专利名称：：基于纳米金属合金的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
的聚合酶链式反应(PCR)扩增的方法，尤其是基于纳米金属合金的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法。技术背景核酸聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是由K.Mullis于1985年发明的一种DNA体外扩增技术，此技术可以在生物体外几个小时内将极微量的目的基因成百万倍扩增，并能够特异性扩增任何目的基因或DNA片断。PCR技术是方法学上的一次革命，以其显著的三大优点特异性、高效率和忠实性对生命科学研究领域产生了巨大的影响。PCR被誉为无细胞分子克隆，其发明人于1992年获诺贝尔奖。尽管PCR反应已发展成为一项成熟技术，常规实验中失误率较小，但实际操作中，进行PCR扩增始终存在一些需要改进的问题。最突出的问题就是PCR扩增存在不同程度的非特异性。PCR作为一种体外模拟的生化反应，机制非常复杂，在链式反应过程中总是会发生一定程度的干扰副反应，如引物模板可能错配、引物结合形成二聚体等。这些副反应在常规PCR扩增时对结果的影响不是很明显，这是因为常规PCR扩增的模板数量较大，通常超过103以上，在指数级扩增的过程中模板扩增数远远大于副反应产物的扩增数，非特异性扩增比例很低。但是在以下情形中的副反应产物扩增则不能忽略，如从高度复杂的基因组模板中选择性地扩增特异性的极低拷贝数DNA、扩增单分子DNA、扩增高GC含量DNA、扩增超长DNA片段、多重PCR扩增、一次扩增不完美而再扩增等。这些副反应轻则引起非特异性扩增(在后续电泳检测中表现为弥散拖尾条带和非特异性条带)，导致扩增效率不高；重则可能导致正常扩增反应失败。而提高PCR扩增的特异性不仅取决于引物序列的优化设计，很大程度上也有赖于反应体系和程序的优化。多年以来人们对PCR反应组分的优化已经做了大量的研究，如通过向反应体系中加入甲酰胺、甘油、二甲基亚砜等，可以在一定程度上改善非特异性扩增问题，但在实际实验和应用中，有些效果并不很显著，有些添加组分(比如二甲基亚砜)过多甚至抑制聚合酶的活性。经对现有科技文献的检索发现，美国专利(USPATENT)5，646，019公开了"一种利于引发扩增核酸模板的制备方法"，该方法是在PCR体系里加入了耐热的单链结合蛋白(SSB，single-strandednucleicacidbindingprotein),SSB蛋白只结合单链DNA，但不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增，从而实现了PCR扩增的优化。由于提取纯化SSB蛋白技术复杂，试剂纯度也要求很高，导致制备成本非常高，且商品化试剂盒非常昂贵，价格是常规PCR试剂的67倍；同时为了保持单链结合蛋白的生物活性，要求严格贮存于一20。C，并且其生物活性有较短的时间期限。纳米金属合金是用非晶合金再经过处理后获得直径为10~20纳米的微晶合金，也称超微晶合金。由于这种特殊结构，使得非晶合金具有一些独特的性质，本发明尝试把纳米金属合金应用应用于聚合酶链式反应(PCR)扩增，并取得了良好的扩增效果。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于纳米金属合金的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法。该方法通过在PCR反应体系中添加一定量的纳米金属合金以达到对DNA片段的有效扩增，此方法优化效果显著、制备简便、成本低廉。本发明是通过以下技术方案来实现的一种基于纳米金属合金的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，该方法包括以下步骤(1).纳米金属合金悬浮液的制备；(2).PCR体系的配置；(3).PCR体系的优化；(4).PCR条件的设定与运行；(5).PCR产物检测；其特征在于所述的PCR体系的优化是指在PCR体系中添加纳米金属合金悬浮液。而且，所述的纳米金属合金悬浮液的制备方法为(1).先精确称取已灭菌的纳米金属合金置于已灭菌的离心管中；(2).用移液器缓慢加入灭菌水；(3).于40KHz进行超声波悬浮后即制成纳米金属合金悬浮液。而且，所述的纳米金属合金悬浮液浓度为10mg/mL，其所在PCR体系中的添加量与PCR体系的体积百分比为0.0210%。而且，所述的纳米金属合金为纳米银铂合金、纳米银铜合金。而且，所述的PCR扩增包括常规PCR扩增、高度复杂的基因组模板中选择性地扩增特异性的极低拷贝数DNA、扩增高GC含量PCR、长片段PCR和超长片断PCR扩增、多重PCR扩增、单分子PCR扩增、以及一次扩增之后的再扩增。本发明的有益效果和优点是1.该基于纳米金属合金的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法优化效果显著、制备简便、成本低廉，具有较广的应用范围，可以应用于各种PCR扩增、聚合酶延伸以及基于PCR方法基础的其他生化方法，尤其适用于一些较难扩增类型的PCR方法诸如高度复杂的基因组模板中选择性地扩增特异性的极低拷贝数DNA、扩增高GC含量PCR、长片段PCR和超长片断PCR扩增、多重PCR扩增、单分子PCR扩增、以及一次扩增不完美或不足够而需要再扩增等情形。2.本发明中使用的优化PCR扩增的纳米材料一纳米金属合金易于保存，可以长期保存在4'C，且不会失去活性；而且纳米金属合金易于从PCR反应体系中分离，给后续的PCR产物处理及应用带来方便。3.该基于纳米金属合金的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法简单易于掌握，可广泛推广，对基因检测与克隆、遗传分析、临床诊断、基因芯片以及新材料等领域有着潜在而巨大的应用价值。图1纳米银铂合金对中长片断PCR反应的优化扩增效果电泳图；图2纳米银铜合金对超长片断PCR反应的优化扩增效果电泳图；图3纳米银铂合金对高GC含量PCR扩增的优化扩增效果电泳图。具体实施方式本发明结合附图通过以下实施例进一步详述，但不局限于下述实施例。本发明所涉及的PCR技术的优化方法是通过向PCR体系中添加纳米金属合金来实现的，其具体操作方法如下1.纳米金属合金悬浮液的制备纳米金属合金购买于Sigma公司，以配置浓度为(W/V)10mg/mL的纳米金属合金悬浮溶液为例，先精确称取10mg已灭菌的纳米金属合金置于已灭菌的1.5mL的小离心管中，用移液器缓慢加入灭菌水至体积为lmL，于40KHz进行超声波悬浮，超声时间根据悬浮状况而定，一般应保证均匀的悬浮状态维持10min以上。采用的纳米金属合金包括纳米银铂合金、纳米银铜合金及类似合金。2.PCR体系的配置PCR体系根据现有的技术，因待扩增DNA片断的不同而各不相同。具体表现在dNTP、模板、Mg、引物的添加量应根据不同的模板和不同的扩增片段长度来选择。PCR反应体系中的H20为双蒸水及以上级别水，体系中水的添加量应根据纳米金属合金悬浮液添加的体积量进行调整，即应扣除相应添加的纳米金属合金悬浮液的体积量。3.PCR体系的优化将适量的纳米金属合金悬浮液加入PCR反应体系当中进行PCR扩增，所述的适量是指在25pL的PCR反应体系当中加入的优化材料的用量为纳米金属合金蒸馏水悬浮液(10mg/mL)0.5^iL5^L。4.PCR条件的设定与运行PCR反应条件中的预变性、变性及退火各阶段的温度和对应时间应根据不同模板和引物融解温度来选择；其中的延伸温度根据所用聚合酶的合适温度来选择；其中的延伸时间根据所扩增片段的长度来选择；其中的循环次数根据个人试验目的和需要进行选择。5.PCR产物的检测对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查扩增条带，与对照体系进行比较。一般用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测，琼脂糖凝胶的浓度及PCR产物的上样体积需根据具体情况而定。所述的琼脂糖凝胶电泳技术依照已有方法概括如下1)制备0.7%的琼脂糖凝胶(含染色剂溴乙锭)；2)吸取不同样本的PCR产物上电泳槽点样，同时点分子量标记作为参照；3)加以45V/cm的电压，电泳；4)凝胶成像系统紫外检测分析结果。上述的纳米金属合金悬浮液浓度为10mg/mL,其所在PCR体系中的添加量与PCR体系的体积百分比为0.0210%。上述的PCR扩增包括常规PCR扩增、高度复杂的基因组模板中选择性地扩增特异性的极低拷贝数DNA、扩增高GC含量PCR、长片段PCR和超长片断PCR扩增、多重PCR扩增、单分子PCR扩增、以及一次扩增之后的再扩增，所述的一次扩增之后的再扩增是指一次扩增不完美或不足够而需要再扩增的情形。实施例l纳米银铂合金对PCR反应的优化，针对一些形成非特异性扩增的PCR扩增的优化改进，扩增长度为4249bp的长片段，包括下列步骤1.纳米银铂合金(silver-platinum)悬浮液的制备silver-platinum购买于Sigma公司，配置浓度为(W/V)10mg/mL的纳米银铂合金悬浮液，先精确称取lOmg已灭菌的纳米银铂合金置于己灭菌的1.5mL的小离心管中，用移液器缓慢加入灭菌水至体积为lmL,于40KHz进行超声波悬浮10min。2.PCR体系的配置，具体组成如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>其中，模板为J)NA，购自三博远志生物工程公司，Taq酶购自三博远志生物工程公司。共配置PCR体系4管，且从2到5编号。3.PCR体系的优化从第2管到第5管分别依次加入纳米银铂合金悬浮液0&，2.0nL,6.0nL,8.0^iL。最后用双蒸水补足总体积为25pL。4.PCR条件的设定与运行利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增条件为93'C预热2min，33个循环，每个循环包括93。C变性10s,58.rC退火30s，68'C延伸3min，最后68。C延伸10min。5.对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测-结果见图1。目的片段为4249bp，从左至右1为分子量标记LambdaDNA/HindlII(MBI公司，由DNA片段由上至下为23，130bp、9,416bp、6，557bp、4，361bp、2，322bp、2，027bp、564bp以及125bp而构成)2为普通反应体系结果，3、4、5为普通反应体系加入silver-platinum悬浮液的结果。可以看出加入优化材料silver-platinum的体系PCR扩增结果中非特异性扩增极少，而相应的未加入silver-platinum的常规PCR体系扩增结果显示严重的后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明的优化方法效果显著。实施例2纳米银铜合金(silver-copper)对超长片段PCR扩增的优化，针对超长片段PCR扩增的优化改进，扩增长度为15000bp的长片段，包括下列步骤1.纳米银铜合金(silver-copper)悬浮液的制备silver-copper购买于Sigma公司，配置浓度为(W/V)10mg/mL的纳米银铜合金悬浮液，先精确称取10mg已灭菌的纳米银铜合金置于已灭菌的1.5mL的小离心管中，用移液器缓慢加入灭菌水至体积为lmL，于40KHz进行超声波悬浮10min。2.PCR体系的配置，具体组成如下，<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>其中，模板为XDNA，购自三博远志生物工程公司，Taq酶购自三博远志生物工程公司。共配置PCR体系2管，且从2到3编号。3.PCR体系的优化从第2管到第3管分别依次加入纳米金属合金悬浮液OpL，3.0nL。最后用双蒸水补足总体积为25pL。4.PCR条件的设定与运行利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增条件为33个循环，93'C预热2min，93'C变性10s，54.8。C退火30s，72。C延伸20min，最后72*€延伸10min。5.对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。目的片段为15kb,从左至右1为分子量标记LambdaDNA/HindlII(MBI公司，由DNA片段由上至下为23，130bp、9，416bp、6，557bp、4，361bp、2，322bp、2，027bp、564bp以及125bp而构成)2为普通反应体系结果，3为普通反应体系加入silver-copper的结果。以上反应条件相同，可以看出2样本扩增条带出现较宽的非特异性扩增产物弥散等，3弥散明显减轻，扩增质量明显改观。实施例3silver-platinum对高GC含量PCR扩增的优化，针对高GC含量扩增的优化改进，扩增长度为2872bp的DNA分子，包括下列步骤1.纳米银铂合金(silver-platinum)悬浮液的制备同实施例1。2.PCR体系的配置，具体组成如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>引物2(2阔3.75nL模板1^iL其中，模板为XDNA，购自三博远志生物工程公司，T叫酶购自三博远志生物工程公司。共配置PCR体系3管，且从2到4编号。3.PCR体系的优化从第2管到第4管分别依次加入纳米银铂合金悬浮液，3.0pL，4.0nL。最后用双蒸水补足总体积为25^L。4.PCR条件的设定与运行利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增条件为33个循环，93'C预热2min，93。C变性10s,54.8。C退火30s，72'C延伸20min,最后72'C延伸10min。5.对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3。从左至右2为常规PCR体系扩增结果；3、4为加入本发明优化材料纳米银铂合金悬浮液对高GC含量的PCR体系扩增结果。1为分子量标记(从上至下为23,130bp、9,416bp、6,557bp、4,361bp、2，322bp、2,027bp、564bp以及125bp)。可以看出2样本扩增结果中有多条带出现非特异性扩增或者产物拖尾等，3、4样本条带清晰，得到明显优化。权利要求1.一种基于纳米金属合金的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，该方法包括以下步骤(1).纳米金属合金悬浮液的制备；(2).PCR体系的配置；(3).PCR体系的优化；(4).PCR条件的设定与运行；(5).PCR产物检测；其特征在于所述的PCR体系的优化是指在PCR体系中添加纳米金属合金悬浮液。2.根据权利要求1所述的基于纳米金属合金的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，其特征在于所述的纳米金属合金悬浮液的制备方法为(1).先精确称取已灭菌的纳米金属合金置于已灭菌的离心管中；(2).用移液器缓慢加入灭菌水；(3).于40KHz进行超声波悬浮后即制成纳米金属合金悬浮液。3.根据权利要求1或2所述的基于纳米金属合金的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，其特征在于所述的纳米金属合金悬浮液浓度为10mg/mL，其所在PCR体系中的添加量与PCR体系的体积百分比为0.0210°%。4.根据权利要求1或2所述的基于纳米金属合金的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，其特征在于所述的纳米金属合金为纳米银铂合金、纳米银铜合金。5.根据权利要求1所述的基于纳米金属合金的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，其特征在于所述的PCR扩增包括常规PCR扩增、高度复杂的基因组模板中选择性地扩增特异性的极低拷贝数DNA、扩增高GC含量PCR、长片段PCR和超长片断PCR扩增、多重PCR扩增、单分子PCR扩增、以及一次扩增之后的再扩增。全文摘要本发明涉及生物
技术领域：
的聚合酶链式反应(PCR)扩增的方法，是一种基于纳米金属合金的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法。该方法是在现有的PCR扩增方法基础上通过向体系中添加一定量的纳米金属合金悬浮液来实现的。此方法优化效果显著、制备简便、成本低廉，具有较广的应用范围，可以应用于各种PCR扩增、聚合酶延伸以及基于PCR方法基础的其他生化方法，尤其适用于一些较难扩增类型的PCR方法，诸如从高度复杂的基因组模板中选择性地扩增特异性的极低拷贝数DNA，扩增高GC含量的DNA、扩增单分子DNA，超长DNA片段扩增，多重PCR扩增，一次扩增不完美而再扩增等。文档编号C12P19/00GK101153308SQ200610016039公开日2008年4月2日申请日期2006年9月28日优先权日2006年9月28日发明者张治洲,曹小红,汪名春,群王,林贺申请人:天津科技大学