别培养之后得到的T细胞体系中的CD8+ CD45R0+ CD62L+ T细胞亚群含量分析)；
图5是本发明的T细胞受体(TCR)克隆化分析的流程示意 图6是采用本发明的监测方法对本发明的自体特异性T细胞在培养前后的样本分析结果示意图(A为对培养前的PCMCs样本的分析，B为对来自A的同一份样本采用图3示出的步骤进行培养后得到的自体特异性T细胞体系的分析)。
具体实施例方式参见图2示出的实施例，首先，采集患者50mlEDTA抗凝血，然后，采用密度梯度法分离外周血单个核细胞(PBMCs)，根据需要留取一定量的外周血单个核细胞，以便进行细胞表型流式分析及TCR多态性分析，再将余下的外周血单个核细胞用培养基MEDO-A准备细胞悬液40ml，然后加刺激因子SUPF-31和SUPF-5，SUPF-6，SUPF-7之后在培养基MEDO-A里共培养48-72小时，再加入SUPF-3和SUPF-10刺激因子，在培养基MEDO-A继续培养，10-14天后收获细胞(具体培养时间可以根据细胞数量确定)，之后进行细胞表型流式分析及TCR克隆化分析。为了更好的解释本发明，以便更好的理解，下面结合附图通过具体实施方式
对本发明进行更详细的描述。参见图I至图6，本发明提供了一种自体特异性T细胞的体外扩增方法和由此方法制得的自体特异性T细胞体系，还提供了所述自体特异性T细胞体系在免疫重建和免疫治疗药物中的应用以及用于监测该自体特异性T细胞体系的品质(即其中的组分)的监测方法。所述自体特异性T细胞的体外扩增方法包括如下步骤
(!)从患者的外周血中分离外周血单个核细胞(即PBMCs)；(2)根据需要加入相应的T细胞刺激因子，加入或不加入相应的细胞生长因子，在相应的培养基中对步骤(I)分离出的外周血单个核细胞进行体外培养来扩增T细胞，还加入或不加入促进DC成熟因子来产生成熟的DC细胞，所述促进DC成熟因子优选在体外培养之前加入，加入相应的细胞生长因子可以增加T细胞数量和T细胞受体多态性以用于T细胞免
疫重建。优选为，所述T细胞刺激因子包括下列中的任一种、任几种或全部SUPF-1、SUPF-2、SUPF-3、SUPF-4、SUPF-5、SUPF-6、SUPF-7、SUPF-8、SUPF-9、SUPF-10, SUPF-31。所选用的T细胞刺激因子的种类可以根据患者的肿瘤状况进行选择，优选为至少包括可以在培养后的T细胞体系中产生出对患者所患的肿瘤具有特异性杀伤作用的T细胞的T细胞刺激因子，当选用一种以上的T细胞刺激因子时，各种T细胞刺激因子可以按照任意比例混合，选用的原则可以为依据经验，根据患者所患的肿瘤通常会扩散或转移而形成的新肿瘤 选用T细胞刺激因子，或提高能够生成对该新肿瘤具有特异性杀伤作用的T细胞的T细胞刺激因子的占比。其中，SUPF-1、SUPF-2、SUPF-3、SUPF-4、SUPF-5、SUPF-6、SUPF-7、SUPF-8、SUPF-9、SUPF-10 和 SUPF-31 是相应的细胞因子，如 IL2, IL4, IL12, GMC-SF 等。所述培养基包括无血清培养基，优选为全部为无血清培养基。所述无血清培养基包括培养基MED0-A，优选为全部为培养基MED0-A。优选为，步骤(2 )包括
(2. 1)，用培养基MEDO-A将步骤(I)分离得到的外周血单个核细胞制成细胞密度为Ixl06/ml-2xl07ml 的细胞悬液；
(2. 2)，步骤(2. I)之后加入 SUPF-31、SUPF-5、SUPF-6 和 SUPF-7 后共培养 48-72 小时，之后，去除或不去除T细胞刺激因子的附加物，优选为首先分别制成SUPF - 31和SUPF-5的混合物以及SUPF-6和SUPF-7的混合物，之后再分别添加；
(2. 3)，步骤(2. 2)之后再加入SUPF-3和SUPF-10在培养基MEDO-A里继续培养，优选为二者分别添加。步骤(2. 3)之后还可以包括(2. 4)，收获T细胞。收获T细胞的条件可以为步骤(2. 3)的培养时间达到10-12天或10_14天；或者，T细胞数量达到培养要求；或者，全程培养时间达到10-12天或10-14天。步骤(I)中的外周血可以用EDTA或肝素抗凝，可以采用密度梯度法分离外周血单个核细胞。参见图2示出的实施例，首先，采集患者50mlEDTA抗凝血，然后，采用密度梯度法分离外周血单个核细胞(PBMCs)，根据需要留取一定量的外周血单个核细胞，以便进行细胞表型流式分析及TCR克隆化分析，再在余下的外周血单个核细胞中加刺激因子SUPF-31和SUPF-5、SUPF-6和SUPF7，之后在培养基MEDO-A里共培养72小时，培养后去除刺激因子的附加物，之后再加入SUPF-3和SUPF-10刺激因子，在培养基MEDO-A继续培养，10-12天后收获细胞(具体培养时间可以根据细胞数量确定)，之后进行细胞表型流式分析及TCR克隆化分析，细胞表型流式分析结果见下表。
权利要求
1.一种自体特异性T细胞的体外扩增方法，其特征在于包括如下步骤 步骤(I )，从患者的外周血中分离外周血单个核细胞； 步骤(2)，根据需要加入相应的T细胞刺激因子，加入或不加入相应的细胞生长因子，在相应的培养基中对步骤(I)分离出的外周血单个核细胞进行体外培养来扩增T细胞，生产或不生产DC细胞疫苗，所述生产DC细胞疫苗的方式为在所述外周血单个核细胞体外培养时加入相应的DC细胞成熟因子以获取成熟的DC细胞，在获取的成熟的DC细胞中加入相应的肿瘤或病毒特异性抗原进行抗原刺激以生产DC细胞疫苗。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述T细胞刺激因子包括下列中的任一种、任意几种或全部 SUPF-1、SUPF-2、SUPF-3、SUPF-4、SUPF-5、SUPF-6、SUPF-7、SUPF-8、SUPF-9、SUPF-IO 和 SUPF-31。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述培养基包括无血清培养基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述无血清培养基包括培养基MEDO-A。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤(2)包括 步骤(2. 1)，用培养基MEDO-A将所述步骤(I)分离得到的外周血单个核细胞制成细胞密度为lxl06/ml-2X107ml的细胞悬液； 步骤(2. 2)，所述步骤(2. I)之后加入SUPF - 31、SUPF-5、SUPF-6和SUPF-7后共培养.48-72小时，之后，去除或不去除T细胞刺激因子的附加物； 步骤(2. 3)，所述步骤(2. 2)之后再加入SUPF-3和SUPF-10在培养基MEDO-A里继续培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤(2.3)之后还包括 步骤(2. 4)，收获T细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于收获T细胞的条件为下列任一条件 T细胞数量达到培养要求； 步骤(2. 3)的培养时间达到10-12天(用于免疫重建时)或10-14天(用于免疫治疗时)； 全程体外培养时间达到10-12天(用于免疫重建时)或或10-14天(用于免疫治疗时)。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)中的外周血用EDTA或肝素抗凝，采用密度梯度法分离外周血单个核细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项权利要求所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，还通过添加肿瘤抗原进行刺激以便增加扩增后的T细胞中具有抗肿瘤能力和免疫活性的CTC细胞前体，所述添加肿瘤抗原进行刺激的方式为采用肿瘤或病毒特异性抗原直接刺激，和/或，由自体抗原递呈细胞携带所述特异性抗原刺激。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述肿瘤抗原包括下列中的任意一种、任意几种或全部TAG-1、TAG-2、TAG-3、TAG-4, TAG-5, TAG-6, TAG-7, TAG-9, TAG-10, TAG-11,TAG-12、TAG-13、TAG-14, TAG-15, TAG-16, TAG-17, TAG-18, TAG 19 和 TAG-20。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于将步骤(2.I)制得的细胞悬液首先进行贴壁培养，再将贴壁培养后的细胞悬液和贴壁细胞分别单独进行培养，然后，将单独培养所得的细胞悬液和贴壁细胞混合，混合后加SUPF-6和SUPF-7，之后执行步骤(2. 3)。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述贴壁培养的条件为37°C5% CO2贴壁培养2小时-3小时。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述贴壁培养后的贴壁细胞的单独培养按如下步骤进行 (i )加入 TAG-I 或 TAG-2 中的任意一种以及 TAG-3、TAG-4、TAG-5、TAG-6、TAG-7、TAG-9、TAG-10, TAG-11, TAG-12, TAG-13, TAG-14、TAG-15, TAG-16、TAG-17, TAG-18、TAG19和TAG-20，所述TAG19和TAG-20混合后加入，在培养基MEDO-A里培养； (ii)步骤(i)之后再加入TAG-4和TAG-5继续培养； (iii)，步骤(ii)之后再加入相应的肿瘤或病毒抗原多肽共培养。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述步骤(i)、(ii)、(iii)的培养时间·分别为48小时、24小时和3小时。
15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述贴壁培养后的细胞悬液的单独培养按所述步骤(2. 2)进行。
16.一种自体特异性T细胞体系，其特征在于其中的全部或部分为采用权利要求1-15中的任一方法经体外扩增制得的。
17.根据权利要求16所述的体系，其特征在于其中的T细胞总量(CD3+T细胞)高于98%。
18.根据权利要求16所述的体系，其特征在于当所述体系用于免疫重建时，其中的CD4T细胞亚群(⑶3+⑶4+ T细胞)含量高于60%;当所述体系用于免疫治疗时，其中的⑶4 T细胞亚群(⑶3+⑶4+ T细胞)含量不低于15%。
19.根据权利要求16所述的体系，其特征在于当所述体系用于免疫重建时，其中的CD8T细胞亚群(⑶3+⑶8+ T细胞)含量不高于40%且不低于20%;当所述体系用于免疫治疗时，其中的⑶8 T细胞亚群(⑶3+⑶8+ T细胞)含量高于80%，优选为高于90%。
20.根据权利要求16所述的体系，其特征在于其中T细胞含量高于90%，优选为高于95%。
21.根据权利要求20所述的体系，其特征在于所述活化的T细胞亚群包括⑶4+⑶38+HLADR+ 和 CD8+ CD38+ HLADR+ 两个 T 细胞亚群。
22.根据权利要求21所述的体系，其特征在于⑶4+⑶38+HLADR+和⑶8+⑶38+ HLADR+各自的含量均高于45%。
23.根据权利要求16所述的体系，其特征在于其中的抗肿瘤活性T细胞亚群(CD8+CD45R0+CD62L+，Tcm)含量高于70%，优选为高于90%。
24.根据权利要求23所述的体系，其特征在于所述抗肿瘤活性T细胞亚群(CD8+CD45R0+CD62L+，Tcm)不超过5%不表达CD62L，优选为不超过1%不表达CD62L，更优选为不超过O. 1%不表达CD62L。
25.根据权利要求16所述的体系，其特征在于其中的记忆T细胞亚群含量高于95%。
26.根据权利要求25所述的体系，其特征在于所述记忆T细胞亚群为⑶8+⑶45R0+。
27.根据权利要求26所述的体系，其特征在于CD8+CD45R0+的含量高于95%。
28.根据权利要求16-27中任一项权利要求所述的体系，其特征在于其中的调节性T细胞亚群(CD4+ CD25+FoxP3+，Treg)含量低于 5%。
29.一种自体特异性T细胞体系在制备用于免疫系统重建和免疫治疗的药物中的应用，其特征在于所述自体特异性T细胞体系由权利要求16-28中任意一项权利要求所述的自体特异性T细胞体系构成。
30.根据权利要求29所述的应用，其特征在于所述免疫系统重建主要指对于因肿瘤、病毒感染或放疗、化疗引起的免疫系统损伤后的免疫系统重建，所述免疫治疗主要指对于肿瘤、病毒感染的细胞免疫生物治疗。
31.根据权利要求29或30所述的应用，其特征在于所述自体特异性T细胞体系为独立应用或与其它成分混合应用。
32.—种可用于权利要求16-31中任一项权利要求所述的自体特异性T细胞体系的自体特异性T细胞体系的组分监测方法，其特征在于包括细胞表型分析和TCR克隆化分析。
33.根据权利要求32所述的监测方法，其特征在于采用流式细胞分析术进行所述的细胞表型分析。
34.根据权利要求33所述的监测方法，其特征在于首先采用荧光标记单克隆抗体与所述体系中的细胞进行组合，然后进行细胞表型的定量分析。
35.根据权利要求34所述的监测方法，其特征在于所述单克隆抗体包括下列中的任一种、任几种或全部抗 CD3+，CD4+，CD8+，CD45RA+，CD45RO+，CD38+，CD62L+，HLADR+, CD25+，FoxP3+，CD28.和 CD57+。
36.根据权利要求35所述的监测方法，其特征在于所述细胞表型分析的具体监测项目包括T细胞总量(⑶3+ T细胞)、⑶4 T细胞亚群(⑶3+⑶4+ T细胞)、⑶8 T细胞亚群(⑶3+⑶8+ T细胞)、活化的T细胞亚群(⑶4+⑶38+ HLADR+和/或⑶8+⑶38+ HLADR+)、抗肿瘤活性 T 细胞亚群(CD8+ CD45RO+CD62L+，Tcm)、调节性 T 细胞亚群(CD4+ CD25+FoxP3+，Treg,和 / 或 CD8+CD287CD8+CD57+)、记忆 T 细胞亚群(CD4+CD45RO+ 和 / 或 CD8+ CD45RO+)。
37.根据权利要求32、33、34、35或36所述的监测方法，其特征在于所述TCR克隆化分析包括对T细胞受体的22个V β基因家族进行可视化和/或定量化分析。
38.根据权利要求37所述的监测方法，其特征在于所述TCR克隆化分析的具体方法为通过测定TCR CDR3基因区的克隆化出现的频率、长度以及分布状态定量化的来反映抗原特定T细胞的抗病毒或肿瘤的功能状态。
全文摘要
本发明涉及一种自体特异性T细胞的体外扩增方法及采用该方法所制备的T细胞体系、该细胞体系在药物中的应用以及该细胞体系的组分监测方法，所述体外扩增方法包括如下步骤(1)从患者的外周血中分离外周血单个核细胞；(2)根据需要加入相应的T细胞刺激因子，加入或不加入相应的细胞生长因子，在相应的培养基中对步骤(1)分离出的外周血单个核细胞进行体外培养来扩增T细胞，采用该方法可以在GMP的环境下根据临床的不同需要制备出不同功能性的多克隆免疫活性细胞，用于患者的免疫系统重建和免疫治疗。
文档编号A61P37/02GK102719399SQ20121013055
公开日2012年10月10日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者寇中琛 申请人:北京爱根生物科技有限公司