双互补位A-β结合多肽的制作方法

专利名称：双互补位A-β结合多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的P -淀粉样肽(以下为“A-e ”)结合多肽，所述多肽包含特定免疫球蛋白域。本发明还涉及编码所述多肽的核酸；制备所述多肽的方法；表达或能够表达所述多肽的宿主细胞；包含所述多肽的组合物；及所述多肽或所述组合物尤其用于预防性、治疗性及诊断性目的用途。
背景技术：
若干种退行性神经疾病由蛋白质的不当折叠或加工引起或由朊病毒引起，两者皆会导致侵入性神经沉积，称为淀粉样斑。最广为人知的退行性神经疾病为阿尔茨海默氏病(AD)。AD的发病率证明迫切且未满足的医学需求所有65至85岁的人中10%至40%会 出现AD。此外，此部分的人数持续指数增长。因此，从人道以及社会与经济角度出发，急需找到有效诊断及治疗此破坏性病症的方法。关于治疗，药物不仅需要减缓或停止疾病进展，而且亦需要使在AD初期(在诊断之前)已出现的脑损伤恢复。此时，早期诊断与疗法治疗皆无效。AD定义为与大脑中存在主要由淀粉样肽构成的细胞外淀粉样斑及主要由蛋白T构成的细胞内神经原纤维缠结(NFT)同时发生的痴呆。作为AD特征的淀粉样斑的主要组分为P -淀粉样肽(A-0 )，其为长39-43个氨基酸(aa)且高度倾向于采用P折叠结构、寡聚并形成蛋白聚集体的高度不溶性肽。A-3由A-P前体蛋白(APP)通过两个溶解蛋白事件产生。A-^分泌酶活性使APP在A-P的氨基酸Met-671与Asp-672 (使用APP的770aa同工型的编号)之间的N端(“ P位点”)裂解。P位点的裂解产生99aa的膜相关APP片段(C99)。C99的跨膜域中的第二位点(“ Y位点”)可接着由Y-分泌酶裂解，释放A-P。或者APP可在其A-P区中，主要在APP的a -分泌酶裂解位点裂解，产生83aa的C端APP片段(C 83)，其亦可进一步由Y -分泌酶裂解，产生小的可溶性分泌肽P3。此路径减少A-P的潜在积累。细胞内及细胞外A-P采用P折叠构象且形成称为ADDL(淀粉样蛋白衍生的可扩散配体)的中间物及原纤维，最后以淀粉样原纤维的形式沉淀，所述淀粉样原纤维组装成淀粉样斑。在这些过程中，推测疏水性较大的A-P (1-42)肽(参考下文)充当所述斑块不断生长所环绕的成核剂。APP的许多错义突变与早发型家族性AD的形式有关。所有这些突变均在APP的一个经典裂解位点处或附近。因此，瑞典双突变(Swedish double mutation) (K670N/M671L)紧邻￠-分泌酶裂解位点且提高￠-分泌酶活性的效率，从而产生更多的总A-P。在Y-分泌酶裂解位点附近的APP残基717处的三个突变中的任一者可使A-P的更促淀粉样的42aa形式(亦称为A-3 (1-42))相对于更常见40aa形式A-P (1-40)的比例增加。已描述APP的另外两个突变，其靠近但不邻接a位点。佛兰德斯(Flemish)家族突变(A692G，A-^残基21)和荷兰(Dutch)家族突变(E693Q，A-^残基22)各与家族性AD的不同形式有关。具体而言，佛兰德斯突变呈现为重复脑内出血的综合征或AD型痴呆。神经病理学发现包括皮质及海马区中的老年斑，及通常大脑微血管壁中的多个淀粉样沉积物。若干年前，已显示膜相关天冬氨酰基蛋白酶BACE(亦称为曼普辛(memapsin)或Asp2)呈现对￠-分泌酶所期望的性质。此酶以类似效率使APP在其P位点处及A-@区的Tyr-IO与Glu-Il之间裂解。已在AD的淀粉样斑中及经APP转染的HEK293人胚肾细胞的培养基中观察到在后者的位点处裂解的A-P折叠段。若干小组亦观察到数据库中存在另一天冬氨酰基蛋白酶BACE2(亦称为Aspl)，其为BACE(现亦称为BACE1)的相近同源物。BACE2使APP在其P位点处裂解，及更有效地在APP的A- P区中A- P的Phe_19及Phe_20后的位点处裂解。这些内部A-P位点相邻于残基21的佛兰德斯APP突变，且此突变显著增加由BACE2产生的P位点裂解产物的比例。增加(瑞典突变)或抑制(M671V) P -分泌酶活性的APP保守性P位点突变类似地影响BACEl及BACE2活性。类似于BACE1，BACE2在酸性pH值下最大限度地分解APP。APP基因或早老素Upresenilin I,PSl)基因(带有“ Y -分泌酶”活性)的突变引起早发型家族性AD。APP突变的实施例为分别位于P及Y分泌酶裂解位点附近的上述 “瑞典”及“伦敦(London)” (717)突变。这些突变增加A-P肽及尤其是A-P (1-42)的形成，由此增加淀粉样聚集体及斑块的形成。然而，最初的斑块被认为是发展AD的主要触发物，但当前研究却强调原纤维及ADDL作为主要毒性组分的作用。甚至可想象斑块为实际上使神经毒性肽无生物活性的机理。关于神经退化性疾病及A-P在其中的作用的其他信息可得自Wisniewski和 Konietzko (2008), Lancet Neurol 7 (9),805-811, Spires-Jones 等人(2009)，Neurobiology of Disease,213-220,以及 Lichlen 和 Mohajeri(2008), Journal ofNeurochem. 104. 859-874。当前大部分AD治疗旨在使用例如多奈哌齐(donepezil) (Aricept )、加兰他敏(galantamine) (Reminyl )及利伐斯的明(rivastigmine) (Exelon )的注册用于治疗轻度至中度AD的乙酰胆碱酯酶抑制剂使乙酰胆碱缺乏。在美国和加拿大，多奈哌齐亦获批准用于重度阿尔茨海默型痴呆(Dementia Alzheimer’stype, DAT)。乙酰胆碱缺乏反映基底前脑的胆碱能神经元退化且似乎与该疾病的神经精神病学表现非常有关。用乙酰胆碱酯酶抑制剂治疗具有一定有益作用(对认知及全面功能的临床测量具有稳定且显著但适中的功效)，但无法治愈或停止疾病进展，因为未治疗到神经退化的病因。美金刚(Memantine)(Axum'.K:、Namenda . libiXa-il'；Merz Pharmaceuticals)为一种NMDA受体拮抗剂，其在患中度至重度阿尔茨海默氏病的AD患者中在临床领域认知、日常生活活力及整体临床反应方面的结果均优于安慰剂。美金刚仍然仅为批准用于中度至重度阿尔茨海默氏病的对症治疗。其既不治愈亦不停止疾病进展。已显示美金刚与乙酰胆碱酯酶抑制剂的组合在中重度至重度DAT而非轻度至中度疾病阶段中具有优良功效。一些当前实验性治疗策略集中于A-P上，将其作为靶标。存在三个主要研究路线 a)开发称为P折叠裂解剂的小分子(常常为肽模拟物)，其经设计以干扰淀粉样肽聚集体的P折叠结构。已证明稳定“ P折叠裂解剂”在给予AD的转基因小鼠模型时能够穿透血脑屏障且减少斑块数目(Permanne等人(2002)，FASEB J. 16，860-862)。有待证明此方法是否会引起认知保护和/或恢复。b)开发抑制APP经溶解蛋白加工成淀粉样肽的小分子。0或Y分泌酶的抑制剂应有效地阻断A-P的形成且因此保护大脑免受淀粉样蛋白的神经毒性作用。未预期对已存在的脑A-P负荷(例如已积累多年的淀粉样斑)的作用。c)针对A-0的被动及主动疫苗接种。此研究路线以如下Schenk等人(1999),Nature 400，173-177的观察结果开始用A-P (1-42)对转基因AD小鼠进行疫苗接种可预防淀粉样斑形成。在第一实验中，青壮年小鼠出周龄)的每月疫苗接种基本上可预防大脑中斑块形成及伴随的发炎反应，亦即不存在淀粉样斑、星状细胞增生及小胶质细胞增生。在已形成淀粉样斑时的较晚年龄开始疫苗接种可部分地清除。随后，证明用A-P进行疫苗接种可改善行为及记忆缺失，如在水迷宫记忆测试中所测量。在用整个A-3进行疫苗接种具有副作用的情况下，已设计替代性较短肽且用于接种转基因小鼠。临床试验表明，用A-3进行主动免疫具有治疗活性，如通过引起斑块清除、减弱斑块相关病状、降低T含量及减缓患者认知下降所证明。然而，大量患者发展自体免疫脑膜脑炎，主要由自体反应性T淋 巴细胞对主动免疫作出反应而浸润至脑中所引起(Ferrer等人(2004),Brain Pathol. 14,11-20 ；Nicoll 等人(2003)，Nat. Med. 9，448-452 ；Masliah 等人(2005)，Neurology 64，1553-1562)。作为主动免疫方法的替代方法，可向患者给予针对A-P的抗体。所述被动免疫方法显示成功地降低转基因AD小鼠的脑A-0负荷(DeMattos等人(2001), Proc. Natl. Acad.Sci. USA 98,8850-8855)。潜在机制仍在推测中，因为认为抗体不太可能会穿过血脑屏障且靶向于脑中存在的斑块。因此，作者提出，抗体在自脑中滴定A-3的血浆中形成“A-3沉陷”。随后，使用凝胶溶素及神经节苷脂1，证明任何A-P结合配体均具有降低转基因AD小鼠中的淀粉样蛋白负荷而不穿过血脑屏障的潜力(Matsuoka等人(2003) J. Neuroscience23，29-33)。短期(24小时)被动免疫似乎可恢复转基因AD小鼠的认知缺乏，甚至不会影响总脑淀粉样蛋白负荷(Dodart等人(2002)Nature Neuroscience 5,452-457)。此结果表明，一些抗体首先祀向于A-0的较小但仍可溶的聚集体,且亦表明这些聚集体为A-0的最毒形式。因此，清除原纤维A-P可恢复记忆，至少在转基因APP小鼠中。同时人源化抗A-P单克隆抗体巴匹珠单抗(bapineuzumab)(称为“3D6”的抗A-^小鼠抗体的类似物)已进入临床试验。然而，自II期试验报导的第一数据显示混杂的结果仅在ApoE4非携带者中观察到对若干功效终点的统计显著作用。此外，巴匹珠单抗在ApoE4非携带者中耐受性良好且安全，而在ApoE4携带者中，相较于安慰剂组，在经巴匹珠单抗处理的患者中更常观察到严重不良事件。此外，已观察到血管性水肿事件。亦已公开了在转基因APP小鼠中临床前诱发大脑微出血。怀疑用于抗A-P被动免疫中的常规抗体(含有FC部分)为在人及动物模型中所观察到的血管性水肿或微出血的诱因，其与靶向于大脑血管A-P沉积物(大脑淀粉样血管病变)并通过ADCC和/或CDC导致微出血相关(ffilcock, DM, Colton, CA, CNS Neurol.Disord. Drug Targets(2009)第 8 卷(I) :50-64)。最后，认为如由Biacore所测量的此抗体约2. 5nM的结合亲和力过低而无法诱发有效“外周沉陷作用”。另一抗A-0抗体索拉珠单抗(solanezumab)(人源化抗体m266 LY-2062430)亦已进入临床测试。可达成的最大斑块负荷降低公布为约60%。另外，此抗体的特异性限于可溶性A-P，以使聚集体或斑块的结合不可预期。第三种抗A-P抗体普恩珠单抗(ponezumab) (PF4360365)仅结合于A-P (X-40)分子且不结合于A-P (X-42)分子，后者被认为是病原性(更大)的A-P类型。其亲和力甚至低于巴匹珠单抗的亲和力，且由于其能够结合于血管中的A-P斑块以及保留其Fe部分的ADCC/CDC活性，故仍无法消除大脑微出血的风险。总而言之，上文说明，即使通过(经典)抗体达成的A-P结合及清除似乎是开发供治疗例如AD的治疗剂的吸引人的作用模式，但尚未完全阐明的所述免疫球蛋白的其他特征及作用(例如其结合于A-P的某些形式的性质的药理学关系)亦使得比最初假设的情况更难以发现并开发安全且有效的治疗抗体。对A-P具有特异性的抗体片段(例如免疫球蛋白单一可变域抗体或VHH域(如 下文所定义))亦描述于本领域中WO 2004/44204 ;W0 2006/40153 ;W0 2007/35092 ；W02008/122441 ;及WO 2009/04494。由本发明者根据以上WO公开案所合成的VHH的结合特征并不令人满意，因此其并不允许进入临床开发。WO 09/149185公开所谓DVD构建体，及尤其具有A_ ^结合特异性的DVD构建体。在所述DVD构建体中组合两种不同抗A-P可变域后，维持亲本抗体的结合，但未观察到此组合使亲和力增加。此外，所公开的DVD构建体含有存在于“经典”抗体中的Fe部分，以致无法避免由例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fe效应子功能所引起的副作用(参考上文)。AD的明确诊断仍需要对脑进行死后病理学检查以证明存在淀粉样斑、神经原纤维缠结、突触丧失及神经元退化。此为与Alois Alzheimer (1906)所定义基本上相同的程序。1984年，美国国家神经病症、沟通障碍及中风研究所及阿尔茨海默氏病与相关病症协会(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke andthe Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association,NINCDS-ADRDA)建立关于AD诊断的正式标准(综述于Petrella等人(2003)，Radiology 226，315-336中)。符合所有以下标准的患者诊断为可能发生AD :由检查及测试(例如简易心智测试(Mini-MentalTest)、布雷氏痴呆量表(Blessed Dementia Scale)或类似测试)证明痴呆，记忆及至少一种其他认知功能受损，意识正常，在40岁与90岁之间发作，不存在引起痴呆的其他疾病征兆(排除标准)。无可鉴别病因的逐渐进行性认知障碍将诊断为可能发生AD，可能发生的AD进一步定义为轻度(早期)、中度(中期)或重度(晚期)痴呆。使用实验室分析客观地确定或排除痴呆的替代性病因。对脑脊髓液(CSF)中的A-P (1-42)及磷酸化T的ELISA检测结合对ApoE4(素因性遗传因子)的基因型分析似乎具有敏感性及特异性。然而，由于进行侵入性CSF穿刺，故所述方法并不广泛适用，从而阻碍此成为常规筛检。对神经丝蛋白(AD7C-NTP)的ELISA (由NymoX开发)证明在AD患者的尿中的含量高于非AD痴呆患者或健康对照者。然而，在早期AD病例中，平均含量显著较低，表明该测试对于测试AD的早期发作而言并不可靠。至今尚无生物化学方法适合于AD早期的可靠诊断，相反，所述方法仅有助于证实晚期病例的临床诊断。显然，需要更先进技术以在指示不可逆脑损伤的临床症状发作前进行早期诊断。
最后，不仅出于诊断性目的，而且在例如临床前研究及开发中，A- ^结合分子均适用作研究工具。广泛使用上文已提及的抗体，亦即抗体3D6及抗体m266。抗体3D6以相对低亲和力结合于A-P且因此可能不适于所有目的。抗体m266与A-P的N端截短形式(例如P3)交叉反应，此使得例如A-P (1-40)及A-P (1-42)的疾病相关的A-P类型与例如p3的其他分子无法区分。鉴于上文，本发明的一个目的在于提供可用于预防、治疗、减轻和/或诊断与A-3相关和/或由A-P介导的疾病、障碍或病症(例如AD)的药理学活性剂，以及包含所述活性剂的组合物，提供预防、治疗、减轻和/或诊断所述疾病、障碍或病症的方法，包括使用和/或给药所述药剂及组合物。所述药剂亦可用于研究一般AD领域及具体而言阐明AD疾病机制及潜在的治疗性和/或预防性机制。具体而言，本发明的一个目的在于提供所述药理学活性剂、组合物和/或方法，其与当前所用和/或本领域中已知的药剂、组合物和/或方法相比提供某些优点。这些优点包括改良治疗性质和/或药理学性质和/或其他有利性质(例如改良制备容易性和/或降 低物品成本)，尤其与以上部分中所述的针对A-P或其片段的常规抗体相比。其他优点将自以下进一步描述而变得清楚。更具体而言，本发明的一个目的在于提供新的A-P结合分子及具体而言结合于哺乳动物及尤其人A-P的多肽，其中所述分子或多肽适于以上诊断性、治疗性及研究目的。

发明内容
根据本发明的第一方面，提供包含特异性结合于A-P的第一抗原表位的第一免疫球蛋白单一可变域和特异性结合于A-P的第二抗原表位的第二免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中A-0的该第一抗原表位及该第二抗原表位不为相同抗原表位,亦即为不同的抗原表位，例如一方面为N端抗原表位(SEQ ID NO:3)且另一方面为中心抗原表位(SEQ IDNO:4)。优选地，该第一免疫球蛋白单一可变域和该第二免疫球蛋白单一可变域各基本上由四个框架区(分别为FRl至FR4)和三个互补决定区(分别为⑶Rl至⑶R3)组成，其中该第一免疫球蛋白单一可变域和该第二免疫球蛋白单一可变域由接头肽共价连接，其中该接头肽任选包含第三免疫球蛋白域(例如第三免疫球蛋白单一可变域)或由其组成。此外，该第一免疫球蛋白单一可变域和该第二免疫球蛋白单一可变域优选为抗体域，更优选为VHH域，且甚至更优选为人源化VHH域。本发明的该多肽中所包含的免疫球蛋白单一可变域通常将分别具有结构FR(I) 1-CDR(I) 1-FR(1)2-CDR(1)2-FR(1)3-CDR(1)3-FR(1)4 和 FR (2) I-CDR (2) 1_FR(2) 2_CDR(2) 2-FR(2)3-CDR(2)3-FR(2)4。优选地，CDR(I) 3 选自-SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列；及-分别与SEQID NO: 13或SEQ ID NO: 16的所述氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个且更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列；且CDR(2)3 选自-SEQ ID NO: 19的氨基酸序列；及
-与SEQID NO: 19的该氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个且更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列。或者，CDR(1)3选自-SEQ ID NO: 19的氨基酸序列；及-与SEQID NO: 19的该氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个且更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列；且CDR(2)3 选自-SEQ ID NO: 13 及 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列；及-分别与SEQID NO: 13或SEQ ID NO: 16的所述氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个且更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列。·本发明尤其适用的多肽将包括以下CDR序列(编号如以上段落中所指示)-CDR(I)I :SEQ ID NO: 11-CDR(I) 2 :SEQ ID NO: 12-CDR(1)3:SEQ ID NO: 13-CDR(2) I SEQ ID NO: 17-CDR⑵ 2:SEQ ID NO: 18-CDR⑵ 3:SEQ ID NO: 19或-CDR(I)I SEQ ID NO: 14-CDR(1)2:SEQ ID NO: 15-CDR(1)3:SEQ ID NO: 16-CDR(2) I SEQ ID NO: 17-CDR⑵ 2:SEQ ID NO: 18-CDR⑵ 3:SEQ ID NO: 19或-CDR(I)I SEQ ID NO: 17-CDR(1)2:SEQ ID NO: 18-CDR(1)3:SEQ ID NO: 19-CDR(2)1 :SEQ ID N0:11-CDR⑵ 2:SEQ ID NO: 12-CDR⑵ 3:SEQ ID NO: 13或-CDR(I)I :SEQ ID NO: 17-CDR(1)2:SEQ ID NO: 18-CDR(1)3:SEQ ID NO: 19-CDR(2) I SEQ ID NO: 14-CDR⑵ 2:SEQ ID NO: 15-CDR⑵ 3:SEQ ID N0:16。根据本发明的一个具体实施方案，本发明的多肽包含VHH域ABII035 (SEQ IDN0:44)作为第一免疫球蛋白单一可变域及VHH域ABII059(SEQ ID NO:45)作为第二免疫球蛋白单一可变域，或反之亦然。在一个尤其优选实施方案中，本发明的该多肽还包含半衰期延长部分，其优选共价连接于该多肽，例如白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白域)、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白片段和白蛋白结合肽。本发明的特别具体的实施方案为具有如以下中所示的氨基酸序列的多肽SEQ IDNO: 26 至 31 (Fe 融合多肽)；SEQ ID NO: 32 (HSA 融合多肽)SEQ ID NO: 34 至 39 及 145 至152 (白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域融合多肽)；&SEQ ID NO:40至43、142及143(聚乙二醇化多肽)。本发明的多肽优选以其一个免疫球蛋白单一可变域结合于由SEQ ID N0:3定义的A-^抗原表位(N端抗原表位)，且以另一免疫球蛋白单一可变域结合于由SEQ ID N0:4定义的A-P抗原表位(中心抗原表位)。甚至更优选地，本发明的所述多肽至少与人A-3肽(SEQ ID N0:1)的氨基酸1(天冬氨酸)、3(谷氨酸)、19(苯丙氨酸)、20(苯丙氨酸)和23(天冬氨酸)形成接触。如在TR-FRET结合测试(使用ABII002=SEQ ID N0:62及ABII050=SEQ ID NO: 100作为竞争者；参考实施例9. 3)中所测量的IC50值优选在10_9摩尔/升或小于1(T9摩尔/升的范围内，且更优选在5X 10_9摩尔/升至10_12摩尔/升的范围内。根据另一方面，本发明涉及包含免疫球蛋白单一可变域或由其组成的多肽，该免疫球蛋白单一可变域基本上由四个框架区(分别为FRl至FR4)和三个互补决定区(分别为⑶Rl至⑶R3)组成，其中所述⑶R序列定义如下-CDRl :SEQ ID NO: 11-CDR2 :SEQ ID N0:12-CDR3 :SEQ ID N0:13或-CDRl :SEQ ID NO: 14-CDR2 :SEQ ID N0:15-CDR3 :SEQ ID N0:16或-CDRl :SEQ ID NO: 17-CDR2 :SEQ ID N0:18-CDR3 :SEQ ID N0:19，及涉及包含具有选自SEQ ID NO:47至111的氨基酸序列的VHH域或由其组成的多肽。这些多肽为适用于构建本发明的第一方面的双互补位A-P结合多肽的构建模块或中间物。根据其他方面，本发明涉及核酸分子、表达载体、宿主细胞及用于制备本发明多肽的制备方法。可使用呈分离形式的编码本发明多肽的核酸分子来构建各别表达载体，接着可将表达载体转染至用于在生物药学上制备本发明多肽的宿主细胞中。该制备方法通常包括以下步骤在允许表达该多肽的条件下培养该宿主细胞，回收该多肽及根据本领域中已知的方法将其纯化。 本发明的多肽尤其适用于诊断、预防、治疗和/或减轻如下文详细阐述的疾病、病症及病状及尤其是治疗阿尔茨海默氏病(AD)的方法中。因此，根据此方面，本发明的多肽将以药物组合物形式使用，亦即用作治疗、减轻或预防优选人的疾病、障碍或病症的药剂，该疾病、障碍或病症选自神经变性疾病或病症、阿尔茨海默氏病、阿尔茨海默型痴呆、大脑淀粉样血管病变(CAA)、21_三体(唐氏综合征)、成人唐氏综合征、伴有荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血(HCHWA-D)、路易体痴呆(dementia with Lewy Bodies)、额颞叶退化、青光目艮、肌萎缩侧索硬化、偶发性包涵体肌炎(sporadic inclusion body myositis)及老年人焦虑症，或将用于诊断该疾病、障碍或病症。除上述外，本发明的多肽特别适用于治疗干性AMD (年龄相关黄斑变性)及青光目艮。“干”性AMD亦称为“中间地图状萎缩”，其是由感觉神经性视网膜下的视网膜色素上皮层萎缩引起，通过眼睛中心部分中的感光器(视杆及视锥)损失而引起视力损失。目前尚无医学或外科治疗可用于此病状。迄今为止可用的疗法(例如由美国国家眼科研究所(National Eye Institute)提出)包括使用含高剂量抗氧化剂、叶黄素及玉米黄素的维生素补充剂，其可减缓干性黄斑变性的进展。青光眼为眼内流体压力增加，从而引起视神经的不可逆损伤及视力损失的疾病。在实验性青光眼中A-P与细胞凋亡视网膜神经节细胞共定位且以剂量及时间依赖性方式诱发显著的视网膜神经节细胞凋亡。出于治疗性目的，本发明的多肽或包含所述多肽的药物组合物可通过例如非经肠(尤其静脉内或皮下)或玻璃体内(尤其对于治疗干性AMD或青光眼而言)注射来给药至有此需要的人。本发明的其他方面、实施方案及应用将自以下进一步描述及随附权利要求而变得清楚。出乎意料地，尽管已深入研究A-P结合单克隆抗体且尽管已可得到对A-P具有高亲和力的高度特异性抗体，但本发明者继续提供一组具有改良特征的A-P结合分子，其与例如抗体3D6及m266相比具有甚至更佳的IC50值(参考例如表XVI)，其人源化对应物目前测试用于人治疗性用途。另外，尽管可证明本领域中已知的抗A-P抗体实际上能够降低过度产生A-@的转基因小鼠的淀粉样斑负荷(已公布通过给予单克隆抗体m266或其人源化对应物所达成的最大斑块负荷降低为约60%)，但例如抗体m266缺乏淀粉样斑结合。因此，在抗A-P分子直接结合于淀粉样聚集体中存在的A-P产生额外益处的情形下，可预期该常规抗体的潜力较小。相比之下，本发明者能够产生结合于淀粉样斑且因此预期通过促进实体解离来减少或移除血管淀粉样蛋白而不增加风险或诱发微出血的A-P结合分子。因为血管淀粉样蛋白与AD的严重程度相关，所以本发明多肽的此优点可证明尤其适用于治疗晚期或重度AD，亦即可预期其尤其适用于治疗具有积累多年的高脑淀粉样斑负荷的患者。因此，总而言之，本发明的A-P结合多肽的较高亲和力及其独特的斑块结合能力提供与本领域中所述的常规抗A-P抗体相比出乎意料的优势。目前临床试验中的另一抗体普恩珠单抗对A-P(X-40)具有特异性且不结合于AD的主要病原性类型A-P (X-42)，因此预期A-P (X-40) :k~& (X-42)平衡向有毒的A-0类型(X-42)的方向移动。相比之下，本发明者继续提供通过结合于至少两个不同抗原表位而能够捕捉A-P (X-40)及A-P (X-42)以中和两个类型的毒效应的A-P结合分子。与一般常规抗体相比，本发明的多肽可更容易、更快且更廉价地制备，具有更高稳定性及低抗原性，且由于其尺寸及结构小而可适于比注射或输注方便的给药途径。更具体而言，与需要昂贵哺乳动物细胞培养设施的常规抗体制备相比，通过在适宜重组宿主有机体(例如大肠杆菌及酵母)中发酵来产生本发明的多肽更节省成本。此外,可达成的表达量高，且本发明多肽的产率在lg/1至10g/l的范围(大肠杆菌)及多达10g/l (酵母)及以上。本发明的多肽的可溶性更大，这意味着其可以比常规抗体高的浓度储存和/或给药。其在室温为稳定的，这意味着其可在不使用冷冻设备下进行制备、储存和/或运输，从而节省成本、时间且环保。本发明的多肽在极端PH值下亦呈现长时间稳定性，这意味着其将适于通过口服给药来递送。此外，本发明的多肽无需包含存在于“经典”抗体中的Fe部分，从而避免了由例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fe效应子功能所引起的副作
用。当用于抗A-P被动免疫时，怀疑常规抗体(具有Fe部分)为诱发在人及动物模型中所观察到的微出血的原因，其与靶向于大脑血管A-P沉积物(大脑淀粉样血管病变)并通过 ADCC 和 / 或 CDC 导致微出血相关(ffilcock, DM, Colton, CA, CNS Neurol. Disord. DrugTargets(2009)第 8 卷(I) :50-64)。因此，总而言之，本发明的多肽组合了常规抗体的有利特征(例如高特异性及高选择性)与如上文所概述的优点，且与常规A-P结合抗体相比，具有令人吃惊的改良的亲和力及特异性特性。与本领域中已知的结合A-P的VHH域(例如WO 2006/040153、W02007/35092及TO 2004/44204中所述的VHH)相比，本发明的多肽显示在结合于单体A-P以及结合于聚集A-P方面显著改良的结合特性(参考例如以下实施例3.2及6)。此外，与例如WO2008/122441 或 Habicht 等人(2007)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ； 104 (49) 19232-19237 中所述的仅结合于聚集淀粉样斑的VHH域相比，本发明的多肽结合于单体A- ^以及淀粉样斑。此外，本发明的A-P结合多肽的VHH域同等有效地结合于人及啮齿动物A-P，如例如实施例7及图2中所示。与单VHH域相比，本发明的双互补位多肽的结合甚至使对人以及啮齿动物A-P的亲和力增加至少103倍。因此，本发明的多肽为用于疾病相关A-P形式(例如A-P (1-40)及A-P (1-42))的理想的跨物种检测工具，从而允许临床前及科学研究使用动物模型，尤其是啮齿动物模型。其优于以显著较低亲和力结合于A-P且仅与啮齿动物A-P微弱交叉反应的抗体3D6。与同样良好地识别啮齿动物及人A-P，但与A-P的N端截短形式(例如P3)交叉反应，以致不适用于依靠对疾病相关A-P类型(例如A-P (1-40)及A-P (1-42))的特异性检测的某些测试或检测的m266抗体相比，亦存在优势。最后，当组合检测两个不同A-P抗原表位的两个VHH时，本发明的双互补位抗A-3 VHH构建体使亲和力增加1000倍以上，此与WO 09/149185中所公开的构建体形成鲜明对比。当然，与本领域中已知的其他A-P结合分子相比，本发明的多肽基于其亲和力(敏感性)、特异性(关于抗原表位以及类型)及其如上文所概述的其他特征亦适用于诊断性目的。


图I显示在APP转基因小鼠(n=3)中在腹膜内给药ABII320、ABII322、3D6-IgG和m266-IgG后血浆中的游离/未结合A-P (1-40)的减少，如注射后2小时所检测。图示第一柱(未填充框):载体(PBS);第二柱ABII320(132nmol/kg);第三柱ABII322 (132nmol/kg);第四柱IgG3D6 (132nmol/kg);第五柱IgG m266 (66. 6nmol/kg);计算每一结合位点(每一 IgG分子2个结合位点)的IgG浓度。图2显示双互补位抗A-PVHH构建体(包括VHH域ABII035和ABII059)与人及啮齿动物(小鼠)A-P的结合。发明详述 定义本发明的以上及其他方面及实施方案将自本文中的进一步描述而变得清楚a)除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人,“MolecularCloning:A Laboratory Manual，，(第 2 版)，第 1-3 卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989) ;Lewin, “Genes IV”，Oxford University Press,New York, (1990);及 Roitt等人，“ Immunology，，(第 2 版)，Gower Medical Publishing, London, New York (1989),以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。b)除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”及“免疫球蛋白序列”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链、以及其所有部分、域或片段(包括但不限于抗原结合域或片段，分别例如VHH域或VH/VL域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“(单一)可变域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，以及编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更限定的解释。c)如本文所用的术语(多肽或蛋白的)“域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分而保持其三级结构。一般而言，域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或域的功能。d)如本文所用的术语“免疫球蛋白域”是指抗体链(例如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个3折叠中任选由保守二硫键稳定的约7个反平行P折叠股的2层夹层(sandwich)组成。e)如本文所用的术语“免疫球蛋白可变域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区I”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”和“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白域；所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区I”或“⑶R1”、“互补决定区2”或“⑶R2”和“互补决定区3”或“⑶R3”的三个“互补决定区”或“CDR”中断。因此，免疫球蛋白可变域的一般结构或序列可如下表示为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变域正是因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。f)如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变域”是指能够在不与其他可变免疫球蛋白域配对的情况下特异性结合抗原的表位的免疫球蛋白可变域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变域的一个实例为“域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变域VH及VL(VH域和VL域)。免疫球蛋白单一可变域的另一实例为如下文定义的骆驼科的“VHH域”(或简称为 “丽”)。鉴于以上定义，常规4链抗体(例如本领域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或源自所述常规4链抗体的Fab片段、F(ab' ) 2片段、Fv片段(例如二硫键连接的Fv或scFv片段)、或双特异抗体(均为本领域中已知)的抗原结合域，通常不视为免疫球蛋白单一可变域，这是因为在该情况下，与抗原的各别表位发生结合通常并非通过一个(单一)免疫球蛋白域，而是通过共同结合各别抗原的表位的一对(缔合)免疫球蛋白域(例如轻链和重链可变域)，即通过免疫球蛋白域的VH-VL对。fl) “VHH域”，亦称为VHHs、VHH域、VHH抗体片段和VHH抗体，已最初描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-CastermanC， Atarhouch T， Muyldermans S， Robinson G， HamersC, Songa EB, Bendahman N， HamersR. : “Naturally occurring antibodies devoid of light chains，，；Nature 363，446-448 (1993))。已经选择术语“VHH域”以将这些可变域与存在于常规4链抗体中的重链可变域(其在本文中称为“VH域”或“VH域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变域(其在本文中称为“'域”或“VL域”)进行区分。VHH域特异性结合表位而没有无其他抗原结合域(此与常规4链抗体中的VH或VL域相反，在该情况下表位由VL域与VH域一起识别)。VHH域为由单一免疫球蛋白域形成的小型稳定且高效的抗原识别单元。在本发明的上下文中，术语VHH域、VHH、VhH域、VHH抗体片段、VHH抗体以及.“Nanobody ”及“Nanobody 域”(“Nanobody”为 Ablynx N. V.公司，Ghent,Belgium 的商标)可互换使用且表示免疫球蛋白单一可变域(具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构且无需第二免疫球蛋白可变域的存在即可特异性结合表位)，且其由例如WO2009/109635图I中定义的所谓“印记残基(hallmark residue) ”与VH域区分。如例如Riechmann 和 Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999)的图 2中所示，对于骆驼科的VHH域所应用的VHH域的氨基酸残基，根据Kabat等人给出的VH域的一般编号法来编号(“Sequence of proteins of immunological interest”,US PublicHealth Services, NIH Bethesda, MD,公开案第 91 号)。根据该编号法，-FRl包含在位置1-30处的氨基酸残基，-⑶Rl包含在位置31-35处的氨基酸残基，-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，-⑶R2包含在位置50-65处的氨基酸残基，-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，-⑶R3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且-FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。然而应注意，如本领域中对于Vh域及VHH域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。对Vh域的氨基酸残基进行编号的替代方法(该方法还可以以类似方式应用于VHH域)在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号。VHH域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本文所述的目的。VHH域及含有其的多肽的其他结构特征及功能性质可概括如下VHH域(其本性上设计成在不存在轻链可变域及与轻链可变域不存在相互作用的情况下在功能上结合于抗原)可充当相对较小的单功能性抗原结合结构单元、域或多肽。此将所述VHH域与常规4链抗体的VH及VL域区别开，所述VH及VL域自身一般不适合作 为单抗原结合蛋白或免疫球蛋白单一可变域用于实际应用，而需要以某一形式或另一形式组合来提供功能性抗原结合单元(例如在Fab片段等的常规抗体片段中；由VH域共价连接于VL域组成的scFv中)。由于具有这些独特性质，所以单独使用或作为较大多肽的一部分而使用的VHH域可提供许多明显优于使用常规VH和VL域、scFv或常规抗体片段(例如Fab或F(ab’) 2片段)的优点-仅需要单域以高亲和力及高选择性结合抗原，因此不需要存在两个各别域，亦不需要确保此两个域以正确的空间构象及构型存在(亦即通过使用特别设计的接头，如同scFV 一样)；-VHH域可由单一基因表达且不需要转译后折叠或修饰-VHH域可易于经工程改造为多价及多特异性形式(如本文进一步讨论)；-VHH域高度可溶且不倾向于聚集(如同Ward等人，Nature 341:544-546 (1989)所述的源自小鼠的抗原结合域一样)；-VHH域对热、pH值、蛋白酶及其他变性剂或条件高度稳定，因此可在不使用冷冻设备下进行制备、储存或运输，从而节省成本、时间且环保；-VHH域的制备容易且相对廉价，甚至在生产所需规模上也如此。举例而言，VHH域及含有其的多肽可使用微生物发酵(例如如下文进一步所述)来产生且不需要如同例如常规抗体片段一样，使用哺乳动物表达系统-与常规4链抗体及其抗原结合片段相比，VHH域相对较小(约15kDa，或为常规IgG的1/10)，因此-显示对组织的(较)高渗透率，且-可以以高于所述常规4链抗体及其抗原结合片段的剂量给药；-VHH域可显示所谓空腔结合性质(尤其是因为其与常规VH域相比，具有伸长的⑶R3环)，因此亦可接近常规4链抗体及其抗原结合片段不易接近的靶标及抗原表位。获得结合具体抗原或表位的VHH域的方法，先前已公开于例如W02006/040153及WO 2006/122786中。亦如其中所详述，源自骆驼科的VHH域可通过以人常规4链抗体VH域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而经“人源化”。人源化VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在甚至更具体的实施方案中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分，任选与JH序列(例如JH5)合并的人框架区序列。f2)域抗体，亦称为“Dab”、“域抗体”及“dAb”(术语“域抗体(DomainAntibodies) ”及“dAb”被GlaxoSmithKline公司集团用作商标)，已公开于例如以下文献中ffard,E. S.,等人“Binding activities of a repertoire of single immunoglobulinvariable domains secreted from Escherichia coli，，；Nature 341:544-546 (1989)；Holt, L. J.等人“Domain antibodies:proteins for therapy，，;TRENDS in Biotechnology21(11) :484-490(2003);及 WO 2003/002609。域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物的抗体(特别是人4链抗体)的VH或VL域。为了以单一抗原结合域的形式(即在不与VL域或VH域分别配对的情况下)结合表位，需要例如通过使用人单一 VH或VL域序列的文库对这些抗原结合性质进行具体选择。类似于VHH，域抗体的分子量为约13kDa至约16kDa，且若源自完全人序列，则不需要进行人源化以供例如人治疗使用。在VHH域的情况下，域抗体在原核表达系统中也很好地得以表达，从而显著降低总制造成本。可通过将一个或多个变化引入一个或多个⑶R的氨基酸序列中，使域抗体以及VHH域进行亲和力成熟，所述变化导致与各别亲本分子相比，所得免疫球蛋白单一可变域对其各别抗原的亲和力获得改良。本发明的亲和力成熟的免疫球蛋白单一可变域分子可通过本领域中已知的方法制备，例如以下文献所述Marks等人，1992, Biotechnology 10:779-783，或 Barbas 等人，1994，Proc. Nat. Acad. Sci，USA 91:3809-3813. ；Shier 等人，1995，Gene 169 :147-155 ；Yelton 等人，1995，Immunol. 155 :1994-2004 Jackson 等人，1995，J. Immunol. 154(7) :3310-9 ;&Hawkins 等人，1992，J. MoI. Biol. 226(3) :889-896 ；KSJohnson 及 RE Hawkins, “Affinity maturation of antibodies using phage display”，Oxford University Press 1996。f3)此外，本领域技术人员还将了解，有可能将一个或多个上述CDR “移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR移植的支架及技术在本领域中是已知的。g)可互换使用的术语“抗原表位”及“抗原决定簇”是指大分子(例如多肽)的一部分，其由抗原结合分子(例如常规抗体或本发明的多肽)识别，且更具体地由所述分子的抗原结合位点识别。表位定义免疫球蛋白的最小结合位点，因此表示免疫球蛋白的特异性的靶点。抗原-结合分子(例如常规抗体或本发明的多肽)识别抗原表位的部分称为互补位。h)如本文中所使用，术语“双互补位(biparatopic) ”(抗原)结合分子或“双互补位”多肽是指包含如本文所定义的第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中此两个可变域能够结合于一个抗原的两个不同抗原表位，所述抗原表位通常不会同时结合于一个单特异性免疫球蛋白(例如常规抗体)或一个免疫球蛋白单一可变域。本发明的双互补位多肽由具有不同抗原表位特异性的可变域构成，且不含有结合于同一抗原表位的互补可变域对。因此，其并不彼此竞争结合于A-3。
i)可“结合”或“特异性结合”某一表位、抗原或蛋白(或其至少一部分、片段或表位)、对其“具有亲和性”和/或“具有特异性”的多肽(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域、本发明的多肽，或一般的抗原结合分子或其片段)是指“对抗”或“针对”该表位、抗原或蛋白，或为关于该表位、抗原或蛋白的“结合”分子。k) 一般而言，术语“特异性”是指具体抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或本发明的多肽)可结合的不同类型抗原或表位的数目。可基于抗原结合蛋白的亲和性和/或亲抗原性(avidity)确定其特异性。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(Kd)所表示的亲和性，是表位与抗原-结合蛋白上抗原-结合位点之间结合强度的量度Kd值越小，表位与抗原-结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和性也可表示为亲和性常数(Ka)，其为1/Kd)。如本领域技术人员将了解(例如基于本文其他公开的内容)，取决于具体感兴趣的抗原，可以以以本身已知方式测定亲和性。亲抗原性为抗原结合分子(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或本发明的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲抗原性与以下两者有关与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和性，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。通常，抗原结合蛋白(例如本发明的多肽)将以如例如于实施例9. 7所述的KinExA分析中测量的10E-5至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、且优选10E-7至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、更优选10E-8至10E-14摩尔/升、且甚至更优选10E-11至10E-13的解离常数(Kd)，和/或以至少10E7ME-1、优选至少10E8ME-1、更优选至少10E9ME-1，例如至少10E11ME-1的缔合常数(Ka)结合。任何大于10E-4M的Kd值一般都视为指示非特异性结合。优选地，本发明的多肽将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于IOnM,例如小于500pM的Kd结合所需的抗原。抗原-结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以本身已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夹心式竞争性分析(sandwich competition assay))及本领域中本身已知的其不同变化形式。I)氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸码加以指示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指相比于第二序列，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。这些保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如根据WO 98/49185，其中保守氨基酸取代优选是以下群组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一群组内的另一氨基酸残基所取代(i)较小脂族非极性或弱极性残基Ala、Ser、Thr、Pro及Gly ； (ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺Asp、AsruGlu及Gln ； (iii)极性带正电残基His、Arg及Lys ； (iv)较大脂族非极性残基Met、Leu、Ile、Val及Cys ;及(V)芳族残基Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下
Ala 被 Gly 或 Ser 取代；Arg 被 Lys 取代；Asn 被 Gln 或 Hi s 取代； Asp 被 Glu 取代；
Cys 被 Ser 取代；Gln 被 Asn 取代；Glu 被 Asp 取代；Gly 被 Ala 或 Pro 取代；Hi s 被 Asn 或 Gln 取代；Ile 被 Leu 或 Val 取代；Leu 被 Ile 或 Val 取代；Lys 被 Arg、Gln 或 Glu 取代；
Met 被 Leu、Tyr 或 Ile 取代;Phe 被 Met、Leu 或 Tyr 取代；Ser 被 Thr 取代；Thr 被 Ser 取代；Trp 被 Tyr 取代；Tyr 被 Trp 或 Phe 取代；Val 被 Ile 或 Leu 取代。m)例如相比于其天然生物来源和/或获得该核酸或多肽分子的反应介质或培养基，在其已与至少一种在该来源或介质(培养基)中其通常与之相关的其他组分分离时，核酸或多肽分子视为“(呈)基本上分离(的形式)”(所述其他组分例如另一核酸、另一蛋白/多肽、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)。特别地，核酸或多肽分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上被分离”。经适合的技术(例如适合色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“呈基本上被分离的形式”的核酸或多肽分子优选基本上为均质的。n)例如两个免疫球蛋白单一可变域序列之间的“序列一致度”指示这两个序列之间相同氨基酸的百分比。其可如WO 08/020079第49及50页段落f)中所述加以计算或测定。“序列相似度”指示相同或表达保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。靶标特异性本发明的多肽对A-P具有特异性的原因在于其包含特异性结合于一个或多个A-^分子且更确切而言结合于A-P分子中的抗原表位的免疫球蛋白单一可变域。A-3例如在人体内可采用不同形式且以不同形式存在，例如单体形式、寡聚及多聚形式、可溶性及不溶性聚集形式、原纤维形式、初原纤维(proto-fibrillar)形式、存在于中枢神经系统、骨骼肌、血小板、血管系统、胰脏、肾、脾、心脏、肝、睾丸、主动脉、肺、肠道、皮肤、肾上腺、唾液及甲状腺中的淀粉样斑及沉积物形式(Roher等人，Alzheimer' s&Dementia 5(2009)第18-29页)。本发明的多肽结合于A-P可存在的任一形式且尤其结合于自生物学和/或治疗性角度来看最相关的形式，这也在本发明的范围内。本发明的多肽可结合于不同长度的A-P肽分子，例如由如SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列组成的A-P (1-42)、由如SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列的氨基酸I至40组成的A- 3 (1-40)、A- P (1~39)(氛基酸 I 至 39)、A- P (1-38)(氛基酸 I 至 38)、A- P (1-37)(氛基酸I至37)等。本发明的多肽的结合可在N端、C端或其间某处进行。而且，本发明在A-P的物种形式方面并无限制。因此，若欲用于治疗性目的，则本发明的多肽可优选结合于人A-P (SEQ ID NO: I)。然而，结合于例如其他温血动物或优选哺乳动物形式的A-P的多肽亦在本发明的范围内。结合于A-P的一个物种形式的本发明多肽可与来自一个或多个其他物种的A-P交叉反应。举例而言，结合于人A-P的本发明多肽可能显示或不显示与来自灵长类动物的一个或多个其他物种的A-P的交叉反应性，和/或与来自常用于动物疾病模型(例如小鼠(参考SEQ ID NO:2)、大鼠、兔、猪或狗)且尤其用于与A-P相关的疾病及病症的动物模型(例如本文所提及的物种及动物模型)中的动物的一个或多个物种的A-P的交叉反应性。自研究和/或药物开发角度来看，显示该交叉反应性的本发明多肽可具有优点，因为其允许本发明的多肽结合于在重要疾病模型(例如小鼠或大鼠)中进行测试的人A-3。而且，本发明不限于本发明多肽所针对的A-P的特异性抗原决定基、抗原表位、部分、域、亚单元或确证(适当时)。本发明多肽所针对的A-P的一些优选抗原表位为用于免疫疗法及尤其用于AD的被动免疫疗法的抗原表位。举例而言，如Weksler M. , Immunityand Ageing 1，2 (2004)及其中所提及的背景技术中所提及，已知A-P上存在三种主要抗原表位，亦即N端抗原表位(A-P的氨基酸1-16 :DAEFRHDSGYEVHHQK ;SEQ ID NO: 3)、中心 抗原表位(氨基酸16-28 KLVFFAEDVGSNK ；SEQ ID NO :4)及C端抗原表位(氨基酸28-42 KGAIIGLMVGGVVIA ；SEQ ID N0:5)。本发明的多肽可针对这些抗原表位中的任一者。包含至少两个免疫球蛋白单一可变域的本发明多肽尤其优选，其中一个免疫球蛋白单一可变域结合于N端抗原表位且第二个免疫球蛋白单一可变域结合于中心抗原表位。本发明的多肽在最广泛意义上，本发明提供用于预防、治疗、减轻和/或诊断A-P相关疾病、障碍或病症及尤其AD的新的药学活性剂。本发明的药剂属于一类新的A-P结合分子，亦即包含在不同抗原表位结合于抗原A-P的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域的双互补位多肽。更具体而言，本发明的所述多肽基本上由以下组成或包含以下(i)特异性结合于A-^的第一抗原表位的第一免疫球蛋白单一可变域和(ii)特异性结合于A-P的第二抗原表位的第二免疫球蛋白单一可变域，其中A-P的第一抗原表位与A-P的第二抗原表位为不相同的抗原表位。换言之，本发明的所述多肽包含针对A-P中存在的至少两个不同抗原表位的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域或基本上由其组成，其中所述免疫球蛋白单一可变域以使其能够同时结合A-P的方式彼此连接。在此意义上，本发明的多肽亦可视为“多价”免疫球蛋白构建体，且尤其视为“多价免疫球蛋白单一可变域构建体”，因为整个多肽包括至少两个A-P结合位点。本发明的多肽包括(至少)两个抗A-P免疫球蛋白单一可变域，其中(所述)两个免疫球蛋白单一可变域针对A-3分子中的不同抗原表位。因此，此两个免疫球蛋白单一可变域将具有不同抗原表位特异性且因此具有不同CDR序列。为此，本发明的多肽在本文中亦分别称为“双互补位多肽”或“双互补位域抗体构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由域抗体组成或基本上由其组成)，或“双互补位纳米抗体构建体”或“双互补位VHH域构建体”，或“双互补位VHH构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由纳米抗体或VHH域组成或基本上由其组成)，这是因为两个免疫球蛋白单一可变域将包括两个不同互补位。根据本发明的一个具体实施方案，在本发明的多肽包括两个以上抗A-P免疫球蛋白单一可变域，亦即三个、四个或甚至四个以上抗A-P免疫球蛋白单一可变域的情况下，至少两个抗A-P免疫球蛋白单一可变域针对A-P分子中的不同抗原表位，其中任何其他免疫球蛋白单一可变域可结合于此两个不同抗原表位的任一者和/或A-P分子中存在的另一抗原表位。根据本发明的另一个具体实施方案，除上述两个抗A-P免疫球蛋白单一可变域夕卜，本发明的多肽可包括任何其他额外部分，例如接头(如下文更详细描述)和/或额外蛋白质域，例如另一免疫球蛋白单一可变域(如下文更详细描述)，只要其与A-P的结合不会受该额外部分阻碍即可。本发明的多肽可另外含有例如糖基残基、经修饰的氨基酸侧链等的修饰。如前文所述，一个本发明多肽中的两个免疫球蛋白单一可变域将结合于A-@的不同抗原表位。此可通过以下方式中的一者达成两个免疫球蛋白单一可变域将结合同一个A-P分子中的两个抗原表位(分子内结合)；或者，其可结合位于两个不同A-P分子中的抗原表位，亦即一个免疫球蛋白单一可变域将结合于一个A-P分子上的一个抗原表位，而另一免疫球蛋白单一可变域将结合于另一 A-P分子上的另一抗原表位，由此交联两个 A-^分子(分子间结合)。根据一个优选实施方案，本发明的多肽将结合同一个A-P分子中的两个抗原表位，以便不发生交联，且本发明的多肽与A-P复合物将形成1:1的化学计量。因此，与(主要)分子间结合相比，(主要)分子内结合为优选，应了解，仍可存在少部分的分子间结合。可使用Biacore或尺寸排阻色谱检测(如Santora等人，Anal. Biochem. , 299:119-129所述)(参考下文实施例8. 2)区别分子内结合与分子间结合。然而，应注意，通过各别A-3分子的分子间结合起作用的多肽亦在本发明的范围内。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的多肽中所包含的第一和第二抗A- ^免疫球蛋白单一可变域各基本上由4个框架区(分别为FRl至FR4)及3个互补决定区(分别为⑶Rl至⑶R3)组成。在本发明的多肽内，该第一免疫球蛋白单一可变域和该第二免疫球蛋白单一可变域共价连接，任选通过如下文所述的接头肽共价连接，其中该接头在空间上允许至少两个免疫球蛋白单一可变域与各别A-P抗原表位最佳结合。本领域技术人员应清楚，对于人医药用途，本发明的多肽优选针对人A- ^，而对于兽医目的，本发明的多肽优选针对来自待治疗物种的A- 3。本领域技术人员亦应清楚，当用作人治疗剂时，本发明的多肽中所包含的免疫球蛋白单一可变域优选为人源化免疫球蛋白单一可变域。根据本发明，两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可彼此独立地为域抗体，亦即如上文所述的VL或VH抗体域，和/或如上文所述的VHH域，和/或任何其他类别的免疫球蛋白单一可变域，其限制条件为这些免疫球蛋白单一可变域与抗原(亦即A-P)的结合并非通过形成共同结合于同一抗原表位的互补可变域对(如在例如常规抗体的VL-VH域对的情况下)，而是通过独立地结合于不同抗原表位(亦即作为如上义所定义的“双互补位”抗原结合分子)。根据本发明的一个优选实施方案，第一和第二免疫球蛋白单一可变域基本上由如上文所述的域抗体序列或VHH域序列组成。根据一个尤其优选实施方案，第一和第二免疫球蛋白单一可变域基本上由VHH域序列组成。因此，在本文中及尤其在实验部分中，将参考包含结合于A- ^的两个不同抗原表位的两个(任选人源化)抗A- P VHH域序列(VHH)的双互补位多肽(亦即双互补位VHH域构建体)，更详细地描述本发明。然而，本领域技术人员应清楚，本文中的教导可类似地应用于包括其他抗A-P免疫球蛋白单一可变域(例如域抗体)的多肽。本发明的多肽不仅具有常规抗体的有利特征，例如低毒性及高选择性，而且其亦呈现其他性质。其可溶性更大，这意味着其可以以比常规抗体高的浓度储存和/或给药。其在室温为稳定的，这意味着其可在不使用冷冻 设备下进行制备、储存和/或运输，从而节省成本、时间且环保。本发明的多肽在极端PH值下亦呈现长时间稳定性，这意味着其将适于通过口服给药来递送。此外，本发明的多肽无需包含存在于“经典”抗体中的Fe部分，以便避免由例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fe效应子功能所引起的副作用。当用于抗A-P被动免疫时，怀疑常规抗体(其具有Fe部分)为诱发在人及动物模型中所观察到的微出血的原因，其与靶向于大脑血管A-P沉积物(大脑淀粉样血管病变)并通过 ADCC 和 / 或 CDC 导致微出血相关(Wilcock, DM, Colton, CA, CNS Neurol. Disord. DrugTargets (2009)，第 8 卷(I) : 50-64)。根据本发明的另一个实施方案，本发明的多肽中存在的至少两个免疫球蛋白单一可变域可直接(亦即不使用接头)或通过接头彼此连接。该接头优选为接头肽，且根据本发明将经选择以允许至少两个不同免疫球蛋白单一可变域各结合于A-P (同一个a-@分子中或两个不同分子中)的至少两个不同抗原表位。适合的接头将尤其取决于抗原表位之间的距离，且具体而言取决于免疫球蛋白单一可变域所结合的A-P上的抗原表位之间的距离，且基于本文的公开内容，任选在进行一定有限程度的常规实验后，应为本领域技术人员所清楚。而且，当结合于A-P的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域为域抗体或VHH域时，其亦可通过第三域抗体或VHH域彼此连接(其中该两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可直接或通过适合的接头连接于该第三域抗体或VHH域)。此类第三域抗体或VHH域可例如为使半衰期延长的域抗体或VHH域，如本文进一步所述。举例而言，后者的域抗体或VHH域可为能够结合于(人)血清蛋白(例如(人)血清白蛋白或(人)转铁蛋白)的域抗体或VHH域,如本文进一步所述。或者，结合于A-P的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可串联连接(直接或通过适合的接头)，且第三(单)域抗体或VHH域(其可使半衰期延长，如上文所述)可直接或通过接头连接于此两个或两个以上上述免疫球蛋白序列。适合的接头在本文中结合本发明的具体多肽描述且可例如(但不限于)包含氨基酸序列，该氨基酸序列的长度优选为9个或9个以上氨基酸，更优选为至少17个氨基酸，例如约20至40个氨基酸。然而，上限并不重要，而是为方便例如所述多肽的生物医药生产起见进行选择。接头序列可为天然存在的序列或非天然存在的序列。若用于治疗性目的，则接头优选在给药本发明的抗A-P多肽的受试者体内无免疫原性。一组适用的接头序列为源自如WO 96/34103和WO 94/04678中所述的重链抗体的铰链区的接头。其他实施例为聚丙氨酸接头序列，例如Ala-Ala-Ala。
接头序列的其他优选实施例为具有不同长度的Gly/Ser接头,例如&17!￡86；1^)2接头，包括(gly4ser)3> (gly4ser)4> (gly4ser) > (gly3ser)、gly3 及(gly3Ser2) 3。若本发明的多肽通过连接聚合物(例如聚乙二醇(PEG)部分)来修饰，则接头序列优选包括例如半胱氨酸或赖氨酸的氨基酸残基，以允许连接区中的该修饰(例如聚乙二醇化)。所述接头的优选实施例为GGGGCGGGS ( “GS9，C5”，SEQ ID NO 6)GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS( “GS25, C5, SEQ ID NO 7)GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG (" GS27，C14"，SEQ ID NO :8)，GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(" GS35，C15"，SEQ ID N0:9)，和GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS( “GS35, C5”，SEQ ID NO :10)。包括所述接头的本发明的聚乙二醇化多肽的一些非限制性实施例如SEQ ID NO40至43、142及143所示。此外，接头亦可为聚(乙二醇)部分，如例如WO 04/081026中所示。在另一个实施方案中，本发明多肽的至少两个免疫球蛋白单一可变域通过另一部分(任选通过一或两个接头)彼此连接，该另一部分例如另一多肽，在一优选但非限制性实施方案中，其可为如上文已描述的另一免疫球蛋白单一可变域。该部分可基本上无活性或可具有例如改良多肽的所需性质的生物作用或可赋予多肽一种或多种其他所需性质。举例而言(但不限于)，该部分可改良蛋白质或多肽的半衰期，和/或可降低其免疫原性或改良任何其他所需性质。所述构建体的一些非限制性实施例为SEQ ID NO:34至39的构建体。根据一个优选实施方案，本发明的多肽包含结合于如SEQ ID N0:3所定义的抗原表位的第一免疫球蛋白单一可变域，及结合于如SEQ ID N0:4所定义的抗原表位的第二免疫球蛋白单一可变域，或结合于如SEQ ID N0:4所定义的抗原表位的第一免疫球蛋白单一可变域，及结合于如SEQ ID NO:3所定义的抗原表位的第二免疫球蛋白单一可变域。甚至更优选地，如实施例8. 2及8. 3中所述，使免疫球蛋白单一可变域与A-P分子接触，亦即本发明的多肽至少与人或小鼠A-P肽的氨基酸1、3、13、20及23形成接触。优选地，如实施例9. 7中所述的KinExA检测中所测量，本发明多肽的解离常数(KD)值在10_6摩尔/升或小于10_6摩尔/升、更优选10_9摩尔/升或小于10_9摩尔/升的范围内，且甚至更优选在10_n至10_13摩尔/升的范围内，或如实施例9. 3中所述的TR-FRET结合测试中所测量，IC50值为10_9摩尔/升或10_9摩尔/升以下，且优选在5X KTki摩尔/升至10_12摩尔/升的范围内。根据本发明的一个甚至更优选实施方案，本发明多肽中的CDR序列如下文所定义且亦使得本发明的多肽以如以上段落中所述的解离常数(Kd)结合于A-P或具有如上文所述的IC50值。根据本发明的一个具体实施方案，本发明的多肽包含具有以下结构的两个A-3结合免疫球蛋白单一可变域(SEQ ID NO在下表I中给出)免疫球蛋白单一可变域I :FR(I) l-CDR(l) I-FR(I) 2_CDR(1) 2_FR(1) 3_CDR(1) 3_FR(1) 4，免疫球蛋白单一可变域2
FR (2) I-CDR (2) I-FR (2) 2-CDR (2) 2-FR (2) 3-CDR (2) 3-FR (2) 4，其中CDR(1)3 选自-SEQ ID NO: 13 及 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列；及-分别与SEQID NO: 13或SEQ ID NO: 16的所述氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个且更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列且CDR(2)3 选自；-SEQ ID NO: 19的氨基酸序列；及
-与SEQID NO: 19的该氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个且更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列；且其中其他CDR序列及框架区序列不受特别限制，但将由本领域技术人员根据具体需要来选择，例如在多肽欲用于人用途的情况下使用人源化框架区以降低本发明多肽的免疫原性。免疫球蛋白单一可变域I及2的顺序不受特别限制，因此在本发明的多肽中，免疫球蛋白单一可变域I可位于N端且免疫球蛋白单一可变域2可位于C端，或反之亦然。优选地，CDR(1)3 选自 SEQ ID NO: 13 及 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列，且 CDR (2) 3为SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。甚至更优选地，本发明的多肽包含具有以下结构的两个A-P结合免疫球蛋白单一可变域(SEQ ID NO在下表I中给出): 免疫球蛋白单一可变域I :FR(I) l-CDR(l) I-FR(I) 2_CDR(1) 2_FR(1) 3_CDR(1) 3_FR(1) 4，免疫球蛋白单一可变域2 FR (2) I-CDR (2) I-FR (2) 2-CDR (2) 2-FR (2) 3-CDR (2) 3-FR (2) 4，其中CDR(I) I为SEQ ID NO: 11的氨基酸序列(其与SEQ ID NO: 14的氨基酸序列相同)；CDR(1)2 选自 SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 15 的氨基酸序列；CDR(1)3 选自 SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列；CDR(2) I 为 SEQ ID NO: 17 的氨基酸序列；CDR⑵2为SEQ ID NO: 18的氨基酸序列；且CDR⑵3为SEQ ID NO: 19的氨基酸序列；且其中框架区序列不受特别限制，但将由本领域技术人员根据具体需要来选择，例如在多肽欲用于人用途的情况下使用人源化框架区以降低本发明多肽的免疫原性。在如上文所述的本发明多肽中，多肽中如上文所述的免疫球蛋白单一可变域I及2的具体顺序并不重要，因此上述免疫球蛋白单一可变域I可位于多肽的N端，随后为上述免疫球蛋白单一可变域2 ;或者，上述免疫球蛋白单一可变域2可位于多肽的N端，随后为上述免疫球蛋白单一可变域I。在两种情况下，其他序列及部分可存在于本发明的多肽中，例如存在于N端、C端或位于两个免疫球蛋白单一可变域之间，如本文更详细陈述。存在于本发明的多肽中且上文所概述的以上CDR序列及6CDR序列组分别概括于
下表I及II中表I及表II :包含两个不同A-P结合免疫球蛋白单一可变域的本发明多肽中的
优选⑶R组合表I:CDR 序列
权利要求
1.一种多肽，其包含特异性结合于A-P的第一抗原表位的第一免疫球蛋白单一可变域和特异性结合于A-P的第二抗原表位的第二免疫球蛋白单一可变域，其中所述A-e的第一抗原表位和第二抗原表位为不同的抗原表位。
2.权利要求I的多肽，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域各自基本上由四个框架区(分别为FRl至FR4)和三个互补决定区(分别为⑶Rl至CDR3)组成，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域由接头肽共价连接，其中所述接头肽任选包含第三免疫球蛋白域或由其组成。
3.权利要求I或2的多肽，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域为抗体域，优选为VHH域，更优选为人源化VHH域。
4.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述A-P的第一抗原表位为SEQID N0:3定义的抗原表位且所述A-P的第二抗原表位为SEQ ID N0:4定义的抗原表位，或其中所述A-^的第一抗原表位为SEQ ID NO: 4定义的抗原表位且所述A-P的第二抗原表位为SEQID NO:3定义的抗原表位。
5.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽至少与人类A-P肽(SEQID NO: I)的氨基酸I (天冬氨酸)、3 (谷氨酸)、19 (苯丙氨酸)、20 (苯丙氨酸)和23 (天冬氨酸)形成接触。
6.前述权利要求中任一项的多肽，其中在TR-FRET结合测试(使用ABII002=SEQIDNO:62和ABII050=SEQ ID NO: 100作为竞争者)中所测量，IC50值在I(T9摩尔/升或小于1(T9摩尔/升范围内，优选在5X10_1CI摩尔/升至10_12摩尔/升的范围内。
7.权利要求2至6中任一项的多肽，其中所述多肽包含两个A-P结合免疫球蛋白单一可变域，所述免疫球蛋白单一可变域分别具有结构FR (I) I-CDR (I) I-FR (I) 2-CDR (I) 2-FR(1)3-CDR(1)3-FR(1)4 和 FR(2) I-CDR(2) 1_FR(2) 2_CDR(2) 2-FR (2) 3_CDR(2) 3_FR(2) 4，且其中 CDR(1)3 选自 -SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 16的氨基酸序列；及 -分别与SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 16的所述氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个、更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列 '及 CDR(2)3 选自 -SEQ ID NO: 19的氨基酸序列；及 -与SEQ ID NO: 19的所述氨基酸序列相比有至多三个，优选至多两个、更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列 或其中 CDR(1)3 选自 -SEQ ID NO: 19的氨基酸序列；及 -与SEQ ID NO: 19的所述氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个、更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列；及 CDR⑵3选自 -SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 16的氨基酸序列；及 -分别与SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 16的所述氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个、更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列。
8.权利要求2至7中任一项的多肽，其中所述第一免疫球蛋白可变域的CDR序列(CDR(I)序列)和所述第二免疫球蛋白可变域的CDR序列(CDR(2)序列)定义如下-CDR(I)I SEQ ID NO: 11-CDR(I) 2 SEQ ID NO:12-CDR(I) 3 SEQ ID NO:13-CDR(2)I SEQ ID NO:17-CDR(2) 2 SEQ ID NO:18-CDR(2) 3 SEQ ID NO:19或-CDR(I)I SEQ ID NO: 14-CDR(I) 2 SEQ ID NO:15-CDR(I) 3 SEQ ID NO:16-CDR(2)I SEQ ID NO:17-CDR(2) 2 SEQ ID NO:18-CDR(2) 3 SEQ ID NO:19或-CDR(I)I SEQ ID NO: 17-CDR(I) 2 SEQ ID NO:18-CDR(I)3 SEQ ID NO:19-CDR(2)I SEQ ID NO:11-CDR(2)2 SEQ ID NO:12-CDR(2) 3 SEQ ID NO:13或 -CDR(I)I SEQ ID NO: 17-CDR(I)2 SEQ ID NO:18-CDR(I)3 SEQ ID NO:19-CDR(2)I SEQ ID NO:14-CDR(2)2 SEQ ID NO:15-CDR(2)3 SEQ ID NO:16。
9.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包含第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII035 (SEQ IDNO: 44)，所述第二免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII059 (SEQ ID NO: 45)，或其中所述第一免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII059(SEQ ID NO:45)，所述第二免疫球蛋白单一可变域为 VHH 域 ABII035 (SEQ ID NO: 44)。
10.权利要求1-9中任一项的多肽，其中所述多肽还包含半衰期延长部分。
11.权利要求10的多肽，其中所述半衰期延长部分共价连接于所述多肽且选自例如抗白蛋白免疫球蛋白域的白蛋白结合部分、例如抗转铁蛋白免疫球蛋白域的转铁蛋白结合部分、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白片段和白蛋白结合肽。
12.权利要求10至11中任一项的多肽，其中所述多肽选自具有SEQID NO:26至32、.34 至 43、142、143 及 145 至 152 的多肽。
13.一种多肽，其包含免疫球蛋白单一可变域或由其组成，所述免疫球蛋白单一可变域基本上由四个框架区(分别为FRl至FR4)和三个互补决定区(分别为⑶Rl至⑶R3)组成，其中所述CDR序列定义如下-CDRl SEQ ID NO:11-CDR2 SEQ ID NO:12-CDR3 SEQ ID NO:13pf -CDRl SEQ ID NO:14-CDR2 SEQ ID NO:15-CDR3 SEQ ID NO:16或-CDRl SEQ ID NO:17-CDR2 SEQ ID NO:18-CDR3 SEQ ID NO:19。
14.一种多肽，其包含具有选自SEQ ID NO:47至111的氨基酸序列的VHH域或由其组成。
15.权利要求13或14的多肽，其用于构建权利要求I至12中任一项的双互补位A-3结合多肽。
16.一种核酸分子，其优选呈分离形式，包含编码权利要求I至15中任一项的多肽的区域。
17.—种表达载体,其包含权利要求16的核酸分子。
18.—种宿主细胞，其带有权利要求17的表达载体，其中所述宿主细胞能够表达权利要求I至15中任一项的多肽，且其中该宿主细胞为原核或真核细胞。
19.药物组合物，其包含(i)一种或多种权利要求I至15中任一项的多肽作为活性成分；和(ii)药学上可接受的载体；和任选地(iii)稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂。
20.一种制备权利要求I至15中任一项的多肽的方法，其包括以下步骤 -在允许权利要求I至15中任一项的多肽表达的条件下培养权利要求18的宿主细胞； -回收该多肽；和 -纯化该多肽。
21.权利要求1-15中任一项的多肽或权利要求19的药物组合物，其用作用于治疗、预防或减轻人的疾病、障碍或病症的药物。
22.权利要求1-15中任一项的多肽或权利要求19的药物组合物，其用作用于治疗、预防或减轻人的疾病、障碍或病症的药物，其中所述疾病、障碍或病症选自神经变性疾病或病症、阿尔茨海默氏病、阿尔茨海默型痴呆、干性AMD、青光眼、大脑淀粉样血管病变、21-三体(唐氏综合征)、成人唐氏综合征、荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血(HCHWA-D)、路易体痴呆，额颞叶退化、青光眼、肌萎缩侧索硬化、偶发性包涵体肌炎及老年人焦虑症。
23.权利要求1-15中任一项的多肽或权利要求19的药物组合物，其经制备用于通过静脉内或皮下注射来给药至有此需要的人。
24.一种预防和/或治疗与A-P沉积相关的疾病或病症的方法，其中所述方法包括向有此需要的受试者给药药学活性量的至少一种权利要求1-15中任一项的多肽或权利要求19的药物组合物。
25.权利要求1-15中任一项的多肽或权利要求19的药物组合物，其经制备用于与选自以下的治疗剂组合给药ELND-005、Caprospinol、NRM-8499、PBT-2、Posiphen、EHT-0202、CTS-21166、司马西特、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、贝加司他、E-2012、CHF-5074、Dimebolin 和 PF-4494700。
26.一种治疗剂，其选自ELND-005、Caprospinol、NRM-8499、PBT-2、Posiphen、EHT-0202、CTS-21166、司马西特、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、贝加司他、E-2012、CHF-5074、Dimebolin 和PF-4494700，其经制备用于与权利要求I至15中任一项的多肽或权利要求19的药物组合物组合给药至有此需要的患者。
27.药物组合物，其包含(i)一种或多种权利要求I至15中任一项的多肽；和(ii)一种或多种其他治疗剂，所述其他治疗剂优选选自ELND-005、Caprospinol, NRM-8499、PBT-2、Posiphen、EHT-0202, CTS-21166、司马西特、BMS-708163, BMS-299897, BMS-433796,ELND-006、ELN-475516、ELN-318463, ELN-475513、贝加司他、E-2012, CHF-5074, Dimebolin和PF-4494700 ;和(iii)药学上可接受的载体；以及任选地(iv)稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂。
28.权利要求1-15中任一项的多肽，其用于降低体液中的A-P含量，优选用于降低血液中的可溶性A-P含量。
29.一种多肽，其包含第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域，其中所述第一免疫球蛋白可变域的CDR序列(CDR(I)序列)和第二免疫球蛋白可变域的CDR序列(CDR (2)序列)定义如下-CDR(I)I SEQ ID NO: 11-CDR(I)2 SEQ ID NO:12-CDR(I)3 SEQ ID NO:13-CDR(2)I SEQ ID NO:17-CDR(2)2 SEQ ID NO:18-CDR(2)3 SEQ ID NO:19或 -CDR(I)I SEQ ID NO: 14-CDR(I)2 SEQ ID NO:15-CDR(I)3 SEQ ID NO:16-CDR(2)I SEQ ID NO:17-CDR(2)2 SEQ ID NO:18-CDR(2)3 SEQ ID NO:19pf -CDR(I)I SEQ ID NO: 17-CDR(I)2 SEQ ID NO:18-CDR(I)3 SEQ ID NO:19-CDR(2)I SEQ ID NO:11-CDR(2)2 SEQ ID NO:12-CDR(2)3 SEQ ID NO:13pf -CDR(I)I SEQ ID NO: 17-CDR(I)2 SEQ ID NO:18-CDR(I)3 SEQ ID NO:19-CDR(2)I SEQ ID NO:14-CDR(2)2 SEQ ID NO:15-CDR(2)3 SEQ ID NO:16。
30.一种多肽，其包含第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII035 (SEQ ID NO: 44)，所述第二免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII059 (SEQ IDNO: 45)，或其中所述第一免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII059(SEQ ID NO: 45)，所述第二免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII035 (SEQ IDNO:44)。
31.权利要求29或30的多肽，其中所述多肽还包含半衰期延长部分，所述半衰期延长部分优选选自例如抗白蛋白免疫球蛋白域的白蛋白结合部分、例如抗转铁蛋白免疫球蛋白域的转铁蛋白结合部分、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白片段和白蛋白结合肽。
32.一种多肽，其选自具有SEQ ID NO: 26至32、34至43、142、143及145至152中任一项的多肽。
全文摘要
本发明涉及双互补位A-β结合多肽，更具体地涉及包含至少两个结合于A-β的不同抗原表位的免疫球蛋白单一可变域的双互补位A-β结合多肽。本发明还涉及所述多肽的具体序列、其制备方法及其使用方法，包括治疗例如阿尔茨海默氏病的疾病的方法。
文档编号C07K16/46GK102781962SQ201180012034
公开日2012年11月14日 申请日期2011年3月2日 优先权日2010年3月3日
发明者C.多纳-西奥塞克, G.贝斯特, J.E.帕克, J.沃卡曼, K.齐默曼, L.库斯茂尔, M.伦特, P.莫其尔斯, S.霍伊尔, T.赖雷曼斯 申请人:贝林格尔.英格海姆国际有限公司