专利名称：小鼠巢蛋白基因启动子及其组织特异性增强子的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和DNA重组技术领域。更具体地，本发明涉及巢蛋白基因的启动子及其组织特异性增强子，以及它们的用途。
哺乳动物中枢神经系统是由胚胎早期的神经管发育分化而来的。在这个复杂的分化过程中，涉及许多神经组织特异性及神经细胞特异性基因的阶段性表达。巢蛋白(nestin)作为中等纤维蛋白家族的一员，因其在大鼠中枢神经系统前体细胞中的特异性表达而被克隆，并被作为中枢神经系统神经干细胞的标记分子而被广泛应用。
目前，大鼠和人的巢蛋白基因都已被克隆。转基因动物的结果显示，在大鼠巢蛋白基因第一个内含子中，存在调控该基因在肌肉组织中表达的增强子序列，而在第二个内含子中，存在调控巢蛋白基因在中枢神经系统中表达的增强子序列。人的巢蛋白基因表达调控亦有类似的元件存在。巢蛋白基因的第二个内含子已被用来指导某些外源基因在神经组织中专一性表达。
然而，在本申请之前，还没有获得小鼠巢蛋白基因序列以及有关的调控序列。
鉴于小鼠是一种重要的试验动物，而且巢蛋白是在中枢神经系统中特异性表达的蛋白，因此，本领域迫切需要开发小鼠的巢蛋白基因序列以及有关的调控序列。
本发明的目的就是提供一种新的小鼠巢蛋白基因序列以及有关的调控序列。
本发明的另一目的是提供生产这些调控序列的方法以及所述调控序列的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种启动子元件，该启动子元件包括巢蛋白基因启动子的核苷酸序列。较佳地，所述的启动子元件包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种增强子元件，它包括小鼠巢蛋白基因的第二内含子的核苷酸序列。较佳地，所述的增强子元件包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种用于在神经干细胞中特异性表达的构建物，该构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的权利要求3所述的增强子元件。较佳地，所述构建物还含有与该外源基因可操作地连接的 1所述的启动子元件。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，该载体含有上述的启动子元件和/或增强子元件。较佳地，所述的载体是表达载体和质粒。
在本发明的第五方面，提供了一种在神经干细胞中特异性表达外源基因的方法，它包括步骤(a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的增强子元件，所述的增强子元件包含小鼠巢蛋白基因的第二内含子的核苷酸序列，(b)将步骤(a)中的构建物导入神经干细胞，使外源基因在神经干细胞中表达。
在本发明的一个优选例中，步骤(a)中构建物还含有与外源基因可操作地连接的巢蛋白基因启动子元件。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了小鼠巢蛋白基因的结构。
图2是构建物pNH84的结构图。
图3显示了对小鼠巢蛋白基因的启动子区域进行瞬时转染分析的结果。
图4显示了对与荧光素酶报道基因相连的小鼠巢蛋白第二个内含子进行系列缺失的示意图。
图5显示了对小鼠巢蛋白基因的第二内含子区域进行瞬时转染分析的结果。
图6显示了小鼠巢蛋白基因的第二内含子使外源基因(报道基因LacZ)在发育的中枢神经系统(CNS)中表达。图6A显示了用于产生转基因小鼠的DNA片段的结构。图6B和6C显示了在小鼠巢蛋白基因的启动子和第二内含子的指导下，报道基因lacZ在CNS中特异性地表达。
图7显示了小鼠巢蛋白基因的启动子元件的核苷酸序列。
图8显示了小鼠巢蛋白基因的增强子元件(即第二内含子)的核苷酸序列。
本发明人通过筛选小鼠细菌人工染色体(BAC)基因组文库，获得小鼠巢蛋白基因。构建系列缺失质粒，转染胚胎性癌细胞(Embryonal Carcinoma，EC)P19鉴定出小鼠巢蛋白基因的启动子及增强子区域。利用小鼠巢蛋白基因的启动子及其组织特异性增强子，得到在发育的中枢神经系统特异表达报告基因LacZ的转基因小鼠。小鼠巢蛋白基因的启动子及其增强子可用于在P19细胞中表达外源基因或增强外源基因的表达。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，术语“巢蛋白启动子元件”、“巢蛋白启动子区域”可互换使用，指具有巢蛋白启动子序列(SEQ ID NO1)或其活性片段的多聚核苷酸。
如本文所用，术语“巢蛋白的增强子元件”、“巢蛋白第二内含子”以及“巢蛋白的神经系统表达增强子”等可互换使用，指具有巢蛋白增强子序列(SEQ ID NO2)或其活性片段的多聚核苷酸。
本发明还涉及上述启动子和增强子的多核苷酸变异体。这些多核苷酸变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变该启动子或增强子的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上至巢蛋白启动子元件和/或增强子元件的全长。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离本发明的启动子或增强子的核苷酸序列。
本发明的人巢蛋白启动子和增强子的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用小鼠基因组DNA或含小鼠染色体的人工染色体克隆作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到本发明启动子或增强子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的启动子或增强子元件。
本发明也涉及包含本发明启动子和/或增强子元件的构建物或载体，以及用所述构建物或载体转化或转导的宿主细胞，以及经重组技术产生外源蛋白的方法。
适用于本发明的外源基因没有特别限制，几乎所有的外源基因都可用于本发明。代表性的外源基因的例子包括(但并不限于)BDNF、NT-3、STAT3及APP等。应注意，外源基因还包括来自宿主本身的基因。例如，对于某些神经系统的遗传病(例如因某蛋白在神经系统中表达不足或不表达所导致的疾病)，可以从病人本身分离得到有关基因，然后将其与本发明的巢蛋白启动子元件和/或增强子元件相连，形成含外源基因的构建物，然后将所述构建物用于基因治疗。
一种构建物的例子就是与巢蛋白启动子元件和/或增强子元件相连的外源基因。至于巢蛋白启动子元件和/或增强子元件与外源基因的位置关系，启动子应位于外源基因的上游，而增强子可位于外源基因的上游或下游。
本发明中，含巢蛋白启动子和/或增强子元件的核苷酸序列可优选地插入到载体，例如表达载体中。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于表达载体、克隆载体，例如适用于原核(如大肠杆菌等细菌)、真核(如酵母)、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞中的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。在表达载体中，除了含有含有复制起点、巢蛋白启动子元件和/或巢蛋白增强子元件之外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含巢蛋白启动子元件和/或增强子元件和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效地与待表达的外源基因相连接，以指导所述外源基因mRNA合成。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达外源蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。一些采用的转化方法包括但并不限于磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，以表达外源基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长和表达的条件下进行培养。
在本发明的一个实施例中，从10天小鼠全胚胎cDNA文库中筛选巢蛋白cDNA，并得到小鼠巢蛋白的cDNA 5983 bp的全长序列。利用基因组文库的PCR筛选方法，得到一个巢蛋白基因的细菌人工染色体(BAC)克隆。以小鼠巢蛋白cDNA序列作探针作Southern杂交。通过比较比较巢蛋白cDNA和基因组DNA序列可以得出小鼠巢蛋白的基因结构，即该基因由4个外显子和3个内含子所组成。
与大鼠及人巢蛋白基因相比，小鼠巢蛋白基因内含子的位置及大小均较保守。目前，大鼠及人巢蛋白基因的5′上游区、第1及第3个内含子的序列尚未见文献报道。本发明的小鼠巢蛋白基因的第2个内含子与大鼠及人巢蛋白基因第2个内含子的同源性分别为88％和56％。
本发明人还进一步仔细分析了小鼠巢蛋白启动子元件和增强子元件。并通过实验确定了小鼠巢蛋白启动子元件和增强子元件的确切序列，并证实了巢蛋白增强子元件可特异性地在中枢神经系统中增强外源基因的表达。
本发明的巢蛋白启动子元件和/或增强子元件具有广阔的应用前景，例如1)小鼠巢蛋白基因启动子可指导外源基因在P19细胞等多潜能细胞中表达。2)小鼠巢蛋白基因第二内含子可增强外源基因在P19细胞等多潜能细胞中的表达。3)小鼠巢蛋白基因第二内含子因其神经干细胞中的特异表达特性，可与巢蛋白启动子或其他启动子结合在哺乳动物发育的神经系统中过量表达外源基因。因此，本发明的巢蛋白启动子元件和/或增强子元件可应用于研究神经系统发育过程中重要分子的功能、神经疾患动物模型的建立以及神经疾患的基因治疗。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1小鼠巢蛋白cDNA序列和基因组序列的获得利用我们制备的小鼠巢蛋白的抗体(Jing N.H.，Kitani H.，et al.，1996，ChineseJournal of Physiological Sciences，Vol 12，p1-8)，筛选小鼠神经前体细胞cDNA文库，得到小鼠巢蛋白基因cDNA 3′端3.6 Kb(M5)。以M5 5′端740 bp(2402-3143位核苷酸)的片段筛选用常规方法构建的10天小鼠全胚胎cDNA文库，得到小鼠巢蛋白的cDNA 5983 bp的全长序列(小鼠巢蛋白基因cDNA GenBank accessionno.AF076623)。
利用基因组文库的PCR筛选方法，得到一个巢蛋白基因的细菌人工染色体(BAC)克隆。以小鼠巢蛋白cDNA序列中5′端第1-1203位以及5427-5983位的DNA片段为探针作Southern杂交。本发明人获得了4个可拼接出小鼠巢蛋白的基因结构的阳性克隆pNX7、pNB6、pNX5及pNX9(
图1)。通过比较比较巢蛋白cDNA和基因组DNA序列可以得出小鼠巢蛋白的基因结构，即该基因由4个外显子和3个内含子所组成(
图1)。
与大鼠及人巢蛋白基因相比，小鼠巢蛋白基因内含子的位置及大小均较保守。目前，大鼠及人巢蛋白基因的5′上游区、第1及第3个内含子的序列尚未见文献报道。本发明的小鼠巢蛋白基因的第2个内含子与大鼠及人巢蛋白基因第2个内含子的同源性分别为88％和56％。
实施例2巢蛋白启动子元件的鉴定小鼠胚胎性癌细胞P19是一株多潜能细胞，该细胞具有正常雄性小鼠染色体核型，在10-6mol/L的视黄酸(retinoic acid，RA)诱导下，可向神经细胞方向分化。在这一过程中，神经发育相关基因的表达模式基本模拟了正常小鼠神经发育过程。因此，P19细胞目前被作为一个研究小鼠神经发育的体外实验模型。通过分析巢蛋白基因在小鼠胚胎发育不同时期和视黄酸(Retinoic Acid，RA)诱导的胚胎性癌细胞(Embryonal Carcinoma，EC)P19体外神经分化过程中的表达规律，本发明人发现巢蛋白基因在P19神经分化过程中的表达规律与该基因在动物体内的表达模式类似。
将小鼠巢蛋白基因的调控序列构建到含荧光素酶报告基因的pGL3载体上，通过脂质体LipofectAMINE转染P19细胞。利用Promega公司的双荧光素酶报告基因检测试剂盒(dual-luciferase reporter assay system)检测报告基因的活性，从而确定出小鼠巢蛋白基因的调控区域。
为了分析小鼠巢蛋白基因的启动子特性，构建了一系列质粒。以pNX7为模板，设计引物作PCR反应得到小鼠巢蛋白基因cDNA 5′上游887bp及2,660bp的片段。这两个片段克隆进T-vector后构建成质粒CLP3和CLP5。
制备质粒CLP3时所用引物为正向5′-GAGAACGCGTAGAGCCGCGTAACTTCTTCACT-3′(SEQ ID NO3)；反向5′-GAGACTCGAGGTGGAGCACTAGAGAAGGGAGT-3′(SEQ ID NO4)。
制备质粒CLP5所用引物为正向5′-GAGAACGCGTGGCAGGTGGCTCACAACTATCT-3′(SEQ ID NO5)；反向5′-GAGACTCGAGGTGGAGCACTAGAGAAGGGAGT-3′(SEQ ID NO4)。
测序鉴定后，CLP3和CLP5用限制性内切酶Mlu I和Xho I切割并分别回收895bp和2,668bp片段。这两个片段与经同样两种限制性内切酶处理的含报告基因的载体pGL3-Basic(购自Promega公司)连接，得到克隆pNH85和pNH83。
pNX7经限制性内切酶Sac I及Aat II切割后，回收3.2Kb的片段。该片段构建到经两种同样限制性内切酶处理的pNH85中，得到质粒pNH84(图2)。pNH84中插入质粒pBluescript KSII(-)的多克隆位点后，得到质粒pNH81。pNH81经限制性内切酶Pst I或Apa I切割后作自连反应，可得到质粒pNH82及pNH86。PNH81经限制性内切酶EcoR V及Pvu II切割后作自连反应，得到质粒pNH87。
除了按照5′到3′的方向对小鼠巢蛋白基因5′上游序列作系列缺失外，本发明人在质粒pNH84的基础上分别缺失5′上游近端2,342bp及780bp，得到质粒pNH45及pNH46。pNH45为pNH84经Nco I酶切后自连而成。它包含小鼠巢蛋白基因5′上游远端1,650bp长的序列。质粒pNH84经Aat II和Xho I酶切后，回收8,007bp长的片段。该片段经绿豆核酸酶处理后，自连得到质粒pNH46。pNH46包含小鼠巢蛋白基因5′上游远端3,212bp长的序列。
对获得的质粒进行荧光素酶活性检测，结果如图3所示。分析结果表明，小鼠巢蛋白5′端上游344bp长的区域即具有启动子活性(图3)。小鼠巢蛋白启动子元件的具体核苷酸序列如图7和SEQ ID NO1所示。
实施例3巢蛋白增强子元件的鉴定为了验证小鼠巢蛋白基因第2个内含子是否具有中枢神经系统特异表达的特性，本发明人首先在体外检测其对报告基因转录调控的活性。
在构建转细胞系列缺失质粒的过程中，先对带报告基因荧光素酶的质粒pGL3-Promoter进行改造。pGL3-Promoter经XhoI酶切后，用Klenow酶补平，然后自连以消除XhoI位点。为方便构建系列缺失质粒，把pBluescript II SK(-)上SacI至KpnI间的多克隆位点构建到去除XhoI位点的pGL3-Promoter中，并命名该质粒为pGL3-Px′。
巢蛋白基因的第2个内含子来自克隆pNB6。系列缺失质粒的构建过程参见图4。
报告基因检测结果显示，小鼠巢蛋白基因的第二个内含子3′端约800bp长的区域对报告基因的表达具有增强作用(图5)。小鼠巢蛋白增强子元件的具体核苷酸序列如图8和SEQ ID NO2所示。
实施例4构建含小鼠巢蛋白启动子元件和/或增强子元件的构建物在得到小鼠巢蛋白基因的启动子和增强子区域的基础上，构建包含小鼠巢蛋白基因启动子、增强子及报告基因lacZ的DNA片段制备转基因小鼠。质粒pNH86经限制性内切酶Kpn I及Xho I切割后，得到小鼠巢蛋白基因启动子344bp片段。该片段与经Kpn I及Xho I切割的载体pβgal-Basic(购自Clontech公司)_连接得到质粒pNH101。质粒pNH92经限制性内切酶Bgl II切割后，得到小鼠巢蛋白基因增强子753bp片段。该片段与经Bgl II切割及牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理的载体pNH101连接得到质粒pNH102。用限制性内切酶Apa I将质粒pNH102线性化，制备转基因小鼠。转基因小鼠的制备按文献所述的方法(Section 19Transgenic mouse preparation.in Basic Methods in MolecularBiology/Leonard G.Davis，W.Michael Kuehl，James F.Battey.-2nd ed.1994.By Appleton&Lange Norwalk，Connecticut，USA.)。
构建物如图6A所示，从5′至3′方向，依次含有小鼠巢蛋白基因344bp启动子区域、753bp增强子区域、报告基因lacZ及载体序列。
实验结果如图6B和C所示，报告基因lacZ与内源巢蛋白基因相似的表达模式表明，小鼠巢蛋白基因的启动子在动物体内具有功能，而其第二内含子3′端约753bp(在SEQ ID NO2中为753bp)长的区域则具有指导外源基因在神经干细胞中表达的能力。
实施例5利用PCR从小鼠基因组DNA获得小鼠巢蛋白启动子元件合成如下引物正向引物5′-GGGCCCAGTTCTGTGCA-3′(SEQ ID NO6)，反向引物5′-GTGGAGCACTAGAGAAG-3′(SEQ ID NO7)。
以小鼠基因组DNA为模板，在如下条件进行PCR反应94℃，1min；45℃1min；72℃ 30sec，共35个循环。获得了约350bp的扩增产物。对扩增产物进行测序鉴定，结果表明与SEQ ID NO1所示的小鼠巢蛋白启动子元件的序列相符。
小鼠巢蛋白启动子元件可用于指导外源基因的表达，尤其在哺乳动物细胞中的表达。
实施例6利用PCR从小鼠基因组DNA获得小鼠巢蛋白增强子元件合成如下正向引物5′-AGATCTAGGAGAGGAGCT-3′(SEQ ID NO8)，反向引物5′-GGATCACTCTTTATTGTG-3′(SEQ ID NO9)。
以小鼠基因组DNA为模板，在如下条件进行PCR反应94℃，1min；45℃1min；72℃ 1min，共35个循环。获得了约750bp的扩增产物。对扩增产物进行测序鉴定，结果表明与SEQ ID NO1所示的小鼠巢蛋白增强子元件的序列相符。
小鼠巢蛋白组织特异性增强子可用于在哺乳动物发育的神经系统中过量表达外源基因。这可用于研究基因功能、建立神经疾患的动物模型及神经疾患的基因治疗。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(ii)发明名称小鼠巢蛋白基因启动子及其组织特异性增强子(iii)序列数目9(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度344bp(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GGGCCCAGTT CTGTGCATCT TAGGGTGTTC TGGGCTGTCT GGCTGTATCT CAAGCCTCTT 60TCGGAAAATC ACCCGCACCG GACGGGATCC CCGCCAGGGC GAGGCTACAA TTTGATTCTT 120CTCTGCTGAG CTGGGATGAT GCAGGGACCC GGGCTGTGTG TTGCACTGAA CTCTAAAGGG 180TTAAGGCCTA GGGACCGCCC CTTTTCCGCC CGGCCGGCGG GAGTATGAAT ACCCTCGCTT 240CAGCTCGCTG CTGGAATCCT CCGCTTCCGC TGGGTCACTG TCGCCGCTAC TCCCTTTCTC 300CCCCTTAAAA GCTCCAAGGG CCACTCCCTT CTCTAGTGCT CCAC 344(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度753bp(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO2AGATCTAGGA GAGGAGCTGG AGGGTAGAAG TCCAGAGAAG GGAAGCCAGT GAGTGTCTAG 60GAAGGACTGA ATGCACAAGG CAGGACACTA TGAGGACGGA GGAAAGGCTA TTTTGAGAAC 120CAGATGTGCT CAGAGGCCAT GAATGGAAAC AAGGGACTAG CTCCGAATCC CTTGTGAACT 180GATTCCCCTC ATCTCCTCCC ATCAGCTGTG AACCTAAAGA CCTCTGGCCT GAAGGAGGAT 240TTGTGATCCT AAGATGAGGG CCTTCGCCCC AGTCAGTCTT CTGAGGCGAG GGGAAGGGTC 300CAGGCAGCTC TGAGGAATGT AAGCACTGGT GTTTGCGGTC TGAAAAGGAT TTGGAGAAGG 360AGAGCTGAAT TCATTTGCTT TTGTCTGTCA CCAGCTCTGG GGGCCTAGGA GAGAGCCATC 420CCATGGGAAC AGCCTGAGAA TTCCCACTTC CCCTGAGGAG CCCCTCCTTC TCAGGCCCTC 480CAGATGGTAG TGTGGACAAA AGGCAATAAT TAGCATGAGA ATCGGCCTCC CTCTCCGAGG 540ATGAGGTCAT CGGCCTTGGC CTTGGGTGGG GAGGCGGAGA CTGATCTGAG GAGTCTGATC 600GAAGTGTTAG CAATTCACTT GGCCCTGCTT CCGAATGTGG GAATCTGCGT GTGGGGTCTC 660CCTGAGTCTC AAATATGGGT TCACCAAGTA TATATCTGTG GGTATATGAC TGTGTGGCTT 720TCATACGACA ATGGTCACAA TAAAGAGTGA TCC 753(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度32碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3GAGAACGCGT AGAGCCGCGT AACTTCTTCA CT 32(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度32碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4GAGACTCGAG GTGGAGCACT AGAGAAGGGA GT 32(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征
(A)长度32碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5GAGAACGCGT GGCAGGTGGC TCACAACTAT CT32(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度17碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6GGGCCCAGTT CTGTGCA 17(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度17碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7GTGGAGCACT AGAGAAG17(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度18碱基(B)类型核酸(C)链性单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8AGATCTAGGA GAGGAGCT18(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度18碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO9GGATCACTCT TTATTGTG 18
权利要求
1.一种启动子元件，其特征在于，它包括巢蛋白基因启动子的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的启动子元件，其特征在于，它包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一种增强子元件，其特征在于，它包括小鼠巢蛋白基因的第二内含子的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述增强子元件，其特征在于，它包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
5.一种用于在神经干细胞中特异性表达的构建物，其特征在于，它含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的权利要求3所述的增强子元件。
6.如权利要求5所述的构建物，其特征在于，它还含有与该外源基因可操作地连接的权利要求1所述的启动子元件。
7.如权利要求6所述的构建物，其特征在于，所述的启动子元件包含SEQ IDNO1所示的核苷酸序列，而且所述的增强子元件包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的启动子元件。
9.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的增强子元件。
10.一种在神经干细胞中特异性表达外源基因的方法，其特征在于，它包括步骤(a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的增强子元件，所述的增强子元件包含小鼠巢蛋白基因的第二内含子的核苷酸序列，(b)将步骤(a)中的构建物导入神经干细胞，使外源基因在神经干细胞中表达。
全文摘要
本发明提供了小鼠巢蛋白启动子元件和增强子元件,含这些元件的构建物和载体,以及它们的用途。本发明的巢蛋白启动子元件和/或增强子元件可用于指导外源基因的表达,研究神经系统发育过程中重要分子的功能、神经疾患动物模型的建立以及神经疾患的基因治疗。
文档编号C12P19/34GK1355317SQ0012762
公开日2002年6月26日 申请日期2000年11月30日 优先权日2000年11月30日
发明者景乃禾, 程乐平, 高翔 申请人:中国科学院上海生物化学研究所