专利名称：一种亲和人白蛋白核酸适配子的制备与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是一种与人白蛋白具有高特异性 和高亲和性结合能力的核酸适配子的制备与用途。(二) 背景技术人白蛋白由肝细胞生成，主要存在于血浆，具有广泛的生物学功 能，临床大量需要白蛋白的输入治疗，以及体液中白蛋白的检测辅助 疾病的诊断。如血中白蛋白浓度的增高常见于严重失水而导致的血 浆浓縮，降低则多见于慢性肝炎、肝硬化、肝癌、肾炎等肝脏、肾脏 疾病。尿中微量白蛋白的检测对一些肾病功能失调的病症是一个较尿 常规或尿总蛋白检查更为敏感的指标，特别是在慢性肾功能损伤性疾 病，如糖尿病性肾病、高血压、系统性红斑狼疮等疾病过程中，微量 白蛋白尿的检测对提示肾脏功能改变更具有敏感性。最近的一些研究 认为，微量白蛋白尿不仅是糖尿病并发症早期诊断的指标，而且对高 血压和心血管疾病的发生、发展、预后、治疗效果评价等也具有重要 参考价值，该指标阳性是血管广泛损伤的早期标志和独立危险因素。 因此微量白蛋白尿检查的应用范围已经扩大到作为心血管疾病、高血 压等疾病的常规检査项目，通过这一检查可以发现潜在病变，为疾病 的早期诊断、早期治疗提供有用的信息及实验室指标。目前，常用测 定微量尿蛋白的方法是放射免疫法，还有人进行酶联免疫测定试剂盒 的研制。系统进化指数富集技术(SELEX技术)是20世纪90年代初发 展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核苷酸文 库，结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核 苷酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的寡核苷酸适配子 (aptamers)。该技术己成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离 子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。(三) 发明内容本发明的目的是通过系统进化指数富集技术(SELEX技术)筛选 人白蛋白的寡核苷酸适配子来替代抗体，提供一种简洁快速、高灵敏 度、高特异性的人白蛋白早期检测及分离纯化方法。本发明的技术方案本发明中用于系统进化指数富集技术筛选的单链DNA随机文
库及引物，由美国invitrogen公司合成，两端为固定序列，中间为35 个碱基的随机序列5'-ATCCGCCTGATTAGCGATACT- (N35)-ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG-3'，库容量为10"以上；引物l:5'-ATCCGCCTGATTAGCGATACT—3';引物2:5'-biotin- CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3';引物3 : 5'-biotin- ATC CGCCTGATTA GCGATACT-3';引物4: 5'-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCA AGT-3'。人白蛋白购于天津华生生物科技有限公司；GelRed核酸染料购于Biotium公司；硝酸纤维素滤膜购于美国密理博(MilliPore)公司；寡聚核苷酸的纯化试剂购于北京天为时代公司；PCR试剂盒和T载体购于美国普洛麦格(Promega)公司。一种亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于核苷酸序列为 ATCCGCCTGATTAGCGATACTGGGACTGACTGATACGAAGG CATGATTGGGACACTACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGG或 ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCGGAATTGGATGAATCGGG ACCACGCGAGTATATACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG所示的DNA分子。一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于单链DNA序 列为附图1所示的両种结构之一。一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于具有相同功能 的寡核苷酸适配子同源序列占60%以上。一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于衍生的RNA 序列具有相同的功能。一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于为能与DNA 序列进行杂交的寡核苷酸序列。一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于在核酸适配子的任何位置删除或增加部分寡核苷酸残基所得到的寡核苷酸适配子 序列具有相同的功能。一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于在核酸适配子 的任何位置进行核苷酸种类和稀有碱基的置换后，得到的寡核苷酸适
配子序列具有相同的功能。一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于在核酸适配子 的任何位置进行磷酸化、甲基化、氨基、巯基、同位素、生物素、地 高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记修饰后，得到的寡核苷酸适 配子序列具有相同的功能。一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于用于人白蛋白 的检测和分离纯化。一种上述亲和人白蛋白核酸适配子的制备方法，按以下步骤进 行1)单链DNA随机寡核苷酸文库的合成；2)利用系统进化指数 富集方法对寡核苷酸文库进行筛选；3)扩增与人白蛋白特异结合的 寡核苷酸；4)进行下一轮筛选，经过12轮以上筛选后获得目的寡核 苷酸序列；5)克隆测序。本发明的优点是具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势l)本身是寡核苷酸，分子量较小， 可以化学合成，节约成本；2)具有比抗体更高的亲和性和特异性；3) 便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；4)重复性和稳定性好， 且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感。因此，系统进化指数富集 技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。(四)
图1:亲和人白蛋白核酸适配子DNA序列和RNA序列结构图。 图2:亲和人白蛋白核酸适配子克隆的PCR鉴定显示图。图3:亲和人白蛋白核酸适配子凝胶阻滞试验显示图。 图4:亲和人白蛋白核酸适配子亲和分析试验显示图。
具体实施方式
实施例1 :体外筛选与人白蛋白特异结合的核酸适配子利用引物1: 5'-ATCCGCCTGATTAGCGATACT—3'和引物2: 5'-biotin- CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3'扩增单链DNA库，将5'端带有生物素标记的双链DNA产物与链酶亲和素磁珠结合，在 室温条件下，作用30分钟；然后用浓度为0. 15mol/L的NaOH溶液， 反应15分钟，使双链DNA变性解链；磁分离得到单链DNA;经空硝 酸纤维素膜反筛后的单链DNA与鲑鱼精DNA及白蛋白共同孵育；单链 DNA通过白蛋白结合于硝酸纤维素膜上，将单链DNA从白蛋白上洗脱 下来，用作扩增的模板，进行下一轮筛选；共进行12轮筛选，且在
最后几轮筛选中，加入低于100ng白蛋白，以便得到预期具有高亲和 力的寡核苷酸；以第12轮筛选所得文库为模板进行PCR;琼脂糖电 泳后回收81bp处片断，与T载体在4'C的条件下持续反应16 18小 时，转化感受态细胞；涂板进行蓝白斑筛选，在37'C条件下培养16 18小时后，挑取单克隆白斑，置氨苄液体培养基摇菌16 18小时； 提取质粒，经PCR鉴定有目的条带者进行序列测定。如图1所示81bp 的目标条带。实施例2:以凝胶阻滞法检测每轮筛选所得单链DNA将每轮所筛的为单链DNA模板，利用引物3: 5'画biotin- ATC CGCCTGATTA GCGATACT-3'禾口引物4: 5'-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCA AGT-3'进行不对 称PCR，以此为检测探针与白蛋白孵育，将孵育的复合物经非变性聚 丙烯酰胺电泳，经GelRed染料染色，观察条带情况，如图2所示。 由于蛋白-核酸适配子复合物的形成，导致凝胶条带的阻滞，表明核 酸适配子与白蛋白结合的亲和特异性。实施例3:采用生物素修饰的核酸适配子用于人白蛋白的检测合成并用生物素修饰标记的核酸适配子，点杂交法测定目的适配子与人白蛋白的亲和特性将白蛋白以一系列量即质量分别为0、0.1、 0.2、 0.3、 0.4(ig点在硝酸纤维素膜上，待吸收完全后，将膜以3 %牛血清白蛋白(BSA)和100^1鲑鱼精DNA在室温条件下封闭l 1.5小时；然后将合成生物素标记的DNA适配子以TBS缓冲液 (Tris-HCh浓度0.05M、 pH 7.4)稀释至lml体积，与膜杂交；室 温下经1小时，用TBS缓冲液清洗后，用辣根酶标记的亲和素孵育， 发光显迹。结果如图3所示，在对照处无斑点产生，而白蛋白处呈现 黑色斑点，表明核酸适配子与白蛋白结合的特异性，可用于白蛋白的 检测。实施例4:核酸适配子作为亲和配基用于人白蛋白的分离纯化 将获得的核酸适配子作为亲和配基偶联在磁珠上；与人血清混合 孵育；用磁分离装置分离磁珠，将吸附在磁珠上的白蛋白经过洗脱， 即可得到人白蛋白的纯品，达到人白蛋白的分离纯化。
权利要求
1.一种亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于核苷酸序列为ATCCGCCTGATTAGCGATACTGGGACTGACTGATACGAAGGCATGATTGGGACACTACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGG或ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCGGAATTGGATGAATCGGGACCACGCGAGTATATACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG所示的DNA分子。
2. 根据权利要求1所述的亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于 单链DNA序列为附图1所示的両种结构之一。
3. 根据权利要求1所述的亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于 具有相同功能的寡核苷酸适配子同源序列占60%以上。
4. 根据权利要求1所述的亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于衍生的RNA序列具有相同的功能。
5. 根据权利要求1所述的亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于为能与DNA序列进行杂交的寡核苷酸序列。
6. 根据权利要求1所述的亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于在核酸适配子的任何位置删除或增加部分寡核苷酸残基所得到的寡 核苷酸适配子序列具有相同的功能。
7. 根据权利要求1所述的亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于:在核酸适配子的任何位置进行核苷酸种类和稀有碱基的置换后，得到 的寡核苷酸适配子序列具有相同的功能。
8. 根据权利要求1所述的亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于:在核酸适配子的任何位置进行磷酸化、甲基化、氨基、巯基、同位素、 生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记修饰后，得到的 寡核苷酸适配子序列具有相同的功能。
9. 根据权利要求1-8中任何一种所述的亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于用于人白蛋白的检测和分离纯化。
10.—种亲和人白蛋白核酸适配子的制备方法，体外筛选与人白蛋 白特异结合的核酸适配子，其特征在于实施步骤如下利用引物1: 5'-ATCCGCCTGATTAGCGATACT—3'和引物2: 5'-biotin-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3'扩增单链DNA库，将5'端带有生物素标记的双链DNA产物与链酶亲和素 磁珠结合，在室温条件下，作用30分钟；然后用浓度为0. 15mol/L 的NaOH溶液，反应15分钟，使双链DNA变性解链；磁分离得到单链 DNA;经空硝酸纤维素膜反筛后的单链DNA与鲑鱼精DNA及白蛋白共 同孵育；单链DNA通过白蛋白结合于硝酸纤维素膜上，将单链DNA从 白蛋白上洗脱下来，用作扩增的模板，进行下一轮筛选；共进行12轮 筛选，且在最后几轮筛选中，加入低于100ng白蛋白，以便得到预期 具有高亲和力的寡核苷酸；以第12轮筛选所得文库为模板进行PCR; 琼脂糖电泳后回收81bp处片断，与T载体在4'C的条件下持续反应 16 18小时，转化感受态细胞；涂板进行蓝白斑筛选，在37'C条件 下培养16 18小时后，挑取单克隆白斑，置氨苄液体培养基摇菌16 18小时；提取质粒，经PCR鉴定有目的条带者进行序列测定。如图l 所示81bp的目标条带。
全文摘要
一种亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于核苷酸序列为ATCCGCCTGATTAGCGATACTGGGACTGACTGATACGAAGGCATGATTGGGACACTACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGG所示的DNA分子，采用系统进化指数富集技术筛选人白蛋白的寡核苷酸适配子的方法制备，可替代抗体用于人白蛋白的检测和分离纯化。衍生的RNA序列和通过杂交、删除、增加、置换或修饰而衍生的寡核苷酸序列具有相同的功能。本发明具有简便、快速、经济等特点寡核苷酸分子量较小，可以化学合成，节约成本；具有比抗体更高的亲和性和特异性；便于标记且可在不同部位有选择性的标记；重复性和稳定性好，且易于保存。
文档编号C12N15/12GK101148667SQ200610015739
公开日2008年3月26日 申请日期2006年9月22日 优先权日2006年9月22日
发明者吴淑庆, 弓景波 申请人:国家纳米技术与工程研究院;清华大学