专利名称：人源化抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于骆驼科(Camelidae)物种常规抗体库的新的人源化抗体。
背景技术：
单克隆抗体已被广泛地用作研究工具，并且越来越多地被用作治疗或诊断试剂。目前有超过20种不同的单克隆抗体已经获得监管部门的批准以用于治疗多种不同的疾病，其中包括癌症、炎症、自身免疫病、感染性疾病、哮喘、心血管疾病和移植排斥，而且在开发过程中的单克隆抗体药物的数量也在逐年增加。啮齿类动物(特别是鼠)单克隆抗体由于其非人源性的相关问题(特别是其在人类宿主中的免疫原性)因而在人类治疗中的实用性具有局限。为了尽可能地降低人类对治疗性抗体药物的免疫应答，单克隆抗体技术已经从完全小鼠抗体发展到嵌合抗体(小鼠的可变结构域被嫁接到人IgG的骨架上)、人源化抗体(小鼠的CDR被嫁接到人IgG的骨架上)、“完全人”抗体(来源于合成文库和非免疫文库或来源于经免疫的表达部分人IgG库的转基因小鼠)。许多可以生产针对治疗性目的之靶标抗原的完全人或“人源化”单克隆抗体的技术平台已被开发。这些平台中的每一个都有其独特的特点和潜在的缺陷。小鼠单克隆抗体的人源化最初通过将小鼠的可变结构域与人的恒定结构域结合而实现，产生具有约70%人源成份的所谓“嵌合抗体”。随后，更进一步的人源化通过将小鼠单克隆抗体的互补决定区(complementarity-determining region, Q)R)嫁接到人抗体可变抗体结构域的框架区上实现。此外，发现存在于这些框架区中的一些氨基酸残基与⑶R或抗原相互作用，而后使人源化抗体中的这些氨基酸回复突变以提高结合。(AlmagiX)等Frontiers in Bioscience, 13 :1619-1633 (2008))。使用这种方法改造的单克隆抗体在人源化后与人类的VH和VL结构域序列有较高程度的一级序列同源性，但缺点是其可能以不具备人样结构的高变环(hypervariable loop)来结束,这是因为并非所有小鼠编码的⑶R都使用标准的折叠和标准折叠的组合，而在人抗体中则没有这种情况发生(Almagro等，Mol. Immunol. 34 :1199-1214 (1997) ；Almagro 等，Immunogen. 47 :355-63 (1998))。更糟糕的是人源化此类抗体通常需要进行大量的突变(其过程复杂且费时)，由于人源化需要进行大量的改变并且鼠源库中主要使用V K结构域(而所有人抗体中约一半具有V λ结构域)，抗体还有丧失亲和力和效力的风险。替代性的人源化方法包括表面重塑(resurfacing)或镶饰(veneering)，其中只替换暴露于溶剂的与人不同的框架残基，而保留埋藏的或部分埋藏的残基和参与结构域间接触的残基(Padlan E. (1991)Mol Immunol.)。更加严格的方法是SDR移植，其中将CDR移植到人FR上，但除此之外，将CDR中的残基突变成人的对应残基，同时仅保留与抗原接触的特异性决定残基(Specificity Determining Residue(SDR))(Kashmiri S. V. S.等(2005) Methods)。 作为对人源化小鼠单克隆抗体潜在的改进，“完全人”单克隆抗体可以通过两种非常不同的方法生产。第一种方法是从完全合成的人类组合抗体文库(例如HiiCAL 、MorphoSys)中筛选或者从非免疫抗体文库(Vaughan T. J.等(1996)Nat Biotechnol.,Cambridge Antibody Technology ；de Haard H. J.等(1999) J Biol Chem. ,DYAX)中筛选。这种方法的潜在缺点是，这些文库只是接近于人类种系中天然存在的功能多样性，因而其多样性是较有限的。此外，使用这种方法产生的抗体不包含体内选择的⑶R，因为它们出现在通过主动免疫获得的抗体中，因而通常必须进行亲和力成熟(affinity maturation)以提高其对靶标抗原的亲和力。亲和力成熟是一个耗时的过程，其可能会大大增加筛选出抗体的时间。此外，在亲和力成熟过程中，某些氨基酸残基可能会被改变，这可能对所得的抗体的结合特异性或稳定性和产生具有负面影响(Wu等，J. Mol. Biol. 368 :652-65 (2007))。另一种“完全人”平台是基于用人类种系的抗体编码序列进行改造以取代鼠免疫球蛋白编码区的转基因小鼠(例如HuMab、MedareX)。这些系统的优点是抗体是使用靶标抗原通过主动免疫而产生的，即它们具有针对抗原的高初始亲和力，并且不需要或只需最低限度地对原始抗体进行抗体改造以使它们更加人 源化。然而，转基因小鼠品系必然是高度近交的，这对于抗体应答的强度和多样性具有不利影响。该平台的另一个缺点是在一些转基因小鼠系统中由于人类Fe/小鼠Fe受体相互作用可能导致B细胞成熟障碍。另一种平台是基于免疫非人灵长类动物(特别是食蟹猴(cynomologousmonkey))。由于猴子与人类的免疫球蛋白之间氨基酸序列具有高度一致性，因此推断在猴子中产生的抗体将几乎不需要或不需要为使其适用于人类治疗而额外地对可变结构域进行“人源化”(见W093/02108)。但是,在这些灵长类动物化抗体(primatized antibody)中经常发现VH中⑶Rl和⑶R2形成的非人类典型的折叠组合。
发明内容
本发明提供“人源化”单克隆抗体(抗原结合多肽)平台，其避免了现有技术中人源化或完全人抗体平台所发现的部分或全部缺点，并且其可产生针对广泛的具有治疗意义的靶标抗原具有高度特异性和亲和力的抗体，同时最大限度地减小其在人类宿主中的免疫原性。已经发现，来自于骆驼科(Camelidae)动物常规抗体的VH和VL结构域与人抗体VH和VL结构域在框架区表现出高度的氨基酸序列一致性。事实上，骆驼科动物常规的VH结构域与人类VH结构域之间以及骆驼科动物常规的VL结构域与人类VL结构域之间的序列一致性程度可以接近于在人类与其他灵长类动物物种(例如食蟹猴)之间所观察到的程度，而这远远高于根据人类和骆驼科动物之间的进化距离所预期的程度。该发现是出人意料的，因为胳§它科动物抗体重链可变结构域(variable domain of heavy-chain camel idantibody, VHH)并未显示出与人类的可变结构域具有高度的序列同源性。此外，已经发现骆驼科动物VH和VL结构域的高变环(HI、H2、LI、L2和L3)与人类VH和VL结构域的高变环通常表现出高度的结构同源性，考虑到人类与骆驼科动物之间的进化距离，这又是意料之外的。骆驼科动物常规抗体(或更确切地说是该抗体的高变环)与人抗体之间的高度结构同源性也同样出人意料，这是因为已有报道骆驼科动物抗体重链的高变环在构象和长度上与人类和小鼠VH中相应的环差异很大(见综述De Genst等，Develop Compo Immunol. 30 :187-98 (2006))。与人抗体框架区具有氨基酸一级序列的高度同源性、抗原结合位点(包括高变环)与人抗体结合位点具有的高度结构同源性以及骆驼科动物常规抗体可由与人类有很大进化距离的远交动物种群主动免疫获得的事实导致鉴定了骆驼科动物的常规抗体作为有吸引力的起点用于改造得到在人类治疗中具有潜在应用的单克隆抗体。另外，大量新的常规骆驼科动物抗体已被测序，并且将骆驼科动物VH结构域和VL结构域的氨基酸序列与人VH和VL序列进行比较分析。从这些分析中，鉴定了骆驼科动物VH或VL序列中数个关键的氨基酸位置，这些位置处的氨基酸残基在骆驼科动物与人VH和VL之间存在显著差异。该信息促进了新的人源化策略，其中骆驼科动物VH和/或VL结构域中的一个或更多个特定位置被替换为人VH或VL序列中相应位置的氨基酸。因此，在第一个方面中，本发明提供抗体，其包含骆驼科动物VH结构域以及λ轻链型(νλ)或K轻链型(VK)骆驼科动物VL结构域，其特征在于在所述VH结构域和/或所述VL结构域中存在至少一个氨基酸替换，所述氨基酸替换选自以下(a)所述骆驼科动物VH结构域中的氨基酸替换，其中所述骆驼科动物VH结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH结构域序列中相应位置上所发现的氨基酸， 所述位置根据 Kabat 选自:H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94 和 H108 ;以及(b)所述骆驼科动物VL结构域中的氨基酸替换，其中对λ轻链型的骆驼科动物VL结构域(V λ)而言，所述骆驼科动物V λ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人νλ结构域序列中相应位置上所发现的氨基酸，所述位置根据Kabat选自L1、L2、L3、L7、L8、L9、Lll、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84 和 L103 ;对 κ 轻链型的骆驼科动物VL结构域(Vk)而言，所述骆驼科动物V κ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V κ结构域序列中相应位置上所发现的氨基酸，所述位置根据Kabat为Κ1、Κ3、Κ4、Κ7、Κ9、Kll、Κ12、Κ13、Κ14、Κ15、Κ18、Κ19、Κ36、Κ42、Κ43、Κ45、Κ46、Κ58、Κ63、Κ70、Κ77、Κ78、Κ79、Κ80、Κ83、Κ100、Κ103、Κ104 和 Κ106。在第二个方面中，本发明提供抗体，其包含骆驼科动物VH结构域，其中所述骆驼科动物VH结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH结构域序列中相应位置上所发现的氨基酸，所述位置根据Kabat编号为Hl、Η5、Η7、Hll、Η12、Η13、Η14、Η29、Η30、Η37、Η40、Η48、Η67、Η68、Η69、Η71、Η74、Η77、Η78、Η80、Η81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94或H108 ;和/或包含属于λ轻链型的骆驼科动物VL结构域(V λ )，其中所述骆驼科动物νλ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人νλ结构域序列中相应位置上所发现的氨基酸，所述位置根据Kabat编号为LI、L2、L3、L7、L8、L9、Lll、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84或L103 ;和/或包含属于κ轻链型的骆驼科动物VL结构域(Vk )，其中所述骆驼科动物Vk结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V κ结构域序列中相应位置上所发现的氨基酸，所述位置根据Kabat编号为Κ1、Κ3、Κ4、Κ7、Κ9、Kll、Κ12、Κ13、Κ14、Κ15、Κ18、Κ19、Κ36、Κ42、Κ43、Κ45、Κ46、Κ58、Κ63、Κ70、Κ77、Κ78、Κ79、Κ80、Κ83、Κ100、Κ103、Κ104 或 Κ106。在另一个实施方案中，骆驼科动物种系结构域(即在全部或大多数所分析的体细胞突变(somatically mutated)结构域中所观察到的)中存在的框架残基中不同于最佳匹配人类种系家族成员中存在之相应残基或者与人类种系家族相应共有序列中存在之残基相比为次优的一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人类种系和/或共有序列中相应位置上所发现的氨基酸。次优的是，当骆驼科动物种系结构域中的这些残基与比对时在最佳匹配人类种系中所存在的残基一致时，由体细胞突变引入的与人类种系结构域不同的突变残基(即在体细胞突变骆驼科动物结构域中以较低的频率出现)。在多个实施方案中，VH结构域中使骆驼科动物种系所编码残基转换成最佳匹配人类种系家族成员中所存在之残基或共有人类种系家族之残基的突变如下在一个实施方案中，Hl位的氨基酸被替换。在非限制性的实施方案中，Hl位的氨基酸被替换为Q或E。在一个实施方案中，H7位的氨基酸被替换。在非限制性的实施方案中，H7位的氨基酸被替换为S。在一个实施方案中，Hll位的氨基酸被替换。在非限制性的实施方案中，Hll位的 氨基酸被替换为V。在一个实施方案中，H12位的氨基酸被替换为K。在一个实施方案中，H13位的氨基酸被替换为K，或次优选为R或Q。在一个实施方案中，H14位的氨基酸被替换为P。在一个实施方案中，H29位的氨基酸被替换为V，或次优选为F。在一个实施方案中，H30位的氨基酸被替换为S。在一个实施方案中，H37位的氨基酸被替换为V或I，或次优选为F。在一个实施方案中，H40位的氨基酸被替换为A。在一个实施方案中，H48位的氨基酸被替换为I。在一个实施方案中，H67位的氨基酸被替换为V。在一个实施方案中，H68位的氨基酸被替换为T。在一个实施方案中，H69位的氨基酸被替换为M,或次优选为I或S。在一个实施方案中，H71位的氨基酸被替换为R或V，或次优选为A、E或T。在一个实施方案中，H74位的氨基酸被替换。在非限制性的实施方案中，H74位的所述氨基酸可替换为S或次优选为A。在一个实施方案中，H77位的氨基酸替换S或次优选为T。在一个实施方案中，H78位的氨基酸被替换为V或L，或次优选为A。在一个实施方案中，H80位的氨基酸被替换为M。在一个实施方案中，H81位的氨基酸被替换为K。在一个实施方案中，H83位的氨基酸被替换为R或次优选为K。在一个实施方案中，H84位的氨基酸被替换为A或次优选为T。在一个实施方案中，H85位的氨基酸用替换为A。在一个实施方案中，H86位的氨基酸被替换为D。在一个实施方案中，H94位的氨基酸被替换为R，或次优选为K或T。在一个实施方案中，H108位的氨基酸被替换为M或次优选为L或T。下列为VH结构域中的另一些突变，其转换与人类种系结构域不同的体细胞突变残基，而骆驼科动物种系结构域中的这些残基与最佳匹配之人类种系中所存在的残基一致在一个实施方案中，H5位的氨基酸被替换为L或次优选为V。在一个实施方案中，H82b位的氨基酸被替换为S。在一个实施方案中，H89位的氨基酸被替换为V或次优选为L。在一个实施方案中，H93位的氨基酸被替换为A或次优选为T。VA轻链型中，将骆驼科动物种系所编码残基转换为最佳匹配人类种系家族成员或次优地转换为人类种系家族共有序列的最优选突变是
在一个实施方案中，LI位的氨基酸被替换为S。在一个实施方案中，L2位的氨基酸被替换为Y。在一个实施方案中，L3位的氨基酸被替换为Ε。在一个实施方案中，L7位的氨基酸被替换为D或次优选为P或L。在一个实施方案中，L8位的氨基酸被替换为R或P或次优选为Α、S、L或H。在一个实施方案中，L9位的氨基酸被替换为P或次优选为Α。在一个实施方案中，Lll位的氨基酸被替换为Α、V、S或F或者次优选为L或H。在一个实施方案中，L14位的氨基酸被替换为T、S或Α。在一个实施方案中，L15位的氨基酸被替换为P或次优选为L或Τ。在一个实施方案中，L17位的氨基酸被替换为Q或E或者次优选为Α。在一个实施方案中，L18位的氨基酸被替换为R或S或者次优选为K。在一个实施方案中，L19位的氨基酸被替换为V或P或Α。在一个实施方案中，L20位的氨基酸被替换为R或次优选为S。在一个实施方案中，L39位的氨基酸被替换为H或次优选为P。在一个实施方案中，L40位的氨基酸被替换为P。在一个实施方案中，L42位的氨基酸被替换为K或次优选为Τ。在一个实施方案中，L47位的氨基酸被替换为Μ。在一个实施方案中，L58位的氨基酸被替换为V。在一个实施方案中，L59位的氨基酸被替换为P或次优选为S。在一个实施方案中，L60位的氨基酸被替换为D或次优选为Ε。在一个实施方案中，L66位的氨基酸被替换为S或次优选为N或Τ。在一个实施方案中，L67位的氨基酸被替换为S或L或者次优选为P。在一个实施方案中，L69位的氨基酸被替换为T或N。在一个实施方案中，L70位的氨基酸被替换为T或次优选为Μ、I或Α。在一个实施方案中，L71位的氨基酸被替换为V或次优选为A或Τ。在一个实施方案中，L72位的氨基酸被替换为S或I或者次优选为T或L。在一个实施方案中，L74位的氨基酸被替换为A或次优选为G。在一个实施方案中，L76位的氨基酸被替换为S或Τ。在一个实施方案中，L78位的氨基酸被替换为V或次优选为A、T或I。在一个实施方案中，L80位的氨基酸被替换为S或A或者次优选为T或P。在一个实施方案中，L84位的氨基酸被替换为A或S。在一个实施方案中，L103位的氨基酸被替换为K。
下列为νλ轻链型中的另一些突变，其转换与人类种系结构域不同的体细胞突变残基，而骆驼科动物种系结构域中的这些残基与最佳匹配之人类种系中所存在的残基一致在一个实施方案中，L38位的氨基酸被替换为Q。在一个实施方案中，L44位的氨基酸被替换为P。在一个实施方案中，L46位的氨基酸被替换为L。在一个实施方案中，L49位的氨基酸被替换为Y。下面所列为V κ型轻链中最优选的突变，其将骆驼科动物种系所编码残基转换为最佳匹配人类种系家族成员或者次优地转换为人类种系家族共有序列在一个实施方案中，Kl位的氨基酸被替换为A或次优选为D或N。在一个实施方案中，Κ4位的氨基酸被替换为L或次优选为Μ。在一个实施方案中，Κ7位的氨基酸被替换为S或次优选为Τ。在一个实施方案中，Κ9位的氨基酸被替换为L或D。在一个实施方案中，Kll位的氨基酸被替换为V或L。在一个实施方案中，Κ12位的氨基酸被替换为K、P或A或者次优选为S。在一个实施方案中，Κ13位的氨基酸被替换为K或V。在一个实施方案中，Κ14位的氨基酸被替换为Τ。在一个实施方案中，Κ15位的氨基酸被替换为V或L或者次优选为Τ。在一个实施方案中，Κ18位的氨基酸被替换为P或R或者次优选为Q。在一个实施方案中，Κ19位的氨基酸被替换为Α。在一个实施方案中，Κ36位的氨基酸被替换为Y或次优选为F或L。在一个实施方案中，Κ39位的氨基酸被替换为K。在一个实施方案中，Κ42位的氨基酸被替换为K。在一个实施方案中，Κ43位的氨基酸被替换为A或P或者次优选为V。
在一个实施方案中，Κ45位的氨基酸被替换为K。在一个实施方案中，Κ46位的氨基酸被替换为L或次优选为R。在一个实施方案中，Κ58位的氨基酸被替换为V。在一个实施方案中，Κ63位的氨基酸被替换为S。在一个实施方案中，Κ68位的氨基酸被替换为G。在一个实施方案中，Κ70位的氨基酸被替换为D或次优选为Ε。在一个实施方案中，Κ77位的氨基酸被替换为S或次优选为C。在一个实施方案中，Κ78位的氨基酸被替换为L。在一个实施方案中，Κ79位的氨基酸被替换为Q或Ε。在一个实施方案中，Κ80位的氨基酸被替换为P或A或者次优选为S。在一个实施方案中，Κ83位的氨基酸被替换为F或V或者次优选为I。在一个实施方案中，KlOO位的氨基酸被替换为Q。在一个实施方案中，Κ103位的氨基酸被替换为K。在一个实施方案中，Κ104位的氨基酸被替换为V。在一个实施方案中，Κ106位的氨基酸被替换为I。
下列为Vk型轻链中次优选的突变，其转换与人类种系结构域不同的体细胞突变残基，而骆驼科动物种系结构域中的这些残基与最佳匹配之人类种系中所存在的残基一致在一个实施方案中，K3位的氨基酸被替换为Q或次优选为R。在第二个方面中，本发明提供编码根据本发明第一个方面之抗体的多核苷酸分子。在另一个方面中，本发明提供了包含所述多核苷酸分子(与允许抗体在宿主细胞表达或在无细胞表达系统中转录和翻译的调控序列有效连接)的表达载体，还提供含有所述表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。 在又一个方面中，本发明提供了生产重组抗体的方法，其包括在允许抗体表达的条件下培养所述宿主细胞或无细胞表达系统以及回收所表达的抗体。
图I-显示ELISA的结果，其中经ILl-β免疫的大羊驼(llama)的血清在免疫后第O天及第28天用来检测ILl-β抗体的存在。图2(SEQ ID NO : I 23)-示意与IL-1 β发生免疫反应的两种Fab (编号为1E2和1F2)之“人源化”变体的氨基酸序列。根据与最接近的人类种系的比对，提出了在1Ε2和1F2的VH和νλ框架区具有突变。除了完全人源化的(hum)和野生型的(wt)V区域以外，还提出了只有三个野生型残基保留的“安全变体”(safe)。图3-显示ELISA的结果，其中使用重组表达的Fab来检测其与biot-IL-lBeta结合的能力。为此，利用包被有抗myc包被的Maxisorp板捕获Fab。加入生物素化的人IL-I β，然后使用经HRP缀合的链霉亲和素检测所结合的细胞因子。图4-显示噬菌体ELISA的结果，其中检测了展示Fab 1Ε2和1F2之人源化变体的噬菌体与IL-I β的结合。图5-显示ELISA的结果，其中检测了嵌合1Ε2与IL-I β的结合。图6-显示成熟的大羊驼(Llama glama)VH框架区I(FRl)共有序列与人类种系VH FRl共有序列(VHl VH7，SEQ ID NO : 25 31)的比较。(A)VH1_46大羊驼FRl共有序列(SEQ ID NO 24) (B) VH3-11 大羊驼 FRl 共有序列(SEQ ID NO :32)。(C)VH3_21 大羊驼 FRl 共有序列(SEQ ID NO 33)。(D)VH3_23 大羊驼 FRl 共有序列(SEQ ID NO 34)。(E) VH3-48大羊驼FRl共有序列(SEQ ID NO 35)。(F) (G) VH3-66大羊驼FRl共有序列(SEQ ID NO:36)。(H) VH3 大羊驼 FRl 共有序列(SEQID NO :37)。(I) (J) VH4-30-4 大羊驼 FRl 共有序列(SEQ ID NO 38)。图7-显示成熟的大羊驼VH框架区2 (FR2)共有序列与人类种系VH FR2共有序列(VHl VH7，SEQ ID NO 40 46)的比较。⑷ VH1-46 大羊驼 FR2 共有序列(SEQ ID NO 39)。(B) VH3-11大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO 47)。(C) VH3-21大羊驼FR2共有序列(SEQ ID N0:48)。(D) VH3-23 大羊驼 FR2 共有序列(SEQ ID NO :49)。(E)VH3_48 大羊驼FR2 共有序列(SEQ ID NO :50)。(F) (G) VH3-66 大羊驼 FR2 共有序列(SEQ ID NO :51)。(H)VH3大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO :52)。(I) (J) VH4-30-4大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO 53)。
图8-显示成熟大羊驼VH框架区3(FR3)共有序列与人类种系VH FR3共有序列(VHl VH7，SEQ ID NO :55 61)的比较。(A) VH1-46 大羊驼 FR3 共有序列(SEQ ID NO:54)。(B) (C)VH3-11 大羊驼 FR3 共有序列(SEQ ID NO :62)。(D) (E)VH3_21 大羊驼FR3 共有序列(SEQ ID NO :63)。(F) (G) VH3-23 大羊驼 FR3 共有序列(SEQ ID NO :64)。(H) VH3-48大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO 65)。(I) (J) VH3-66大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO 66)。(K) (L) VH3 大羊驼 FR3 共有序列(SEQ ID NO :67)。(M) (N) VH4-30-4大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO 68)。图9-显示成熟的阿尔帕卡羊驼(Llama pacos) VH框架区I (FRl)共有序列与人类种系VH FRl共有序列(VHl VH7，SEQ ID NO :25 31)的比较。(A) VH1-46阿尔帕卡羊驼FRl共有序列(SEQ ID NO 69)。(B) VH3-66阿尔帕卡羊驼FRl共有序列(SEQ ID NO 70)。(C) VH3-48阿尔帕卡羊驼FRl共有序列(SEQ ID NO :71)。(D) VH3阿尔帕卡羊驼FRl共有序列(SEQ ID NO 72) (E) (F) VH4-30-4 阿尔帕卡羊驼 FRl 共有序列(SEQ ID NO :73)。图10-显示成熟阿尔帕卡羊驼VH框架区2 (FR2)共有序列与人类种系VH FR2共有序列(VHl VH7，SEQ ID NO 40 46)的比较。⑷VH1-46阿尔帕卡羊驼FR2共有序 列(SEQ ID NO 74) (B) (C) VH3-66 阿尔帕卡羊驼 FR2 共有序列(SEQ ID NO :75)。(D)VH3-48阿尔帕卡羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO 76)。(E) (F) VH3阿尔帕卡羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO 77) (G) (H) VH4-30-4阿尔帕卡羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:78)。图11-显示成熟阿尔帕卡羊驼VH框架区3 (FR3)共有序列与人类种系VH FR3共有序列(VHl VH7, SEQ ID NO 55 61)的比较。(A) VH1-46阿尔帕卡羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO 79) (B) VH3-66 阿尔帕卡羊驼 FR3 共有序列(SEQ ID NO :80)。(C) (D)VH3-48阿尔帕卡羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO 81)。(E) VH3阿尔帕卡羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO 82) (F) (G) VH4-30-4 阿尔帕卡羊驼 FR3 共有序列(SEQ ID NO :83)。图12-显示成熟大羊驼VL1-44共有序列的框架区I(FRl)序列(SEQ ID NO 84)与人类种系VL( λ )FR1共有序列的比较。⑷与人VLl VL6 FRl序列(SEQ ID NO 85 90)的比对。(B)与人VL7 VLlO FRl序列(SEQ ID NO 91 94)的比对。图13-显示成熟大羊驼VL1-44共有序列的框架区2(FR2)序列(SEQ ID NO 95)与人类种系VL( λ )FR2共有序列的比较。⑷与人VLl VL6 FR2序列(SEQ ID NO 96 101)的比对。(B)与人VL7 VLlO FR2序列(SEQ ID NO :102 105)的比对。图14-显示成熟大羊驼VL1-44共有序列的框架区3(FR3)序列(SEQ ID NO :106)与人类种系VLU )FR3共有序列的比较。(A)与人VLl至VL8 FR3序列(SEQ ID NO :107 114)的比对。(B)与人VL9 VL10FR3序列(SEQ ID NO :115 116)的比对。图15-显示成熟大羊驼VL2框架区I (FRl)共有序列与人类种系VLFRl共有序列(VKl VK10，SEQ ID NO :118 125)的比较。⑷大羊驼 VL2-11 FRl 共有序列(SEQ IDNO :117)的比对。(B) (C)大羊驼VL2-18 FRl共有序列(SEQ ID NO :126)的比对。图16-显示成熟大羊驼VL2框架区2 (FR2)共有序列与人类种系VLFR2共有序列(VKl VK10)的比较。(A)VL2-11大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO :127)的比对。(B) (C)VL2-18大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO :128)的比对。图17-显示成熟大羊驼VL2框架区3(FR3)共有序列与人类种系VLFR3共有序列(VKl VK10，SEQ ID NO :130 139)的比较。(A) VL2-11 大羊驼 FR3 共有序列(SEQ IDNO :129)的比对。(B) (OVL2-18大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO :140)的比对。图18-显示成熟大羊驼VL3框架区I (FRl)共有序列与人类种系VLFRl共有序列(VLl VL10，SEQ ID NO :85 94)的比较。(A) VL3-19 大羊驼 FRl 共有序列(SEQ ID NO:141)的比对。(B) (OVL3-25大羊驼FRl共有序列(SEQ ID NO :142)的比对。图19-显示成熟大羊驼VL3框架区2 (FR2)共有序列与人类种系VLFR2共有序列(VLl VL10，SEQ ID NO :96 105)的比较。(A) VL3-19 大羊驼 FR2 共有序列(SEQ ID NO:143)的比对。(B) (C)VL3-25大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO :144)的比对。图20-显示成熟大羊驼VL3框架区3(FR3)共有序列与人类种系VL ( λ ) FR3共有序列(VLl VL10, SEQ ID NO :130 139)的比较。(A) VL3-19大羊驼FR3共有序列(SEQID NO :145)的比对。(B) (OVL3-25大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO :146)的比对。图21-显示成熟大羊驼VL5框架区I (FRl)共有序列(SEQ ID NO :147)与人类种系VL FRl共有序列的比较。⑷与人类种系VLl VL6 FRl序列(SEQ ID NO :85 90)的比对。(B)与人类种系VL7 VL10FR1序列(SEQ ID NO 91 94)的比对。图22-显示成熟大羊驼VL5框架区2 (FR2)共有序列(SEQ ID NO :148)与人类种系VL FR2共有序列的比较。⑷与人类种系VLl VL6 FR2序列(SEQ ID NO 96 101)的比对。(B)与人类种系VL7 VLlO FR2序列(SEQ ID NO :102 105)的比对。图23-显示成熟大羊驼VL5框架区3 (FR3)共有序列(SEQ ID NO :149)与人类种系VL FR3共有序列的比较。(A)与人类种系VLl VL6 FR3序列(SEQ ID NO :150 155)的比对。(B)与人类种系VL7 VLlO FR3序列(SEQ ID NO :156 159)的比对。图24-显示成熟大羊驼VL8-61框架区I (FRl)共有序列(SEQ ID NO :160)与人类种系VL FRl共有序列的比较。⑷与人类种系VLl VL6FR1序列(SEQ ID NO 85 90)的比对。(B)与人类种系VL7 VLlO FRl序列(SEQ ID NO :91 94)的比对。图25-显示成熟大羊驼VL8-61框架区2(FR2)共有序列(SEQ ID NO :161)与人类种系VL FR2共有序列的比较。(A)与人类种系VLl VL6FR2序列(SEQ ID NO 96 101)的比对。(B)与人类种系VL7 VL10FR2序列(SEQ ID NO :102 105)的比对。图26-显示成熟大羊驼VL8-61框架区3(FR3)共有序列(SEQ ID NO :162)与人类种系VL FR3共有序列的比较。(A)与人类种系VLl VL6 FR3序列(SEQ ID NO :107 112)的比对。(B)与人类种系VL7 VLlO FR3序列(SEQ ID NO :113 116)的比对。图27-显示成熟大羊驼Vk框架区I (FRl)共有序列与人类种系VL( k )FRl共有序列(VKl VK5，(SEQ ID NO :164 168))的比较。⑷大羊驼VKl FRl共有序列(SEQID NO :163)的比对。(B)大羊驼VK2FR1共有序列(SEQ ID NO :169)的比对。(C)大羊驼VK4 FRl 共有序列(SEQ ID NO :170)比对。图28-显示成熟大羊驼V κ框架区2(FR2)共有序列与人类种系VL(k )FR2共有序列(VKl VK5，(SEQ ID NO :172 176))的比较。(A)大羊驼 VKl FR2 共有序列(SEQ IDNO :171)的比对。(B)大羊驼VK2FR2共有序列(SEQ ID NO :177)比对。(C)大羊驼VK4FR2共有序列(SEQ ID NO :178)的比对。图29-显示成熟大羊驼Vk框架区3 (FR3)共有序列与人类种系VL ( O FR3共有序列(VKl VK5，(SEQ ID NO :180 184))的比较。⑷大羊驼VKl FR3共有序列(SEQID NO 179)的比对。(B)大羊驼VK2FR3共有序列(SEQ ID NO :185)的比对。(C)大羊驼VK4 FR3共有序列(SEQ ID NO :186)的比对。图30-显示人Vk序列(VK1-13、VK2_28、VK4_1)中特定位置上和与每个人V κ序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。(A)FRl和CDRl中特定Kabat位置上的氨基酸利用百分比(虚线部分)。(B)FR2、CDR2、FR3和⑶R3中特定Kabat位置上的氨基酸利用百分比。图31-显示人VLl序列(VL1-44)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。图32-显示特定人VL2序列(VL2-11和VL2-18)中特定位置上和与每个人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。(A)CDRl、FRl、CDR2和FR2中选定的位置。(B)FR2和CDR3中选定的位置。图33-显示特定人VL3序列(VL3-19和VL3-25)中特定位置上和与每个人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。(A)CDRl、FRl和CDR2中选定的位置。(B)FR2、CDR3和FR3中选定的位置。图34-显示人VL5序列(VL5-37)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。图35-显示人VL8序列(VL8-61)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。图36-显示人VHl序列(VH1-46)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。图37-显示选定的人 VH3 序列(VH3-21、VH3-48、VH3-23、VH3-66、VH3-11)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。(A)FR1、CDR1和FR2中选定的位置。(B)⑶R2中选定的位置。(C)FR3中选定的位置。图38-显示人VH4序列(VH4_30_4)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。图39-显示人类种系序列(HJ3)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。图40-显示人VHl序列(VH1-46)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(阿尔帕卡羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。图41-显示人VH3序列(VH3-48和VH3-66)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(阿尔帕卡羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。(A)FRl、CDRl、FR2和CDR2中选定的位置。(B)CDR2和FR3中选定的位置。图42-显示人VH4序列(VH4_30_4)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(阿尔帕卡羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。发明详述本发明涉及来源于骆驼科物种常规抗体库的对期望靶标抗原具有特异性的人源化抗体。
因此，在第一方面中，本发明提供了抗体，更具体的是骆驼科动物来源之抗体的人源化变体，其包含骆驼科动物VH结构域以及λ轻链型(νλ)或κ轻链型(Vk)的骆驼科动物VL结构域，其特征在于在所述VH结构域和/或所述VL结构域中存在至少一个氨基酸替换，所述氨基酸替换选自以下a)所述骆驼科动物VH结构域中的氨基酸替换，其中所述骆驼科动物VH结构域中一个或更多个位置的氨基酸被替换为人VH结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据 Kabat 选自:H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94 和 H108 ;和b)所述骆驼科动物VL结构域中的氨基酸替换，其中对λ轻链型的骆驼科动物VL结构域(V λ )而言，所述骆驼科动物V λ结构域中一个或更多个位置的氨基酸被替换为人VA结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat选自L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49 、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84 和 L103 ;对 κ 轻链型的骆驼科动物VL结构域(V κ )而言，所述骆驼科动物V κ结构域中一个或更多个位置的氨基酸被替换为人Vk结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat选自Κ1、Κ3、Κ4、Κ7、Κ9、Κ11、Κ12、Κ13、Κ14、Κ15、Κ18、Κ19、Κ36、Κ42、Κ43、Κ45、Κ46、Κ58、Κ63、Κ70、Κ77、Κ78、Κ79、1(80、1(83、1(100、1(103、1(104和1(106。在下文中，本发明的不同方面会更详细地定义。除非有明确相反的指示，由此定义的每一方面可以与任何其他方面组合。特别是，任何被作为优选或有利的特征可与任何其他被作为优选或有利的特征组合。定义术语“抗体”以其最广泛的含义使用，涵盖特异性识别靶标抗原的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、抗体片段、免疫粘附素(immunoadhesin)和抗体-免疫粘附素嵌合体。抗体片段的非限制性实例包括单可变结构域(VH > VL 或 V κ) (Skerra A.和 Pluckthun, A. (1988) Science 240 1038-41)、单链抗体(例如，ScFv) (Bird, R. E.等，(1988) Science 242 :423-26 ；Huston, J. S.等，(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-83)、Fab、(Fab/ ) 2 或本领域技术人员所熟知的其他片段。本发明抗体中的VL结构域可以是νλ类型或Vk类型。除非另外说明，本文所使用的术语“ VL结构域”以其广义使用，指κ类型免疫球蛋白轻链的可变结构域(Vk)和λ类型免疫球蛋白轻链的可变结构域(νλ) 二者。术语“骆驼科动物VL结构域”和“骆驼科动物来源的VL结构域”是指分离自骆驼科动物物种的VL结构域(或者V κ类型或者V λ类型，除非另外说明)，以及其相对于天然骆驼科动物VL结构域包含一个或更多个氨基酸替换、插入或缺失的改造变体。术语“骆驼科动物VH结构域”是指骆驼科动物的任何已知重链同种型(包括Y、ε、δ、α或μ同种型)的VH结构域，以及其相对于天然骆驼科动物VH结构域包含一个或更多个氨基酸替换、插入或缺失的改造变体。术语“骆驼科动物VH结构域”仅指骆驼科动物常规抗体的VH结构域，而不包括骆驼科动物VHH结构域。术语“骆驼科动物VH结构域”或“骆驼科动物VL结构域”是指分别包含由常规的骆驼科免疫球蛋白可变区基因序列编码之氨基酸序列的VH结构域或VL结构域。编码骆驼科动物VH和/或VL结构域(λ或κ轻链)的常规骆驼科免疫球蛋白基因序列可得自天然存在的免疫球蛋白基因(包括但不限于，从骆驼科动物(例如经期望抗原免疫的骆驼科动物)得到的种系、重排或体细胞突变的免疫球蛋白基因)，或者得自来源于天然存在的常规骆驼科免疫球蛋白基因序列的合成基因(包括但不限于，已经改变成包含“异源CDR或框架区序列”的天然存在的骆驼科免疫球蛋白基因，或者从头产生的免疫球蛋白基因(其包含天然存在的常规骆驼科免疫球蛋白基因序列的共有序列或嵌合体))的合成基因。术语“骆驼科动物VH结构域”不包括骆驼科VHH结构域。术语“异源⑶R或框架区序列”包括由骆驼科动物VH或VL (V λ /V κ)结构域产生的任何CDR或框架区氨基酸序列改变。术语“相应位置”是指，根据在Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版· Public Health Service, National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.，1983(其通过引用全部并入本文)中所提出的编号系统，在人VH或VL(VA/Vk)结构域序列中相同编号位置的氨基酸。术语“人VH结构域序列”广泛包括由人类种系编码的任何抗体重链可变区序列或 其部分，及其衍生物。人VH结构域序列的合适的非限制性示例包括人重链种系V、D和/或J区序列，成熟的人VH结构域序列(包括体细胞突变VH结构域)，和共有人类种系或成熟人VH结构域序列，或其部分。术语“人VL结构域序列”定义类似。共有序列合适的非限制性示例及其产生方法在美国648213中描述。术语“来源于”是指生物体的成熟可变区氨基酸序列与来自同一生物体的种系编码的V、D和/或J区氨基酸序列之间的同源性程度。认为与特定种系编码的V、D和/或J区氨基酸序列具有最高程度同源性的可变区“来源于”该种系序列。术语“种系序列”是指由存在于生物体基因组DNA中的未重排的免疫球蛋白V、D和/或J区或其一部分所编码的氨基酸序列。本文可以参考属于某家族或与某家族成员匹配的骆驼科动物VH或VL (V λ Λ K)结构域。除非另外说明，否则均基于与人VH或VL(VX或Vk)结构域序列的比对将骆驼科动物VH和VL(VA或Vk)结构域“分配”到特定家族或家族成员。因此，本文可将与人VH3家族(而不是VH1、VH2或VH4等)的VH结构域比对最接近的骆驼科动物VH结构域标识为“骆驼科动物VH3结构域”。本文可将与人VHl家族的VH结构域比对最接近的骆驼科动物VH结构域称作“骆驼科动物VHl结构域”。本文可将与人VH4家族的VH结构域比对最接近的骆驼科动物VH结构域称作“骆驼科动物VH4结构域”。类似的，除非另外说明，否则根据与已知家族或家族成员的人VL (V λ或V κ)结构域的比对，将骆驼科动物VL (V λ或Vk)结构域分配到特定类型。因此，本文可将与κ类型的人VL结构域比对最接近的骆驼科动物VL结构域称作为“骆驼科动物V κ结构域”，简称为“V κ ”;而本文可将与λ类型的人VL结构域比对最接近的骆驼科动物VL结构域称作“骆驼科动物V λ结构域”，简称为“V λ ”。在VK结构域分类中，根据与最接近人亚类型比对，可将骆驼科动物Vk结构域分配到特定的亚类型。因此，本文可将与人V κ 1、Vk 2和Vk 4比对最接近的骆驼科动物Vk结构域分别称作“骆驼科动物V κ I、骆驼科动物V κ 2和骆驼科动物V κ 4”结构域。还可以根据最匹配的人类种系序列将骆驼科动物VH和VL (V λ或V K)结构域进行分类。因此，例如，本文可将与人VH3-23种系比对最接近的骆驼科动物VH结构域称作骆驼科动物VH3-23结构域，等等。类似的，本文可将与人V κ 1-46种系比对最接近的骆驼科动物V K结构域确定为骆驼科动物V K 1-46结构域。此外，还可以根据最匹配的人类种系，将由重链或κ/λ轻链结构域的J区段编码的FR4区进行分类。因此，例如，本文可将与人JH3种系比对最接近的骆驼科动物重链可变结构域的FR4称作骆驼科动物JH3区，并且编码FR4的C端部分对人源化或种系化(germlining)尤其有意义。已知骆驼科动物物种包括两种不同类型的抗体；经典的(或“常规”的)抗体和重链抗体。本文使用的术语“常规抗体”是指任何同种型的抗体，包括IgA、IgG、IgD、IgE或IgM。骆驼科动物本源的或天然的“常规”抗体通常是异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中不同。每条重链和轻链链内也具有规则间隔的二硫桥。每条重链在一端(N端)具有可变结构域(VH)，其后是若干恒定结构域。每条轻链在一端(N端)具有可变结构域(VL)而在另一端具有恒定结构域(CL)，轻链的恒定结构域与重 链的第一个恒定结构域对齐，轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基形成轻、重链可变结构域之间的界面。术语“重链抗体”是指已知在骆驼科物种中天然存在的第二种类型的抗体，该抗体天然缺失轻链(Hamers-Casterman 等,Nature. 1993 ；363 ；446-8)。重链抗体(heavy-chainantibody, HCAb)由共价二硫键连接的两条重链组成。HCAb中每条重链的一端具有可变结构域。为将它们与骆驼科动物“常规”抗体重链的可变结构域(VH)区分开，HCAb的可变结构域被称为“VHH”。VHH结构域与VH结构域完全不同，它们由骆驼科动物基因组中的不同基因区段编码。VA轻链结构域中的第一、第二和第三高变环在本文中被称为L1U)、L2U)和L3U)，并可定义为包含VL结构域中的第24 33位(LI ( λ )、第50 56位(L2 ( λ )和第89 97位(L3U)残基(残基编号根据Kabat，CDR定义根据CHothia (见http://www.bioinf.orq.Uk/abs/#cdrdef))。V κ轻链结构域中的第一、第二和第三高变环在本文中被成为LI ( κ )、L2 ( κ )和L3 ( κ )，并可定义为包含VK结构域中的第24 33位(LI ( λ )、第50 56位(L2 ( λ )和第89 97位(L3 ( λ )残基(残基编号根据Kabat，CDR定义根据 CHothia(见 http://www. bioinf. orq. Uk/abs/#cdrdef))。VH 结构域中的第一、第二和第三高变环在本文中被称为Hl、H2和H3，并可定义为包含VH结构域中的第26 32. . 34位(Hl)、第52 56位(H2)和第95 102位(H3，其长度非常不等)残基(残基编号根据Kabat, CDR 定义根据 CHothia(见 http://www. bioinf. orq. Uk/abs/#cdrdef))。除非另有说明，术语LI、L2和L3分别是指VL结构域的第一、第二和第三高变环，并且包括来自骆驼科动物V κ和νλ同种型二者的高变环。术语Η1、Η2和Η3分别是指VH结构域的第一、第二和第三高变环，并且包括来自骆驼科动物任何已知重链同种型的高变环，包括Y、ε、δ、α或μ。高变环1^1、1^2、1^3、!11、!12和!13可以各自包括“互补决定区”(或“^1 ”)的一部分。术语“高变环”和“互补决定区”不是严格意义的同义词，因为高变环(HV)是基于结构定义的(在 http://www. bioinf. org. Uk/abs/#cdrdef 网页中称为 Chothia 定义)，而互补决定区(CDR)是基于序列可变性定义的(在前述网页中称为Kabat定义；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD.，1983)，并且 HV 和 CDR 的范围在某些 VH和VL结构域中可以不同。按照Kabat(序列可变性)、Chothia(结构)、AbM或基于接触进行的定义可见于上文早先提到的Andrew C.R.Martin' s Bioinformatics Group在UCL的网页(http://www. bioinf. org. Uk/abs/#cdrdef)。V λ结构域的⑶R通常被定义为包含下列氨基酸第24 34位残基(LlU)，在人νλ种系中由11、12、13或14个残基组成)、第50 56位残基仏2(入)，在人￥入种系中由7、11或12个残基组成)和第89 97位残基(L3 ( λ )，在大多数体细胞突变的人抗体中由 9 至 11 个残基组成(Knappik 等，J. Mol. Biol. 296 =57-86(1999)));根据 Kabat 编号。Vk结构域的⑶R通常被定义为包含下列氨基酸第24 34位残基(LI (K)，在人Vk种系中由11、12、16或17个残基组成)、第50 56位残基(L2(k)，在人Vk种系中由7个残基组成)和第89 97位残基(L3 ( κ)，在大多数体细胞突变的人抗体中由10个残基组成(Knappik 等，J. Mol. Biol. 296 :57-86(1999)));根据 Kabat 编号。VH 结构域的 6或7个残基组成)、第50 65位残基(H2，由存在于人类种系VH中的16、17、18或19个残基组成)和第95 102位残基(H3，其长度高度多变)；编号根据Kabat。因此，HV可以包含在相应的CDR中，并且本文中关于VH和VL结构域的“高变环”也应解释为也包括相应的CDR，反之亦然，除非另有说明。在分析体细胞突变和种系VH以及体细胞突变的Vk和V入序列(表I至37)的过程中，使用根据Kabat的⑶R定义(基于可变性)。可变结构域保守性较高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR (分别为FRl、FR2、FR3和FR4)，主要是采取β -片层构型，通过三个高变环相连接。每条链中的高变环通过FR而紧密联系在一起，并与其他链中的高变环一起促成抗体之抗原结合位点的形成。对抗体的结构分析表明序列与通过互补决定区形成的结合位点形状之间的关系(Chothia 等，J. Mol. Biol. 227 :799-817(1992) ；Tramontano 等，J. Mol.Biol, 215 :175-182(1990))。尽管它们具有高度序列可变性，但六个环中有五个只采取了主链构象一小部分，称为“典型结构”。这些构象首先取决于环的长度，其次取决于环和框架区中某些位置关键残基的存在(其通过包装、氢键键合或决定不寻常主链构象的能力来确定构象)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种不同的效应功能，如抗体参与抗体依赖的细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)、补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity, Q)C)、抗体依赖性细胞吞曬(antibody dependent cellular phagocytosis, ADCP)或 FcRn 结合。在本发明的所有方面和实施方案中，骆驼科(或骆驼科动物)物种(本发明抗原结合多肽的高变环或CDR来源于此)可以是骆驼(camel)、大羊驼(llama)、单峰驼(dromedary)、小羊马它(vicunia)、原马它(guanaco)和阿尔帕卡羊马它(alpaca),以及由其杂交的任何物种。大羊§它(Lamaglama)、阿尔帕卡羊骑(Lama pacos)和单峰骑(Camelusdromedarius)是本发明所有方面优选的骆骑科物种。所谓“来自于骆驼科物种的VH结构域或VL结构域的高变环或互补决定区”是指高变环(HV)或CDR具有的氨基酸序列与由骆驼科免疫球蛋白基因编码的高变环或CDR的氨基酸序列一致或基本一致。此处的“免疫球蛋白基因”包括种系基因、已经历重排的免疫球蛋白基因以及体细胞突变基因。因此，来自于骆驼科物种VH或VL结构域的HV或CDR的氨基酸序列可以与存在于成熟的骆驼科常规抗体中的HV或CDR的氨基酸序列一致。本文中的术语“来自于”表明了结构关系，意思是本发明的人源化抗体的HV或CDR代表了最初由骆驼科免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列(或其略微发生改变的变体)。但是，对于制备本发明抗原结合多肽的生产方法而言，该术语并不一定意味着特定的关系。正如下面将要讨论地，若干方法可以用来制备包含HV或CDR(其氨基酸序列与最初由骆驼科免疫球蛋白基因编码的序列一致(或基本上一致))的人源化抗体。为明确起见，术语“骆驼科动物常规抗体的VH结构域”和“来自于骆驼科物种的VH结构域”可同义使用，其包含这样的VH结构域，即合成的或经改造之重组基因(包括密码子经优化的合成基因)的产物，该VH结构域具有的氨基酸序列与骆驼科免疫球蛋白基因(种系的、重排的或体细胞突变的)编码之VH结构域的氨基酸序列一致(或基本一致)。类似地，术语“骆驼科动物常规抗体的VL结构域”和“来自于骆驼科物种的VL结构域”可同义 使用，其包含这样的VL结构域，即合成的或经改造之重组基因(包括密码子经优化的合成基因)的产物，该VL结构域具有的氨基酸序列与骆驼科免疫球蛋白基因(种系的、重排的或体细胞突变的)编码之VL结构域的氨基酸序列一致(或基本一致)。本发明的人源化抗体通常是重组表达的多肽，也可以是嵌合多肽。术语“嵌合多肽”是指通过将不连续存在的两个或更多个肽片段相邻放置而产生的人工(非天然)多肽。此定义中包括“物种”嵌合多肽，其由两个或更多个物种(例如骆驼科动物和人)编码的肽片段相邻放置形成。本发明的人源化抗体不是天然的人抗体(特别是人类自身抗体)，因为至少存在骆驼科动物的VH结构域和/或骆驼科动物的VL结构域。术语“天然的人抗体”是指在人对象中天然表达的抗体。本发明范围内不包括具有与天然人抗体或其片段的氨基酸序列具有100%—致性的氨基酸序列的抗体，其中天然抗体或片段不是嵌合的，并且在氨基酸序列上也没有受到任何经改造的变化(不包括体细胞突变)。骆驼科动物VH和VL结构域的人源化已经认识到骆驼科动物的常规抗体库为制备可用作人治疗剂的抗体提供了有利的起点，这是因为以下的因素(在美国12/497239中讨论，其通过引用并入本文)I)骆驼科动物VH和VL结构域与其人类对应物之间的高序列同源性百分比。2)骆驼科动物VH和VL结构域的CDR与其人类对应物之间的高度结构同源性(即人样典型折叠结构(human-like canonical fold structure)和典型折叠结构的人样组合)。包含骆驼科动物VH和/或VL结构域的抗体用于人类治疗的效用可以通过天然骆驼科动物VH和VL结构域的“人源化”来进一步改善，例如使得它们在人类宿主中具有更小的免疫原性。人源化的总体目的是产生这样的分子，当引入人类对象时，其VH和VL结构域表现出尽可能小的免疫原性，同时保留由亲本VH和VL结构域所形成之抗原结合位点的特异性和亲和力。一种人源化的方法(所谓的“种系化”)包括改造骆驼科动物VH或VL结构域的氨基酸序列，使其更接近于人VH或VL结构域的序列。
对于选择待改变的骆驼科动物氨基酸残基(在给定的VH或VL结构域)和选择合适的替换氨基酸残基二者来说，对骆驼科动物VH(或VL)结构域与人类VH(或VL)结构域之间同源性的确定是人源化过程的关键步骤。根据大量新的骆驼科动物VH(和VL)结构域序列(通常是已知结合靶标抗原的体细胞突变VH(或VL)结构域)与人类种系VH(或VL)序列、人VH(和VL)共有序列的比对，以及阿尔帕卡羊驼的种系序列信息，开发出人源化的方法。这种方法使得能够鉴定出骆驼科动物VH(或VL)结构域中通常与人类种系VH(或VH)结构域中显示出错配的特定残基作为用于候选的替换残基。就在大羊驼中产生的大量体细胞突变抗体V结构域与和人类种系不同的种系编码的框架区残基(和互补决定残基)进行比对，并鉴定了对于人源化和种系化而言的优选突变。此外，鉴定了通过体细胞突变引入的差异(其在大多数的其他骆驼科动物家族成员中与人类种系一致)，这些被归类为次优突变。在对任何给定的骆驼科动物VH(或VL)结构域进行人源化时，下文概括出了用于以下的原则(i)选择被替换的“骆驼科动物”氨基酸残基以及(ii)选择用于进行替换的“人类”氨基酸。 人源化方法概述步骤I.选择与待人源化的骆驼科动物成熟序列具有最高同源性/同一性的人类(种系)家族和该家族的成员。对于任何给定骆驼科动物VH(或VL)结构域而言确定最匹配人类种系的一般方法如下所述。步骤2.选择特定的人类种系家族成员用于对其进行种系化。优选为具有最高同源性的种系或来自同一家族的另一个种系家族成员。步骤3.根据与所选择的人类种系最接近的骆驼科动物序列的氨基酸使用列表来确定种系化所考虑的优选位置。步骤4.尝试改变骆驼科动物序列中与最接近的人类种系不同的氨基酸，FR残基的种系化与CDR残基相比是更优选的。a.优选的是与选择用于进行种系化的人类种系不同的位置，对于它们来说骆驼科动物序列中存在的氨基酸与所选择的种系不匹配，并且在同一亚类型的其他种系中未发现(由V以及J编码的FR氨基酸)。b.在种系化过程中还可以处理以下位置，这些位置与所选择的人类种系家族成员不同，但其用于同一家族的其他种系中。c.还可处理与所选择的人类种系的其他错配(例如，因为额外的体细胞突变)。可以使用以下方法来确定与给定的骆驼科动物VH(或VL)结构域最匹配的人类种系在分析骆驼科和人类种系VH和VL之间序列一致性的百分比前，可先确定典型折叠，其可用于识别具有Hl和H2或者LI和L2(及L3)典型折叠之相同组合的人类种系区段家族。随后，可选择那些与目的骆驼科动物可变结构域具有高度序列同源性的人类种系家族成员用于计算序列同源性。高变环LI、L2、L3、Hl和H2之正则标准类型(Chothiacanonical classes)的确定可通过使用在网站 www. bioinf. org. uk/abs/chothia. html.page上公开可用的生物信息学工具进行。该程序的输出结果显示了在数据文件中需要的关键残基。在这些数据文件中，显示出关键残基的位置以及每个位置上允许的氨基酸。抗体可变结构域序列被作为输入，并首先与按Kabat编码系统编码的共有抗体序列进行比对。典型折叠的分析采用了一系列来自于Martin和Thornton发明的自动化方法的关键残基模板(Martin等，J. Mol. Biol. 263 :800-815 (1996))。各个框架区的边界可使用MGT编码方案分配，该编码系统是Chothia编码方案的改编(Lefranc et al，NAR 27:209-212(1999)；http://imgt. cines. fr)。使用已知特定的人类种系V区段(其使用与Hl和H2或者LI和L2 (及L3)同样的典型折叠组合)，可以确定就序列同源性而言最佳匹配的家族成员。使用生物信息学工具可以确定骆驼科VH和VL结构域的框架氨基酸序列与由人类种系编码的相应序列之间的序列一致性百分比，但也可以手动比对这些序列。人类免疫球蛋白序列可以从若干蛋白质数据库中确定，如 VBase (http://vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/)或 Pluckthun/Honegger 数据库(http://www. bioc. unizh. ch/antibody/Sequences/Germline)。为了比较人类序列与胳马它科VH或VL结构域的V区,可以使用序列比对算法(如通过像www. expasy. ch/tools/#align的网站可获得的)，而对于有限的序列也可进行手动比对。可以选出与每条链的框架区1、2和3具有最高程度同源性的具有相同典型折叠组合的人类种系的轻链和重链序列家族，并 与目的骆驼科可变结构域进行比较；FR4也与人类种系的JH和JK或几区进行比较。注意，在计算序列同源性的整体百分比时，使用与具有相同典型折叠组合的人类种系家族最匹配的序列来评估FR1、FR2和FR3的残基。只计算了与具有相同典型折叠的组合的同一家族中最匹配的成员或其他成员不同的残基(注不包括FRl中任何引物编码的差异)。然而，为了人源化的目的，框架区中与其他人类种系家族成员一致的残基(其不具备相同的典型折叠的组合)可以考虑用于人源化，然而事实上，根据上述严格的条件，这些都被归为“阴性的”。这种假设是基于用于人源化的“混合与匹配(mix and match) ”法，其中FRU FR2、FR3和FR4均被分别与其最匹配的人类种系序列进行比较，并且人源化的分子因此包含了不同FR的组合，正如Qu及其同事(Qu等，Clin. Cancer Res. 5 :3095-3100(1999))和 Ono 及其同事(Ono 等，Mol. Immunol. 36 :387-395 (1999))所做的一样。用于人源化的氨基酸位置核心列表根据骆驼科动物成熟VH和VL结构域与人类种系的VH/VL共有序列的比对，以及与最接近的人类种系序列的比对，已确定骆驼科动物VH结构域和VL结构域中的以下残基作为候选残基用于替换根据Kabat 编号，骆驼科动物 VH 结构域的 H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94 或 H108 ；根据Kabat 编号，骆驼科动物 V λ 结构域的 LI、L2、L3、L7、L8、L9、LI I、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84 或 L103。根据Kabat 编号，骆驼科动物 Vk 结构域的 Kl、Κ3、Κ4、Κ7、Κ9、KlI、Κ12、Κ13、Κ14、Κ15、Κ18、Κ19、Κ36、Κ42、Κ43、Κ45、Κ46、Κ58、Κ63、Κ70、Κ77、Κ78、Κ79、Κ80、Κ83、Κ100、Κ103、Κ104 或 Κ106。应当将这些列表视为骆驼科动物VH框架氨基酸位置的核心系列，和V λ和Vk框架氨基酸位置的核心系列(在向对骆驼科动物VH或νλ或Vk结构域(意图人源化)而言一致的人类种系之特定人类种系进行种系化时，该位置可考虑改变)。每个核心系列中的氨基酸位置都存在于框架区FR1、FR2、FR3或FR4中。因此，本发明提供了包含骆驼科动物VH结构域的抗体，其中，Hl、H5、H7、Hl I、Hl2、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94或H108位置(根据Kabat)中一个或更多个位置上的天然氨基酸被替换为除骆驼科动物VH结构域中上述位置上天然存在的氨基酸以外的氨基酸。尤其是，H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94 或 H108 位置中一个或更多个位置上的氨基酸可被替换为人VH结构域序列中相应位置上的氨基酸。本发明提供了包含骆驼科动物V λ结构域(νλ)的抗体，其中，L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84 或 L103 位置(根据 Kabat)中一个或更多个位置上的天然氨基酸被替换为除骆驼科动物V λ结构域中上述位置上天然存在的氨基酸以外的氨基酸。尤其是，LI、L2、L3、L7、L8、L9、Lll、L14、L15、L17、L18、L19、L20、 L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84或L103位置中一个或更多个位置上的氨基酸可被替换为人V λ结构域序列中相应位置上的氨基酸。本发明提供了包含骆驼科动物V κ结构域(Vk)的抗体，其中，Kl、Κ3、Κ4、Κ7、Κ9、Kll、Κ12、Κ13、Κ14、Κ15、Κ18、Κ19、Κ36、Κ42、Κ43、Κ45、Κ46、Κ58、Κ63、Κ70、Κ77、Κ78、Κ79、1(80、1(83、1(100、1(103、1(104或1(106位置(根据Kabat)中一个或更多个位置上的天然氨基酸被替换为除骆驼科动物Vκ结构域中上述位置上天然发现的氨基酸以外的氨基酸。尤其^,KUK3,K4,K7,K9,K1UK12,K13,K14,K15,K18,K19,K36,K42,K43,K45,K46,K58,K63,K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104或K106位置中一个或更多个位置的氨基酸可被替换为人V κ结构域序列中相应位置上的氨基酸。根据本发明的抗体可包含骆驼科动物VH结构域(其包含在上述核心列表中任何一个或更多个VH氨基酸位置上的氨基酸替换)与骆驼科动物V λ或V κ结构域(其包含在上述核心列表中任何一个或更多个Vλ或Vk氨基酸位置上的氨基酸替换)的组合。待替换到核心列表中Η1、Η5、Η7、Η11、Η12、Η13、Η14、Η29、Η30、Η37、Η40、Η48、Η67、Η68、Η69、Η71、Η74、Η77、Η78、Η80、Η81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94 或 H108 中每个位置上的氨基酸可以是满足以下的任何氨基酸a)不是起始骆驼科动物VH结构域中该位置上的天然氨基酸，和b)可见于一个或更多个人VH结构域序列中相应位置上。类似的，待替换到核心列表中LI、L2、L3、L7、L8、L9、Lll、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84*L103中每个位置上氨基酸可以是满足以下的任何氨基酸a)不是起始骆驼科动物V λ结构区中该位置上的天然氨基酸，和b)可见于一个或更多个人V λ结构域序列中相应位置上。类似的，待替换到核心列表中Κ1、Κ3、Κ4、Κ7、Κ9、Κ11、Κ12、Κ13、Κ14、Κ15、Κ18、Κ19、Κ36、Κ42、Κ43、Κ45、Κ46、Κ58、Κ63、Κ70、Κ77、Κ78、Κ79、Κ80、Κ83、Κ100、Κ103、Κ104 或 Κ106中每个位置上的氨基酸可以是满足以下的任何氨基酸a)不是起始骆驼科动物Vk结构区中该位置的天然氨基酸，和b)可见于一个或更多个人Vk结构域序列中相应位置上。骆驼科动物VH或VL向特定VH或VL类型或亚类型的种系化已经确定了另一系列氨基酸残基，其与骆驼科动物VH或VL结构域向特定人类种系类型或亚类型的种系化特别相关。因此，在一些具体的实施方案中本发明提供如下包含与人VH3结构域同源之骆驼科动物VH结构域的抗体，其中，所述骆驼科动物 VH 结构域中 HI、H5、H13、H14、H29、H37、H40、H74、H77、H78、H83、H84、H86 或 H94 (根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH3结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。包含与人VHl结构域同源之骆驼科动物VH结构域的抗体，其中，所述骆驼科动物VH 结构域中 H1、H7、H11、H12、H13、H69、H71、H78、H80 或 H86 (根据 Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VHl结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
包含与人VH4结构域同源之骆驼科动物VH结构域的抗体，其中，所述骆驼科动物VH 结构域中 H1、H30、H48、H67、H68、H71、H81、H84、H85 或 H86(根据 Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH4结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。包含与人V λ I结构域同源之骆驼科动物V λ结构域的抗体，其中，所述骆驼科动物νλ 结构域的Lll、L14、L18、L19、L69、L74、L76或L80(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VLl结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。包含与人νλ 2结构域同源之骆驼科动物νλ结构域的抗体，其中，所述骆驼科动物 V λ 结构域的 L8、L14、L15、L17、L18、L39、L42、L47、L58、L59 或 L80 (根据 Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V λ 2结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。包含与人V λ 3结构域同源之骆驼科动物V λ结构域的抗体，其中，所述骆驼科动物 νλ 结构域的 L1、L2、L3、L5、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L19、L20、L60、L66、L69、L70、L71、L72、L76、L78或L84 (根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V λ 3结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。包含与人V λ 5结构域同源之骆驼科动物V λ结构域的抗体，其中，所述骆驼科动物VA结构域的L2、Lll、L17、L19、L40、L70、L72或L80 Q^gKabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V λ 5结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。包含与人V λ 8结构域同源之骆驼科动物V λ结构域的抗体，其中，所述骆驼科动物VA结构域的L2、Lll、L60、L67、L80、L81或L84(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V λ 8结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。包含与人Vk I结构域同源之骆驼科动物Vk结构域的抗体，其中，所述骆驼科动物 Vk 结构域的 KU Κ4、Κ11、Κ12、Κ13、Κ15、Κ42、Κ43、Κ70、Κ77、Κ79、Κ80 或 Κ83 (根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V κ I结构域序列中相应位置上存在的
氨基酸。包含与人Vk 2结构域同源之骆驼科动物V κ结构域的抗体，其中，所述骆驼科动物 Vk 结构域的 Κ7、Κ9、Κ12、Κ14、Κ18、Κ36、Κ46、Κ63、Κ77、Κ79 或 Κ83(根据 Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vk 2结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。包含与人Vk 4结构域同源之骆驼科动物Vk结构域的抗体，其中，所述骆驼科动物 V K 结构域的 K9、K11、K12、K13、K15、K18、K19、K39、K43、K45、K58、K68、K78、K80 或K83(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V κ 4结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。选择替换氨基酸的原理为了选择要替换进骆驼科动物VH(或V λ或V O结构域中选定的替换氨基酸位置的合适的替换氨基酸，可再次参考将骆驼科动物VH(或V λ或V κ)结构域氨基酸序列与人VH (或νλ或Vk)结构域氨基酸序列(通常是人类种系VH (或V λ或V κ)序列以及种系JH (或JX或Jk)序列)，或特定VH (或V λ或V κ)家族或该家族成员的共有序列进行比对。可以采取若干不同的方法来选择“人类”残基，以替换本文所确定的一个或更多个位置上骆驼科动物天然氨基酸残基。首先，可以选择在最匹配/ 一致的人类种系VH或V λ或Vk结构域(或者至少是与骆驼科动物起始VH或VA或Vk结构域非常匹配的人类种系，优选同一家族的成员或作为该家族中最匹配人类种系序列的成员)相应位置上存在的替换人类氨基酸残基。为任何给定骆驼科动物VH或νλ或Vk结构域选择最匹配之人类 种系序列的方法在以上给出。其次，可从最常使用的人类种系中为VH或νλ家族或家族成员(骆驼科动物VH/V λ/V κ结构域被分配其中)选择替换人类残基。例如，如果骆驼科动物VH结构域被确定为属于VH3家族，那么最常使用的人VH3种系家族成员V3-23可用作替换氨基酸残基的来源。使用序列比对来确定与骆驼科动物VH/V λ/V κ结构域序列中待替换氨基酸残基对应的人类残基。以下表I至3列出了优选的人VH、V λ和乂!^种系，其为属于特定家族或家族成员的骆驼科动物VH/V λ/V κ结构域提供替换人类氨基酸残基的来源。表I-优选的VH种系
駱驼科动物序列与人的优选的人VH种系同源性
VH3 家族3-23. 3-66, 3-74、3-48、3-53, 3-21、3-11、3-20、3-7、3-15、3-13
Vl 14 家族4-30, ‘31、4-59、4-61、4-39, 4-b、4-28. 4-34、4-4
VHI 家族1-46、1-18、1-3, 1-49. 1-15, 3-73, 3-15, 3-49|表2-优选的V κ种系
同源性
Vk-2 家族^^2D-29 2-28V 2-29, 2-40, 2-30, 2-040, 4-1. 3-20
VkI 家族1-13. 1-27、1-39. 1-6. 1-S、1-33、1-8、1-9 1-17. 1-12. 4-1. 3-20
Vk4 家族4-1、2-40. 2-D40、1-12、1-13. 1-D12、^1-27, i-20. 3D-7. 2D-21), I
D-3'>. 3-15
表3-优选的V λ种系
权利要求
1.包含骆驼科动物VH结构域以及\轻链型(VX)或K轻链型(Vk)骆驼科动物VL结构域的抗体，其特征在于在所述VH结构域和/或所述VL结构域中存在至少ー个氨基酸替换，所述氨基酸替换选自以下 (a)所述骆驼科动物VH结构域中的氨基酸替换，其中所述骆驼科动物VH结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据 Kabat 选自 HI、H5、H7、Hll、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94 和 H108 ;以及 (b)所述骆驼科动物VL结构域中的氨基酸替换，其中对所述\轻链型(VX)的骆驼科动物VL结构域而言，所述骆驼科动物V A结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V入结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat选自L1、L2、L3、L7、L8、L9、Lll、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、し60、し66、し67、し69、し70、し71、し72、し74、し76、し78、し80、し84和し103;对所述k轻链型(Vk)的骆驼科动物VL结构域而言，所述骆驼科动物V K结构域的ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vk结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat选自K1、K3、 K4、K7、K9、Kll、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104 和 K106。
2.根据权利要求I所述的抗体，其中所述骆驼科动物VH结构域与人VH3结构域同源，并且所述骆驼科动物VH结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH3结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat为Hl、H13、H14、H29、H30、H37、H40、 74、H77、H78、H82b、H83、H84、H86、H89、H93 或 H94。
3.根据权利要求I或2所述的抗体，其中H74位的氨基酸被替换。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中H74位的氨基酸被替换为S或A，优选为S。
5.根据权利要求I或2所述的抗体，其中H83位的氨基酸被替换。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中H83位的氨基酸被替换为R或K，优选为R。
7.根据权利要求I或2所述的抗体，其中H84位的氨基酸被替换。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中H84位的氨基酸被替换为A或T，优选为A。
9.根据权利要求I或2所述的抗体，其中H94位的氨基酸被替换。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中H94位的氨基酸被替换为R。
11.根据权利要求I或2所述的抗体，其中进行下述氨基酸替换中的ー个或更多个 Hl位被替换，优选替换为Q或E ; H13位被替换，优选替换为Q、R或K ; H14位被替换，优选替换为P ； H29位被替换，优选替换为F或V ; H30位被替换，优选替换为S、D或G ; H37位被替换，优选替换为V、F或I，最优选为V ； H40位被替换，优选替换为A ； H77位被替换，优选替换为T或S ; H78位被替换，优选替换为L或A，最优选为L ； H82b位被替换，优选替换为S ；H86位被替换，优选替换为D ； H89位被替换，优选替换为V或L，最优选为V ； H93位被替换，优选替换为A或T。
12.根据权利要求I所述的抗体，其中所述骆驼科动物VH结构域与人VHl结构域同源，并且所述骆驼科动物VH结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VHl结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat为H1、H7、H11、H12、H13、H69、H71、H78、H80 或 H86。
13.根据权利要求I或12所述的抗体，其中Hll位的氨基酸被替换，优选替换为V。
14.根据权利要求I或12所述的抗体，其中H12位的氨基酸被替换，优选替换为K。
15.根据权利要求I或12所述的抗体，其中H13位的氨基酸被替换，优选替换为K。
16.根据权利要求I或12所述的抗体，其中H69位的氨基酸被替换，优选替换为I、M或S，最优选为M。
17.根据权利要求I或12所述的抗体，其中H71位的氨基酸被替换，优选替换为R、A、E或T，最优选为R。
18.根据权利要求I或12所述的抗体，其中H80位的氨基酸被替换，优选替换为M。
19.根据权利要求I或12所述的抗体，其中H86位的氨基酸被替换，优选替换为D。
20.根据权利要求I或12所述的抗体，其中H78位的氨基酸被替换，优选替换为V或A0
21.根据权利要求I或12所述的抗体，其中Hl位的氨基酸被替换，优选替换为Q或E。
22.根据权利要求I或12所述的抗体，其中H7位的氨基酸被替换，优选替换为S。
23.根据权利要求I所述的抗体，其中所述骆驼科动物VH结构域与人VH4结构域同源，并且所述骆驼科动物VH结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH4结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat为Hl、H16、H23、H30、H48、H49、H67、H68、H71、H81、H84、H85、H86。
24.根据权利要求I或23所述的抗体，其中H16位的氨基酸被替换，优选替换为E。
25.根据权利要求I或23所述的抗体，其中H23位的氨基酸被替换，优选替换为A或T。
26.根据权利要求I或23所述的抗体，其中H30位的氨基酸被替换，优选替换为S。
27.根据权利要求I或23所述的抗体，其中H48位的氨基酸被替换，优选替换为I。
28.根据权利要求I或23所述的抗体，其中Hl位的氨基酸被替换，优选替换为Q或E。
29.根据权利要求I或23所述的抗体，其中H67位的氨基酸被替换，优选替换为V。
30.根据权利要求I或23所述的抗体，其中H68位的氨基酸被替换，优选替换为T。
31.根据权利要求I或23所述的抗体，其中H71位的氨基酸被替换，优选替换为V。
32.根据权利要求I或23所述的抗体，其中H81位的氨基酸被替换，优选替换为K。
33.根据权利要求I或23所述的抗体，其中H84位的氨基酸被替换，优选替换为A。
34.根据权利要求I或23所述的抗体，其中H85位的氨基酸被替换，优选替换为A。
35.根据权利要求I或23所述的抗体，其中H86位的氨基酸被替换，优选替换为D。
36.根据权利要求I至35中任一项所述的抗体，其中H108位的氨基酸被替换，优选替换为し
37.根据权利要求I所述的抗体，其中所述骆驼科动物VL结构域属于λ轻链型(νλ)，并且所述骆驼科动物νλ结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人νλ结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat为LI、L2、L3、L5、L7、L8、L9、LI I、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L81、L84、L103、L104、L108。
38.根据权利要求37所述的抗体，其中所述骆驼科动物Vλ结构域与人νλ I结构域同源，并且所述骆驼科动物V λ结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V λ I结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat为Lll、L14、L18、L19、L38、L69、L74、L76 或 L80。
39.根据权利要求I或38所述的抗体，其中进行下述氨基酸替换中的ー个或更多个 Lll位的氨基酸被替换，优选替换为A或V ; L14位的氨基酸被替换，优选替换为A或T，更优选为A ； L18位的氨基酸被替换，优选替换为R或K，更优选为R ； L19位的氨基酸被替换，优选替换为V ； L38位的氨基酸被替换，优选替换为Q ； L69位的氨基酸被替换，优选替换为T ； L74位的氨基酸被替换，优选替换为A或G ; L76位的氨基酸被替换，优选替换为S或T ; L80位的氨基酸被替换，优选替换为S、T或A。
40.根据权利要求37所述的抗体，其中所述骆驼科动物Vλ结构域与人V λ 2结构域同源，并且其中所述骆驼科动物V λ结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V λ 2结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat为L3、L8、L14、L15、L17、L18、L39、L42、L47、L58、L59 或 L80。
41.根据权利要求I或40所述的抗体，其中进行下述氨基酸替换中的ー个或更多个 L3位的氨基酸被替换，优选替换为A ； L8位的氨基酸被替换，优选替换为A、P或R ; L14位的氨基酸被替换，优选替换为S ； L15位的氨基酸被替换，优选替换为P ； L17位的氨基酸被替换，优选替换为Q ； L18位的氨基酸被替换，优选替换为S ； L39位的氨基酸被替换，优选替换为H或P，更优选为H ； L42位的氨基酸被替换，优选替换为K或T，更优选为K ； L47位的氨基酸被替换，优选替换为M ； L58位的氨基酸被替换，优选替换为V ； L59位的氨基酸被替换，优选替换为P或S ; L80位的氨基酸被替换，优选替换为A。
42.根据权利要求37所述的抗体，其中所述骆驼科动物Vλ结构域与人V λ 3结构域同源，并且所述骆驼科动物Vλ结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V λ 3结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat为L1、L2、L3、L5、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L19、L20、L44、L46、L49、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L76、L78 或 L84。
43.根据权利要求I或42所述的抗体，其中进行下述氨基酸替换中的ー个或更多个 LI位的氨基酸被替换，优选替换为S ； L2位的氨基酸被替换，优选替换为Y ； L3位的氨基酸被替换，优选替换为E ； L5位的氨基酸被替换，优选替换为M ； L7位的氨基酸被替换，优选替换为D或P ; L8位的氨基酸被替换，优选替换为P、S、L或H，优选为P ； L9位的氨基酸被替换，优选替换为S或A ; Lll位的氨基酸被替换，优选替换为V ； L14位的氨基酸被替换，优选替换为A或S ; L15位的氨基酸被替换，优选替换为P、L或T，优选为P ； L19位的氨基酸被替换，优选替换为A或V，优选为A ； L20位的氨基酸被替换，优选替换为R或S，优选为R ； L44位的氨基酸被替换，优选替换为P ； L46位的氨基酸被替换，优选替换为L ； L49位的氨基酸被替换，优选替换为Y ； L60位的氨基酸被替换，优选替换为E或D，更优选为E ； L66位的氨基酸被替换，优选替换为S、N或T ; L67位的氨基酸被替换，优选替换为S或P ; L69位的氨基酸被替换，优选替换为T或N ; L70位的氨基酸被替换，优选替换为T、M或I，更优选为T ； L71位的氨基酸被替换，优选替换为A、V或T ; L72位的氨基酸被替换，优选替换为T或S，更优选为T ； L76位的氨基酸被替换，优选替换为S或T，更优选为S ； L78位的氨基酸被替换，优选替换为V、A、T或I，更优选为V或A ; L84位的氨基酸被替换，优选替换为A。
44.根据权利要求37所述的抗体，其中所述骆驼科动物VA结构域与人V入5结构域同源，并且所述骆驼科动物V A结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V A 5结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat为L2、L11、L17、L19、L40、L70、L72 或 L80。
45.根据权利要求I或44所述的抗体，其中进行下述氨基酸替换中的ー个或更多个 L2位的氨基酸被替换，优选替换为P ； Lll位的氨基酸被替换，优选替换为L、S或H ; L17位的氨基酸被替换，优选替换为A或E，更优选为A ； L19位的氨基酸被替换，优选替换为A或V ; L40位的氨基酸被替换，优选替换为P ； L70位的氨基酸被替换，优选替换为A或T，更优选为A ； L72位的氨基酸被替换，优选替换为I或L，更优选为I ;L80位的氨基酸被替换，优选替换为S或P，更优选为S。
46.根据权利要求37所述的抗体，其中所述骆驼科动物Vλ结构域与人V λ 8结构域同源，并且所述骆驼科动物Vλ结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人V λ 8结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat为L2、Lll、L60、L67、L80、L81或L84。
47.根据权利要求I或46所述的抗体，其中进行下述氨基酸替换中的ー个或更多个 L2位的氨基酸被替换，优选替换为T ； Lll位的氨基酸被替换，优选替换为F ； L60位的氨基酸被替换，优选替换为D ； L67位的氨基酸被替换，优选替换为L ； L80位的氨基酸被替换，优选替换为A ； L81位的氨基酸被替换，优选替换为D ； L84位的氨基酸被替换，优选替换为S。
48.根据权利要求37至47中任一项所述的抗体，其中L103位的氨基酸被替换，优选替换为K。
49.根据权利要求I所述的抗体，其中所述骆驼科动物VL结构域属于K轻链型(Vk)，并且所述骆驼科动物Vk结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vk结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat为KU Κ2、Κ3、Κ4、Kll、Κ12、Κ13、Κ14、Κ15、Κ42、Κ43、Κ70、Κ77、Κ79、Κ80、Κ83、Κ7、Κ9、Κ14、Κ18、Κ36、Κ46、Κ63、Κ19、Κ39、Κ45、Κ58、Κ68、Κ78、Κ100、Κ103、Κ104 或 Κ106。
50.根据权利要求49所述的抗体，其中所述骆驼科动物VK结构域与人Vkl结构域同源，并且所述骆驼科动物V K结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vkl结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat*Kl、K2、K4、Kll、K12、K13、K15、K42、K43、K70、K77、K79、K80 或 K83。
51.根据权利要求I或50所述的抗体，其中进行下述氨基酸替换中的ー个或更多个 K2位的氨基酸被替换，优选替换为D、A或N ; K4位的氨基酸被替换，优选替换为M或L ; Kll位的氨基酸被替换，优选替换为V ； K12位的氨基酸被替换，优选替换为K ； K13位的氨基酸被替换，优选替换为K ； K15位的氨基酸被替换，优选替换为V或T，最优选为V ； K42位的氨基酸被替换，优选替换为K ； K43位的氨基酸被替换，优选替换为A或V，最优选为A ； K70位的氨基酸被替换，优选替换为D或E，最优选为D ； K77位的氨基酸被替换，优选替换为S或C，更优选为S ； K79位的氨基酸被替换，优选替换为Q ； K80位的氨基酸被替换，优选替换为P或S，最优选为P ； K83位的氨基酸被替换，优选替换为F、I或V，最优选为F。
52.根据权利要求50所述的抗体，其中所述骆驼科动物VK结构域与人Vk2结构域同源，并且所述骆驼科动物V K结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vk2结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述氨基酸根据Kabat为K7、K9、K12、K14、K18、K36、K46、K63、K77、K79 或K83。
53.根据权利要求I或52所述的抗体，其中进行下述氨基酸替换中的ー个或更多个 K7位的氨基酸被替换，优选替换为T或S ; K9位的氨基酸被替换，优选替换为L ； K12位的氨基酸被替换，优选替换为P ； K14位的氨基酸被替换，优选替换为T ； K18位的氨基酸被替换，优选替换为P或Q，最优选为P ； K36位的氨基酸被替换，优选替换为Y、F或L，最优选为Y ； K46位的氨基酸被替换，优选替换为L或R，最优选为L ； K63位的氨基酸被替换，优选替换为S ； K77位的氨基酸被替换，优选替换为R ； K79位的氨基酸被替换，优选替换为E ； K83位的氨基酸被替换，优选替换为V或F，更优选为V。
54.根据权利要求50所述的抗体，其中所述骆驼科动物VK结构域与人Vk4结构域同源，并且所述骆驼科动物V K结构域中ー个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vk4结构域序列中相应位置上存在的氨基酸，所述位置根据Kabat为K9、Kll、K12、K13、K15、K18、K19、K39、K43、K45、K58、K68、K78、K80 或 K83。
55.根据权利要求I或54所述的抗体，其中进行下述氨基酸替换中的ー个或更多个 K9位的氨基酸被替换，优选替换为D ； Kll位的氨基酸被替换，优选替换为L ； K12位的氨基酸被替换，优选替换为A ； K13位的氨基酸被替换，优选替换为V ； K15位的氨基酸被替换，优选替换为L ； K18位的氨基酸被替换，优选替换为R ； K19位的氨基酸被替换，优选替换为A ； K39位的氨基酸被替换，优选替换为K ； K43位的氨基酸被替换，优选替换为P ； K45位的氨基酸被替换，优选替换为K ； K58位的氨基酸被替换，优选替换为V ； K68位的氨基酸被替换，优选替换为G ； K78位的氨基酸被替换，优选替换为L ； K80位的氨基酸被替换，优选替换为A ； K83位的氨基酸被替换，优选替换为V。
56.根据权利要求50至55中任一项所述的抗体，其中L103位的氨基酸被替换，优选替换为K。
57.根据权利要求50至55中任一项所述的抗体，其中L104位的氨基酸被替换，优选替换为V。
58.根据权利要求50至55中任一项所述的抗体，其中L106位的氨基酸被替换，优选替换为I。
59.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述骆驼科动物VH和/或VL结构域包含至少ー个异源⑶R、框架区或其部分。
60.根据权利要求59所述的抗体，其中所述异源CDR或框架区得自啮齿类动物、兔类动物、骆驼科动物、灵长类动物或软骨鱼。
61.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述人VH或VL(V λ或Vk)结构域序列是体细胞突变的人可变区或其部分。
62.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述人VH或VL(V λ或Vk)结构域序列包含共有序列或其部分。
63.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其为Fab、Fab’、F(ab’)2、双特异性Fab'Fv片段、双抗体、线性抗体、单链可变区片段(scFv)、由抗体片段形成的抗体或多特异性抗体。
64.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其还包含至少ー个来自于非骆驼科动物抗体的CHI、CH2或CH3结构域。
65.根据权利要求64所述的抗体，其中所述非骆驼科动物抗体为人抗体。
66.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其包含选自IgG、IgM、IgD、IgE和IgA的人重链恒定区。
67.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其包含人K或λ轻链恒定区。
68.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述骆驼科动物VH和/或VL结构域来源于骆驼、大羊驼、单峰驼、小羊驼、原驼或阿尔帕卡羊驼。
69.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述骆驼科动物VH和/或VL结构域序列来源于大羊驼或阿尔帕卡羊驼。
70.编码前述权利要求中任一项所述抗体的多核苷酸分子。
71.表达载体，其包含与调控序列有效连接的权利要求70所述多核苷酸，所述调控序列允许所述抗体在宿主细胞或无细胞表达系统中表达。
72.包含权利要求71所述之表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。
73.生产重组抗体的方法，包括在允许所述抗体表达的条件下培养权利要求71所述宿主细胞或无细胞表达系统以及回收所表达的抗体。
全文摘要
本公开内容涉及来源于骆驼科(Camelidae)物种常规抗体库的人源化抗体。具体地，本公开内容提供包含骆驼科动物VH结构域以及λ轻链或κ轻链型骆驼科动物VL结构域的抗体，其特征在于所述VH结构域和/或VL结构域中存在至少一个人源化氨基酸替换。
文档编号C07K16/24GK102858800SQ201180012187
公开日2013年1月2日 申请日期2011年1月4日 优先权日2010年1月4日
发明者托尔斯滕·德赖尔, 约翰内斯·约斯夫·威廉默斯·德哈德 申请人:阿尔金-X公司