人源化抗体表达载体及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种人源化抗体表达载体及其构建方法，是通过将含有2A序列的轻链的恒定区基因序列CL-2A和重链的恒定区基因序列CH，分别与pMD18-T载体连接得到pMD18-T-CL-2A质粒和pMD18-T-CH质粒，将pMD18-T-CL-2A质粒和真核表达载体双酶切后连接得到含CL-2A的真核表达载体，再与pMD18-T-CH质粒连接而得到含CL-2A-CH的真核表达载体。本发明的表达载体构建方法只需要将鼠源或者人源抗体的可变区序列插入到相应的位点就能快速构建全长的完整抗体序列，简单实用，用于快速构建嵌合抗体，人源化抗体等。
【专利说明】人源化抗体表达载体及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于载体构建领域，具体地说，本发明涉及一种人源化抗体表达载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002]由于单克隆抗体的高度特异性，使其在细胞生物学、基础医学、临床诊断、治疗等领域得到了广泛的应用。但同时单克隆抗体也存在一些缺陷，鼠源性抗体应用于人体会产生抗鼠抗体反应(HAMA)等，会妨碍其在临床上的应用。为了克服单克隆抗体的缺点，利用基因工程技术制备嵌合抗体，人源化抗体等，在尽量保留原有抗体的特异性的前提下减少了抗体中的鼠源成分。
[0003]目前构建嵌合抗体，完整的人源化抗体等一般需要先扩增出人源性抗体的轻重链恒定区基因，然后通过重叠PCR的方法与所需表达抗体的可变区相连后再构建至表达载体中，该过程比较费时、费力。
[0004]另外目前常用的噬菌体抗体库等筛选方法所筛选出来的抗体一般为ScFv，Fab等，还需要进一步构建全长的完整抗体。
【发明内容】
[0005]基于此，本发明克服了上述现有技术的缺陷，提供了一种完整的人源化抗体的表达载体的快速构建方法。
[0006]一种人源化抗体表达载体的构建方法，包括以下步骤:
[0007](I)将碱基组成如SEQ ID N0:6所示的含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A与碱基组成如SEQ ID NO: 7所示的重链Y I的恒定区基因序列CH分别与pMD18_T载体连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到PMD18-T-CL-2A质粒和pMD18-T_CH质粒；
[0008](2)将PMD18-T-CL-2A质粒和真核表达载体分别用HindIII和BamHI进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得含CL-2A的真核表达载体；
[0009](3)将步骤⑵的含CL-2A的真核表达载体和步骤⑴的pMD18-T_CH质粒分别用XbaI和XhoI进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得人源化抗体表达载体。
[0010]在其中一个实施例中，所述含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A是通过以下步骤制备得到的:
[0011]将健康人淋巴细胞的总RNA，反转录成单链cDNA，以单链cDNA为模板，SEQ IDNO:1和SEQ ID NO: 2为扩增引物，进行第一次PCR扩增，得到PCR产物；以所述PCR产物为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3为扩增引物，进行第二次PCR扩增，得到含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A。其中，
[0012]C, h游引物:AAGCTTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT (SEQ ID NO:1)，含有 HindIII 酶切位占.[0013]Q下游引物1:
[0014]CCAACTTGAGCAGGTCAAAGTTCAAAAGCTGCTATGAACATTCTGTAGG(SEQ ID NO:2)
[0015]Cl下游引物2:
[0016]GGATCCGGGCCCAGGATTGGACTCAACGTCCCCCGCCAACTTGAGCAGGTCAA(SEQ ID NO:3)，含有BamHI酶切位点；
[0017]Q下游引物1、2中包含了 2A的序列，由于2A的序列较长，因此使用两次PCR反应以便把完整的2A的基因序列添加到CL链的末端。
[0018]在其中一个实施例中，所述第一次PCR扩增的反应体系为:
[0019]
【权利要求】
1.一种人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将碱基组成如SEQID N0:6所示的含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A与碱基组成如SEQ ID NO: 7所示的重链Y I的恒定区基因序列CH分别与pMD18_T载体连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到PMD18-T-CL-2A质粒和pMD18-T_CH质粒； (2)将pMD18-T-CL-2A质粒和真核表达载体分别用HindIII和BamHI进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得含CL-2A的真核表达载体； (3)将步骤(2)的含CL-2A的真核表达载体和步骤(1)的pMD18-T-CH质粒分别用XhoI和XbaI进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得人源化抗体表达载体。
2.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A是通过以下步骤制备得到的: 将健康人淋巴细胞的总RNA，反转录成单链cDNA，以单链cDNA为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2为扩增引物，进行第一次PCR扩增，得到PCR产物；以所述PCR产物为模板，SEQID NO:1和SEQ ID NO: 3为扩增引物，进行第二次PCR扩增，得到含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A。
3.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述重链Yl的恒定区基因序列CH是通过以下步骤制备得到的: 以全长人源性质粒H为模板，SEQ ID Ν0:4和SEQ ID NO: 5为扩增引物，进行PCR扩增，得到重链Y I的恒定区基因序列CH。
4.根据权利要求2所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述第一次PCR扩增的反应体系为:
5.根据权利要求2所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述第二次PCR扩增的反应体系为:
6.根据权利要求3所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为:
7.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述连接体系为: PMD18-T 载体0.5yL CL-2A/CH4.5 μ L Solution I5 μ L 所述连接条件为22°C连接5h。
8.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)-步骤(3)中所述转化包括以下步骤: (a)于30μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中加入2 μ L连接产物，轻轻旋动以混匀，冰中放置30min ；(b)42°C水浴热激90s ； (c)迅速转移到冰浴中放置2min； (d)加入ImLLB培养基，于37°C，160rpm振荡培养Ih； (e)取100μ L培养液涂布到含有Amp的LB琼脂平板培养基上，将平板置于37°C放置Ih后倒置平 皿，于37 °C培养过夜。
9.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述真核表达载体为pcDNA3.1。
10.权利要求1-9任一项所述的构建方法得到的人源化抗体表达载体。
【文档编号】C12N15/66GK103898141SQ201310737306
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2012年12月27日
【发明者】万晓春, 吕卫东 申请人:深圳先进技术研究院