专利名称：抗体的选择性富集的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白、尤其是免疫球蛋白或具有Fe域的其他蛋白的纯化方法。
现有技术生物分子(例如蛋白、聚核苷酸、多糖等)在作为药物、诊断剂、食品添加剂、清洁剂等、研究试剂方面及对于许多其他应用而言具有日益增加的商业重要性。通过自天然来源分离分子(例如在蛋白的情况下)通常不再能够满足对所述生物分子的需要，而需要使用生物技术制备方法。 蛋白的生物技术制备通常始于将DNA片段克隆至适合的表达载体中。将表达载体转染至适合的原核或真核表达细胞中且随后选择经转染的细胞后，在生物反应器中培养所述经转染的细胞且表达所要蛋白。接着收集细胞或培养物上清液，且处理并纯化其中所含的蛋白。在真核表达系统的情况下，即当使用哺乳动物细胞培养物(例如CHO或NSO细胞)时，在过去15年中细胞培养物或细胞培养上清液中所要蛋白的浓度显著增加，此可在表达步骤中达成。相比之下，在相同时期，在蛋白的后续纯化中所用的色谱材料的结合能力仅略微增加。为此，迫切需要生物分子、尤其是蛋白的经改良且最佳化的纯化方法，所述方法可在大工业规模上进行。在生物药物(例如用作药物的蛋白，例如治疗性抗体)的情况下，除产物产率以夕卜，分离杂质亦至关重要。方法依赖性杂质与产物依赖性杂质之间可加以区分。方法依赖性杂质含有宿主细胞的组分，例如蛋白(宿主细胞蛋白，HCP)及核酸，且源于细胞培养(例如培养基的组分)或处理(例如盐或溶解的色谱配位体)。产物依赖性杂质为具有不同特性的产物分子变异体。这些变异体包括截短形式(例如前体及水解分解产物)，以及例如通过脱除氨基、不正确糖基化或误连接二硫桥产生的经修饰形式。产物依赖性变异体亦包括聚合物及聚集物。其他杂质为污染物。此术语涵盖具有化学、生物化学或微生物学性质且不直接属于制备方法的所有其他物质。污染物的实施例包括可能以不需要的方式存在于细胞培养物中的病毒。在生物药物的情况下，杂质产生安全性问题。若通过注射或输注将治疗性蛋白直接给予血流中，如生物药物中极常发生，则这些问题加剧。因此，宿主细胞组分可能引起过敏反应或免疫病理学影响。此外，杂质亦可能导致所给予的蛋白产生不需要的免疫原性，即其可能在患者体内引发不需要的对治疗剂的免疫反应，从而可能造成危及生命的过敏性休克。因此，需要适合的纯化方法，借助于所述方法可使所有非所需的物质降至无害程度。另一方面，即使在生物药物的情况下，仍不能忽视经济考虑因素。因此，所用制备及纯化方法不应损害由此制备的生物医药产品的经济生存力。作为蛋白的处理及加工步骤，(柱)色谱方法以及过滤及沉淀方法至关重要。因此，浓缩抗体的确切操作包括通过亲和色谱纯化的步骤。目前已知许多柱色谱方法及可用于这些方法的色谱材料。亲和色谱基质在工业纯化各种物质中用作固定相。经固定的配位体可用于特定浓缩及纯化对于所用特定配位体具有特定亲和力的物质。对于抗体(免疫球蛋白)的工业纯化，尤其是单克隆抗体的纯化，经固定的蛋白A常常用于初始纯化步骤。蛋白A为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的约41kDa的蛋白，其以高亲和力(ICT8M-ICr12M人类IgG)结合于免疫球蛋白Fe区的CH2/CH3域。在蛋白A色谱中，移动相中具有蛋白A结合Fe区的免疫球蛋白或融合蛋白特异性结合于共价偶合至载体(例如琼脂糖(Sepharose))的蛋白A配位体。金黄色葡萄球菌的蛋白A(野生型蛋白A)及经遗传修饰的重组蛋白A经非共价相互作用而与抗体的恒定区(Fe片段)相互作用。此特异性相互作用可用于有效分离杂质与抗体。通过改变pH,可刻意终止抗体与蛋白A配位体之间的相互作用且自固定相释放或洗脱抗体。
除蛋白A作为亲和配位体以外，目前已知许多结合于Fe片段的其他分子。因此， 使用蛋白A的个别域替代完整蛋白(8)。已知与蛋白A的B域确切不同的蛋白变异体，其适合结合含Fe片段的分子(16，17)。这些不同变异体基本上不同在于突变，所述突变已插入以提高稳定性或结合亲和力。这些B域的突变体通常称作Z域或蛋白Z。除蛋白A或蛋白G以外，多种肽亦适合选择性结合于Fe片段(14)。现今对Fe片段的亲和配位体的极大关注使得吾人推测会发现更多亲和配位体。然而，亲和色谱及尤其是经常使用的蛋白A色谱花费高，且确切而言，当发酵槽中产物浓度增加且有大量产物时，可进行的色谱纯化方法有所限制。关键点为装载量、循环数、处理时间、池体积及缓冲液的量。因此，将来需要替代性纯化方法。包括亲和色谱及亲和色谱的替代方法的常规纯化策略的一般概述可见于以下文章中(7，10)。新近亲和色谱方法不使用恒定固定的亲和配位体，而是始于与标靶蛋白混合的溶解亲和配位体(11)。该亲和配位体带有融合标记或融合蛋白，可能使该亲和配位体固定于固相上，该固定发生于第二步骤中。在下一步骤中，如在常规亲和色谱中，标靶蛋白与配位体在适合条件下分离且因此自柱洗脱。在此所述的本发明使用亲和沉淀替代亲和色谱来纯化生物分子。此方法在较大规模使用时确实显示具有极大潜力(1，2)。亲和沉淀为最有效的蛋白沉淀方法(2)。蛋白自溶液中沉淀一般为经常使用的熟知方法。因此，许多蛋白已通过蛋白混合物进行硫酸铵沉淀而自溶液中分离。在此沉淀期间，大分子(例如蛋白)自溶液移出且转化为粒子。视粒子与溶液之间的密度差异及粒子直径而定，此步骤导致沉淀。然而，此沉淀通常非特异地发生。因此，为更选择性地浓缩分子(例如蛋白)，开发出亲和沉淀。亲和沉淀是利用亲和分子与标靶分子的选择性结合。亲和分子可为例如蛋白、肽、寡核苷酸或小化学分子。亲和沉淀在两种原理之间有所区别，这两种原理为第一级亲和沉淀及第二级亲和沉淀(7)。在第一级亲和沉淀中，亲和分子与标靶分子均具有两个结合位点，使得两个分子之间有可能形成网络，且形成在特定尺寸下沉降的亲和复合物。在第二级亲和沉淀中，使用例如亲和巨型配位体(AML)。在此类型的沉淀中，亲和分子结合于可刺激性物质(通常为聚合物)。可刺激性物质因环境条件改变(例如PH值或温度变化)而改变其溶解特征，且发生沉淀。不同于第一级亲和沉淀，不需要双官能亲和分子或双官能标靶分子。在普遍使用的亲和沉淀中，目前亲和配位体偶合至聚合物或其他介质(15)。含Fe片段的分子的亲和沉淀已描述于许多研究中。目前最常见应用的特征为使用所谓的“智慧型聚合物(smart polymer)”。“智慧型聚合物”(或刺激反应性“智能”聚合物或亲和巨型配位体)为可对外部影响(物理或化学刺激)作出反应而改变特性的聚合物。这些刺激可为例如PH值或温度变化(12-13)。通常，智慧型聚合物对其刺激作出反应而在溶液中沉淀。在上清溶液进行所要分离之后，通过适合条件可使此沉淀逆转。智慧型聚合物可与多种生物分子结合，从而使得可用于各种应用的聚合物/生物分子系统大量积聚。这些生物分子的实施例包括蛋白、寡核苷酸及糖。另一形式的亲和沉淀为最近公开的“亲和浸没(affinity sinking)”方法。在此形式的亲和沉淀中，使用连接分子骨架使许多亲和配位体彼此结合。此继而使得有可能形 成沉淀所需的网络。亲和配位体与网络形成物的结合可以以非共价方式与共价方式进行。此方法最近描述于专利 “Compositions and methods for purifying and crystallizingmolecules of interest”中(6)。在此方法中，首先将含有抗体的溶液与共价结合于交联剂的亲和配位体混合。未观察到沉淀。仅在随后添加配位离子或分子之后，方产生沉淀。在第二种类似应用中，亲和配位体连接于生物素结合蛋白，该生物素结合蛋白与介质抗生物素蛋白形成网络(9)。美国专利7，083，943描述如下亲和沉淀其中标靶蛋白的结合域连接于骨架域，该骨架域的氨基酸序列预期可有助于发生沉淀的趋势。Chen及Hoffman (15)描述IgG与聚(N-异丙基丙烯酰胺)-蛋白A结合物的亲和沉淀。然而，抗体与未经修饰的蛋白A的沉淀尚未证实有效。现有技术中所述的方法的一个缺陷为，在第一级亲和沉淀期间，沉淀仅可能经由交联分子达成；或在第二级亲和沉淀中，需要可刺激性物质。最为熟知的亲和沉淀的其他缺陷一方面为a)位阻，其中标靶蛋白的结合受高分子亲和巨型配位体的结合的限制；b)已沉淀的聚合物复合物的再溶解较缓慢；c)杂质的非特异性共沉淀，此一般需要第二沉淀步骤；d)使亲和蛋白与聚合物或与交联剂结合的额外步骤(2-5)。
发明内容
本发明涉及利用具有两个结合位点的结合蛋白的亲和沉淀，其完全不需要额外的融合蛋白或连接分子。亲和蛋白本身足以用于沉淀，且不需要固定相。在此所用的发明内容亦可较容易地回收亲和蛋白。本发明尤其涉及一种选择性浓缩免疫球蛋白或含有Fe域的其他蛋白(标靶蛋白)的方法，其包括以下步骤a.制备含有标靶蛋白的溶液；b.在允许发生结合的条件下引入确切具有两个结合位点的Fe结合蛋白；c.自液相分离沉淀物；d.解除标靶蛋白与Fe结合蛋白的结合。在另一方面中，本发明涉及一种方法，其中Fe结合蛋白为蛋白A或蛋白G的Fe结合域的二聚体。优选地，该二聚体的两个单体经由二硫桥彼此连接。
在另一方面中，本发明涉及一种方法，其中二聚体为均二聚体，其单体具有SEQ IDNO: I、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7 或与 SEQ ID NO: I 的不同之处在于 1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 个氨基酸的序列。在另一方面中，所用Fe结合蛋白相对于标靶蛋白的比率为0. 5-20。步骤a.中溶液的PH值优选为5. 5-8。优选地，步骤d.中的结合解除在2-4. 5的pH值进行。在另一方面中，本发明涉及一种由2个相同亚单元组成的Fe结合蛋白，所述亚单元具有序列 SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7 或与 SEQ ID NO: I 的不同之处在于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 个氨基酸的序列，该两个亚单元经由共价键彼此连接。优选地，该共价键为二硫键。
图I a 二聚体的SDS-PAGE。为显示经由半胱氨酸达成的二聚，在施用于SDS-PAGE 之前添加碘乙酰胺或碘乙酰胺与二硫苏糖醇
~与0. 6 y mo I碘乙酰胺混合的重组Z- 二聚体
—I与0. 3y mol DTT及碘乙酰胺混合的重组Z- 二聚体
~纯的重组Z- 二聚体
4科姆比标记物(Kombi marker)
~与0. 2 y mol碘乙酰胺混合的重组Z- 二聚体
6与0. I y mol DTT及0. 2 y mol碘乙酰胺混合的重组Z- 二聚体
~纯的重组Z- 二聚体图2 :使用Z- 二聚体进行的亲和沉淀。作为第一步骤，使蛋白Z氧化。在第二步骤中，向含有抗体(mAB)的溶液中添加Z- 二聚体，这使得抗体选择性沉淀；图3 :在酸性条件下分离Z 二聚体与抗体的离子交换色谱的UV图(实验2)。220nm下的UV色谱图以红色显示，280nm下的UV色谱图以蓝色显示，且缓冲液B (20mM磷酸盐，3MNaCl)的递增含量以绿色显示；图4 :实验 2 的 SDS-PAGE
~经纯化的抗体
~~2蛋白Z 二聚体
权利要求
1.一种选择性浓缩免疫球蛋白或含有Fe域的其他蛋白(标靶蛋白)的方法，所述方法包括以下步骤 a.制备含有该标革巴蛋白的溶液； b.在允许发生结合的条件下引入确切具有两个结合位点的Fe结合蛋白； c.自液相分离沉淀物； d.解除该标革巴蛋白与该Fe结合蛋白的结合。
2.权利要求I的方法，其特征在于该Fe结合蛋白为蛋白A或蛋白G的Fe结合域的二聚体。
3.权利要求2的方法，其特征在于该Fe结合域包含或含有序列SEQID NO: I至SEQ IDNO: 11 之一。
4.权利要求2或3的方法,其特征在于该二聚体的两个单体由二硫桥连接在一起。
5.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于该二聚体为均二聚体，其单体具有序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 7 或与 SEQ ID NO: I 不同之处在于 I、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 个氨基酸的序列。
6.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于使用该Fe结合蛋白相对于该标靶蛋白的摩尔比为0. 5-20。
7.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤a.中该溶液的pH为5.5-9，优选为6-8。
8.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤d.中的结合解除在2-4.5的pH发生。
9.一种Fe结合蛋白，其由2个相同亚单元组成,所述亚单元具有序列SEQ ID NO: 1>SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7 或与 SEQ ID NO: I 不同之处在于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的序列，其中该两个亚单元经由共价键连接在一起。
10.权利要求9的Fe结合蛋白，其特征在于该共价键为二硫键。
全文摘要
本发明涉及一种选择性浓缩免疫球蛋白或含有Fc域的其他蛋白(标靶蛋白)的方法，其包括以下步骤e.制备含有标靶蛋白的溶液；f.在允许发生结合的条件下引入精确具有两个结合位点的Fc结合蛋白；g.自液相分离沉淀物；h.解除标靶蛋白与Fc结合蛋白的结合。
文档编号C07K14/31GK102791728SQ201180012227
公开日2012年11月21日 申请日期2011年3月2日 优先权日2010年3月5日
发明者D.安布罗修斯, M.迪特尔勒, M-K.霍耶, P.多伯西恩 申请人:贝林格尔.英格海姆国际有限公司