专利名称：乳腺癌单抗m4g3单链抗体的制备及其dna序列的制作方法
乳腺癌单抗M4G3单链抗体的制备及其DNA序列[技术领域]本发明属于生物技术领域，具体的说制备出一种用于乳腺癌靶向治疗的鼠源性单链抗体 (M4G3-scFv)并确定其DNA序列。[背景技术]鼠源性单克隆抗体M4G3是人乳腺癌特异性抗体。经免疫病理学研究表明，其与临床病 理诊断符合率为94%，并可鉴别诊断分化不良、来源不明的癌转移淋巴结。用共沉淀法制成 的磁性毫微囊(MNP)耦联抗肿瘤药物阿霉素、表阿霉素、氨甲喋呤等进行体外抑瘤实验表 明，其杀瘤率显著提高，且抗体活性保留80%以上。但是，由于M4G3单抗是鼠源性单抗， 分子量较大，长期反复使用时可诱发人体产生抗鼠的抗体，发生过敏反应(HAMA)，因此在 乳腺癌的临床应用中受到一定的局限。[发明内容]为了克服这一缺欠，利用基因工程抗体技术将编码M4G3单抗的轻重链可变区的DNA 序列进行扩增，并构建了可表达单链抗体(M4G3-scFv)的相关载体。成功地将鼠源性单克隆 抗体M4G3改造成单链抗体(M4G3-scFv)。由于单链抗体仅有M4G3单抗的V区而去掉了恒 定区(C区)，因此既保存了M4G3单抗的结合特点，又大大降低了其免疫原性，并且穿透力 增强，容易进入局部组织尤其是实体瘤中发挥作用。克隆有M4G3-scFv序列的表达载体可以 在宿主菌中表达M4G3-scFv单链抗体，为单链抗体的大批量生产提供了条件。本发明是这样实现的。从M4G3单抗杂交瘤细胞中提取总RNA，分别扩增重链可变区基 因(VH)与轻链可变区基因(VL)，通过一段灵活的连接肽序列连接形成一个单链抗体(ScFv) 融合基因，与表达载体pCANTAB5E重组，置于Lac启动子/控制子调控之下，并位于M13
噬菌体pill先导序列和pill基因之间，与辅助噬菌体M13K07 —起在大肠杆菌TGI中表达， 组装成ScFv，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面。采用细胞淘选法，利用pIII融合蛋白进行淘选，野生型pin蛋白进行再感染，共进行三轮淘选，从中挑选重组阳性克隆，鉴定并测序。本发明制备出单链抗体(M4G3-scFv)并确定其DNA序列。此单链抗体编码M4G3单抗的 重链可变区DNA序列375bp，编码M4G3单抗的K轻链可变区DNA序列321bp，以及编码 M4G3-scFv单链抗体的DNA序列全长为741bp。1、 编码M4G3单抗的重链可变区DNA序列375bp,序列为(见说明书序列表)2、 编码M4G3单抗的K轻链可变区DNA序列321bp，序列为(见说明书序列表)3、 编码M4G3-scFv单链抗体的DNA序列全长为741bp,序列为(见说明书序列表) [
]图l为鼠源性抗乳腺癌单链抗体(M4G3-scFv)的乳腺癌组织免疫染色反应 图2为大量制备可溶性M4G3-scFv的western blot鉴定 [具体实施方法]下面对本发明作详尽描述 实验材料1 、鼠源性乳腺癌特异性单抗M4G3杂交瘤细胞2、 Expression Module (recombinant phage antibody system) PHARMACIA BIOTECH 3 、 M-MulV逆转录酶；Taq DNA聚合酶；限制性核酸内切酶Sfi I/Not I (Takara) 4、 M4G3单抗阳性的乳腺癌细胞系T47D 实验步骤参见PHARMACIA BIOTECH (27-9401-01)试剂盒说明书 1、 轻链、重链可变区的扩增鼠源性乳腺癌特异性单抗M4G3杂交瘤细胞的培养一提取总 RNA —反转录成cDNA —用轻链、重链引物(试剂盒提供)扩增L-DNA和H-DNA2、 ScFv融合基因的克隆用Linker (试剂盒提供)进行重叠PCR将L-DNA和H-DNA连接起 来一PCR扩增ScFv融合基因 一Sfil/Notl酶切一连入pCANTAB5E载体，位于M13 噬菌体pIII先导序列和pIII基因之间一转化感受态细胞TG13、 阳性噬菌体抗体库的淘选选择转化的细菌，添加M13K07辅助噬菌体，共培养释放噬菌 体，用M4G3单抗阳性的乳腺癌细胞系T47D淘选表达M4G3-scFv的噬菌体，共3次。4、 阳性克隆的鉴定经过3次淘选得到的噬菌体感染大肠杆菌TG1，提取噬菌粒，测序鉴定。 以乳腺癌病理切片为靶抗原，阳性噬菌体为一抗，辣根过氧化物酶标记的抗噬菌体抗体为 二抗，进行酶免染色。5、 M4G3-scFv的大量制备与纯化将阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151 ，收集培养上清，利 用抗E-tag sepharose柱纯化富集分泌入培养基中的可溶性M4G3-scFv， western blot鉴定。实验结果1、 编码M4G3单抗的重链可变区DNA序列375bp，序列为(见说明书序列表)2、 编码M4G3单抗的K轻链可变区DNA序列321bp，序列为(见说明书序列表)3、 编码M4G3-scFv单链抗体的DNA序列全长为741bp，序列为(见说明书序列表)4、 鼠源性抗乳腺癌单链抗体(M4G3-scFv)的免疫染色反应 乳腺癌细胞呈现明显的阳性反应，间质不着色。5、 大量制备可溶性M4G3-scFv的western blot鉴定M4G3-scFv的分子量约为30KD。
序列表<110>天津医科大学附厲肿瘤医院<120>乳腺癌单抗M4G3单链抗体的制备及其DNA序列<210> 1<211> 375<212> DNA<213>小虽(Mus musculus ) <220><221> V—region <222>(1)...(375)<223> M4G3单抗重链可变区基因 <400> 13tggccc3gg tgaagctgc3 ggagtctggg ggaggcttat tgaagcctgg agggtccctg60 aaactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtagct atgccatgtc ttgggttcgc120 cagactccgg agaagaggct ggagtgggtc gctaccatta gtagtggtgg tggttacacc180 tactatccag acagtgtgaa gggtcgattc accatctcca gagacaatgc caagaacacc 240 卿acctgc aaatgagcag tctgaggtct gaggacacgg ccatgtattt ctgtgcaaga 300agggactacg gtagtcgct3 cgggaattat gctgtggact actggggcca aggcaccacg 360 gtcsccgtct cctcs 375 <210>2 <211>321 <212> DNA<213>小鼠(Mus musculus ) <220><221> V—regi。n <222>(1)...(321)<223> M4G3单抗轻链可变区基因 <400> 2gacattgtgc taacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gagggtcacc60 atgacctgca gtgccagctc aagtat3cgt tacatatatt ggtaccaaca gaagcctgga120 tcctccccc3 gactcctgat tt3tgacac3 tccaacgtgg ctcctggagt ccc加cgc180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcaaccgaat ggaggctgag 240 gatgctgcca cttattactg ccaggagtgg agtggttatc cgtacacgtt cggagggggg300 3C333gttgg 333taa33cg g321 <210>3 <211>741<212> DNA<213>人工序列<220><221> V—region <222> (1)…(375)<223> M4G3单抗重链可变区基因 <220><222> (376)…(420) <223> linker序列 <220><221> V—region<222> (421)…(741)<223> M4G3单抗轻链可变区基因<400> 33tggccc3gg tgaagctgca ggagtctggg ggaggcttat tgaagcctgg agggtccctg 60 aaactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtagct atgccatgtc ttgggttcgc 120 cagactccgg agaagaggct ggagtgggtc gctaccatta gtagtggtgg tggttacacc 180tactatccag acagtgtgaa gggtcgattc accatctcca gagacaatgc caagaacacc 240
ctgt3cctgc a33tgagcag tctgaggtct g3gg3cacgg ccstgtattt ctgtgcsiaga 300gact3cg gtagtcgct3 cggg33ttet gctgtggact actggggccaacc3cg 360 gtc3ccgtct cctcsggtgg 3ggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg 420g3c3ttgtgc tsacccsgtc tccagc33tc 3tgtctgc3t ctcc3gggga gagggtcscc 480atgacctgca gtgccagctc aagtatacgt tacatatatt ggtaccaaca gaagcctgga 540tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacgtgg ctcctggagt cccttttcgc 600ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcaaccgaat ggaggctgag 660gatgctgcca cttattactg ccaggagtgg agtggttatc cgtacacgtt cggagggggg 7203C333gttgg 333t3333cg g 741 .
权利要求
1、一种鼠源性乳腺癌特异性的单链抗体及其DNA序列，此单链抗体源自于鼠源性乳腺癌特异性单抗M4G3。其特征在于编码M4G3单抗的重链可变区DNA序列375bp，编码M4G3单抗的K轻链可变区DNA序列321bp，以及编码M4G3-scFv单链抗体的DNA序列全长为741bp。
2、 根据权利要求1所述的鼠源性乳腺癌特异性的单链抗体，其特征为编码M4G3单抗的重链 可变区DNA序列375bp，序列为CTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCA
3、根据权利要求1所述的鼠源性乳腺癌特异性的单链抗体，其特征为编码M4G3单抗的K 轻链可变区DNA序列321bp，序列为
4、根据权利要求l所述的鼠源性乳腺癌特异性的单链抗体，其特征为编码M4G3-scFv单链 抗体的DNA序列全长为741bp，序列为<formula>formula see original document page 3</formula>
全文摘要
本发明制备出一种用于乳腺癌靶向治疗的鼠源性单链抗体(M4G3-scFv)并确定其DNA序列，属于生物技术领域。此单链抗体源自于鼠源性乳腺癌特异性单抗M4G3，其编码的DNA序列全长为741bp，包含编码M4G3单抗的重链可变区DNA序列375bp，以及编码M4G3单抗的K轻链可变区DNA序列321bp。本发明保留了原有抗体对于乳腺癌的特异性，又降低了对人体的抗原性，成为乳腺癌治疗的靶向载体。
文档编号C12N15/13GK101148670SQ200610015720
公开日2008年3月26日 申请日期2006年9月22日 优先权日2006年9月22日
发明者史玉荣, 孙保存, 霖 张, 毅 杨, 昀 牛, 牛瑞芳, 王德发, 郝希山, 魏熙胤, 黄建英 申请人:天津医科大学附属肿瘤医院