专利名称：：回收Cohn氏组分Ⅳ沉淀中白蛋白的方法
技术领域：
：本发明涉及血制品的分离方法，具体是采用低温乙醇法从Cohn氏组分IV沉淀中分离回收白蛋白的方法。
背景技术：
：低温乙醇工艺分离血浆蛋白，自20世纪40年代创建以来，至今已有60年的历史。Cohn教授及其领导的开发团队所创立的Cohn6法已成为白蛋白分离的经典方法，是国际上通用的血浆白蛋白分离工艺的基础。随后所使用的各种白蛋白分离方法依旧以Cohn6法中的pH值、温度、乙醇浓度、离子强度和蛋白浓度5项参数为依据，通过不同的参数组合，可进行其它多种蛋白制品的分离。Cohn氏组分IV沉淀中残留有少量白蛋白。从人血组分IV沉淀中分离白蛋白的方法基本使用低温乙醇法和热乙醇法。低温乙醇法是在低温下，以乙醇作为溶剂，利用白蛋白与其它杂蛋白结晶条件的不同而将白蛋白与其它杂蛋白分离。《中国药业》2003年第12巻第04期《从Cohn氏组分IV沉淀中回收白蛋白的低温工艺》，在低温乙醇法的基础上进行改进，控制温度、乙醇浓度、酸碱度，提取组分IV沉淀中残留的白蛋白，每千克组分IV沉淀可回收白蛋白50g左右。热乙醇法是将组分IV沉淀配制成蛋白液，加热使蛋白液中的杂蛋白变性固化，再通过加压过滤使固液分离，将滤液超滤浓縮得到白蛋白粗制品，如CN1660898A、CN1660903A公开的方法，但回收率也不高。
发明内容本发明的目的提供一种从Cohn氏组分IV沉淀中回收白蛋白的方法，该方法是在低温乙醇法的基础上，选择适当的温度、乙醇浓度、酸碱度的参数组合，使白蛋白与其它蛋白分离，大大提高白蛋白回收率。本发明方法包括以下步骤A.取组分IV沉淀，加入组分IV沉淀重量的8士0.5倍的02t:，重量浓度0.75±0.03%的NaCl溶液，搅拌溶解后，用醋酸/醋酸钠缓冲液和/或NaHC03水溶液调整pH值至6.90±0.10，搅拌5-7小时成为反应液；B.用醋酸/醋酸钠缓冲液调整反应液pH值至5.70±0.05，降温至_0.5±0.5°C，喷雾加入体积浓度大于60%的乙醇，反应液逐渐降低温度至-4.5±0.5°C，乙醇加入量为反应液中乙醇的体积浓度达到40%，乙醇加完后，将反应液pH值调整在5.85-5.90，继续搅拌13小时，静置8小时以上，然后将反应液离心过滤，取滤液；C.滤液用含0.4±0.lmol/L醋酸和体积浓度40±1.0%乙醇的醋酸-乙醇混合溶液调节至pH值为4.70±0.IO，搅拌13小时，在-9.0±1.(TC静置8小时以上，过滤，收集沉淀物即粗制白蛋白；D.将粗制白蛋白纯化、浓縮、巴氏病毒灭活，可配制成注射用人血白蛋白。3在步骤A中，NaCl溶液最好分两次加入，第一次加入组分IV沉淀重量的24倍，反应液搅拌成糊状，再补加剩余的NaCl溶液。喷雾加入的乙醇体积浓度优选为7595%。本发明方法通过选择pH值、乙醇浓度、酸碱度和温度，使组分IV沉淀中的白蛋白与其它蛋白充分分离，每公斤组分IV沉淀可制得白蛋白110120克，使血浆中白蛋白的总提取率提高到93%以上。具体实施例方式—、组分IV沉淀的解冻及溶解从-3(TC以下冷库中取出组分IV沉淀，称重后置于洁净的不锈钢反应罐中，向反应罐中泵入组分IV重量的3倍的02°C，0.75wt%的NaCl溶液，搅拌溶解，反应液成为糊状。完全溶解后，将反应液pH值调至6.90±0.10，并在该pH条件下搅拌57小时，搅拌速度为14001500rpm。再补加组分IV重量的5倍的0-2°C，0.75wt^的NaCl溶液，充分搅拌均匀。二、沉淀分离其它蛋白向反应液中喷雾加入pH值4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液，加入速度150200m1/min，将反应液pH值调至5.70±0.05，将反应液温度降至-0.5±0.5°C。喷雾加入95%(v/v)乙醇，反应液逐渐降温至-4.5±0.5°C，乙醇加入量为反应液中乙醇的体积浓度为40%。乙醇加完后，继续搅拌15分钟，取样测定pH值应为5.85-5.90，若不在此范围，用0.5mol/L的NaOH溶液或pH值4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液矫正，继续在_4.5±0.5"C搅拌1.5小时，静置8小时以上。将反应液离心过滤，取滤液。三、白蛋白的沉淀滤液用50%(v/v)乙醇调至乙醇浓度40%(v/v)，继续搅拌15分钟，复测pH值，用0.5mol/LNaOH溶液或pH值4.0醋酸/醋酸钠缓冲液调节pH值为4.70±0.10，再搅拌1.5小时，在-9.0±1.(TC静置8小时以上。将反应液离心过滤，收集沉淀物即为粗制白蛋白。粗制白蛋白及时用02t:注射用水溶解，贮存于-3(rC以下的冷库。四、粗制白蛋白的纯化粗制白蛋白合批后，按粗制白蛋白重量68倍加入02t:的注射用水，于不锈钢反应罐中溶解，溶解温度控制在02t:之间。充分溶解后，补加0-2t:的注射用水至粗制白蛋白重量的911倍。启动搅拌装置，搅拌速度控制在75105转/秒，调节pH值至4.60士0.10，喷雾加入-15°〇的65%(v/v)的乙醇，直至溶液中乙醇浓度至12士0.20%(v/v)，乙醇的加入速度开始为500ml/min，溶液中乙醇浓度达到5X(v/v)时，乙醇的加入速度为1000ml/min，溶液中乙醇浓度达到10%(v/v)时，乙醇的加入速度为1500ml/min。乙醇加完后，继续搅拌1小时，按溶液重量的0.5%加入预处理好的硅藻土，保持溶液温度在_2.5±0.5"，静置8小时以上。用经预处理好的400X400板框滤器进行深层过滤，开始滤出的液体返回到原来待深深层过滤的反应罐中，待滤出的液体澄清无乳光后开始收集，将澄清的滤液转移至另一个洁净的反应罐内。搅拌滤液，以平均《500ml/min的速度向滤液喷雾加入lmol/L的NaHC03溶液，直至滤液pH值为5.10±0.05。滤液降温至-3.5±0.5°〇，加入95%乙醇(v/v)，将滤液中乙醇浓度调整至40%(v/v)，加入乙醇过程同时降温至-9.0±1.(TC，在-9.0±1.(TC下继续搅拌1.5小时，静置8小时以上。离心过滤，控制离心速度5055L/台/小时，离心出液温度-7.5士1.(TC。过滤完毕，收集沉淀物即精制白蛋白。精制白蛋白用02t:注射用水溶解，加入0.5%硅藻土于溶液中，搅拌30分钟，用经预处理好的400X400板框滤器进行深层过滤。调整滤液pH值至7.25±0.05。将上述滤液进行两次浓縮，第一次浓縮至白蛋白含量为105g/L，用注射用水透析至残余乙醇<0.025%(v/v)，再进行第二次浓縮至白蛋白含量至210g/L。浓縮后的溶液配制成辛酸钠含量为0.165mmol/gPr，蛋白质含量为195g/L，Na+含量为150,1/L，pH值6.80±0.20的半成品。半成品进行60.0±0.5°C，10小时的巴氏病毒灭活成为注射用人血白蛋白。下表列举采用上述方法生产的3批产品技术参数。生产批号123组分IV沉淀中总蛋白量(克)4501.84788.04398.3取样分析计算的组分IV沉淀中白蛋白总量(克)801.32799.60818.08分离得到的粗制白蛋白重量(克)617.29626.59626.04粗制白蛋白纯度(％)94.794.094.0粗制白蛋白分离收率(粗制白蛋白重量/取样分析计算的组分iv沉淀中白蛋白总量X100%)77.0378.3676.53纯化后的精制白蛋白重量(克)507.33517.58536.27精制白蛋白纯度(％)98.798.498.5精制白蛋白回收率(精制白蛋白重量/取样分析计算的组分iv沉淀中白蛋白总量X100%)63.3164.7365.555<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求回收Cohn氏组分IV沉淀中白蛋白的方法，其特征在于，依次包括以下步骤A.取组分IV沉淀，加入组分IV沉淀重量的8±0.5倍的0-2℃，重量浓度0.75±0.03％的NaCl溶液，搅拌溶解后，用醋酸/醋酸钠缓冲液和/或NaHCO3水溶液调整pH值至6.90±0.10，搅拌5-7小时；B.用醋酸/醋酸钠缓冲液调整反应液pH值至5.70±0.05，降温至-0.5±0.5℃，喷雾加入体积浓度大于60％的乙醇，反应液逐渐降低温度至-4.5±0.5℃，乙醇加入量为反应液中乙醇的体积浓度为40％，乙醇加完后，将反应液pH值调整在5.85-5.90，继续搅拌1～3小时，静置8小时以上，然后将反应液离心过滤，取滤液；C.滤液用含0.4±0.1mol/L醋酸和体积浓度40±1.0％乙醇的溶液调节至pH值为4.70±0.10，搅拌1～3小时，在-9.0±1.0℃静置8小时以上，过滤，收集沉淀物即粗制白蛋白；D.将粗制白蛋白纯化、浓缩、巴氏病毒灭活、并配制成注射用人血白蛋白。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤A中，NaCl溶液分两次加入，第一次加入组分IV沉淀重量的24倍，反应液搅拌成糊状，再补加剩余的NaCl溶液。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤B中，喷雾加入的乙醇体积浓度为7595%。全文摘要本发明公开一种从Cohn氏组分IV沉淀中回收白蛋白的方法，通过选择pH值、乙醇浓度、酸碱度和温度，使组分IV沉淀中的白蛋白与其它蛋白充分分离，每公斤组分IV沉淀可制得白蛋白110～120克，使血浆中白蛋白的总提取率提高到93％以上。文档编号C07K1/14GK101792490SQ20101010181公开日2010年8月4日申请日期2010年1月19日优先权日2010年1月19日发明者汪伟军,王文杰,陈成坤,黄国华,黄育升,黄进义,黄邦春,黄锦程申请人:广东卫伦生物制药有限公司