一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法，属于传感分析技术领域。
【背景技术】
[0002]核酸适配体aptamer是一段脱氧核糖核酸DNA或者核糖核酸RNA序列，可以通过体外筛选出具有特定序列的一种物质，它能与多种目标物质高特异性、高选择性的结合。它是一种新型的识别分子，具有许多优点，如可化学合成、稳定性好、没有毒性。经过科研工作者的大量研宄表明，核酸适配体中的碱基“T”和“C”能够特异性的识别重金属离子Hg2+和Ag+，从而形成稳定的“T-Hg2+-T”和“C-Ag+-C”结构。研宄者利用这一特殊的结构，设计了许多检测Hg2+和Ag +的体系，如荧光、电化学、电化学发光以及比色法。
[0003]重金属，其中的一种定义就是比重大于5的元素都称之为重金属，主要包括Au、Ag、Cu、Pb、N1、Co、Cr、Hg、Cd、As等45种，这些重金属在水体中不能被分解，在微生物的作用下能够转化为毒性更强的金属化合物。生物从环境中提取重金属，经过食物链的生物放大作用，在较高级别生物体内富集，然后通过食物进入人体，危害人体健康。发生在日本的水俣病和骨痛病分别由重金属汞和镉污染造成的。因此，重金属的检测显得尤为重要。
[0004]本发明利用“T-Hg2+_T”和“C-Ag+_C”结构，设计不同序列的核酸适配体，采用电化学方法，实现对重金属离子的检测。为了加快分析速度，本发明采用磁性玻碳电极，通过磁性玻碳电极固定链霉亲和素修饰的磁珠SA-Fe3O4,从而有效增强了电极的稳定性，链霉亲和素和生物素具有较强的特异性结合能力，将核酸适配体进行生物素标记，通过链霉亲和素和生物素之间的结合能力，能够有效的将核酸适配体固定到电极表面，从而增加电极的稳定性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是设计不同序列的核酸适配体，构建一种快速、灵敏的电化学传感器。
[0006]本发明的目的之二是将构建的电化学传感器用于重金属离子的检测。
[0007]本发明的技术方案如下:
1.一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法
(1)将直径为4mm的磁性玻碳电极用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨，接着用蒸馏水将电极表面冲洗干净后用吸水纸擦干；将电极置于5mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2?0.6V扫描，峰电位差小于IlOmV ;滴加6 μ L、l~5 mg/mL的磁珠SA- Fe3O4,静置晾干；
(2)在步骤(I)修饰的电极表面滴加6yL、200 nmol/L的核酸适配体B1-ssDNA，室温孵育30 min，接着用pH=7.4Tris-HCl_NaCl缓冲溶液洗工作电极，洗去多余的ssDNA ； (3)将步骤(2)修饰的工作电极浸入到不同浓度的重金属离子中，保持30 min ; (4)在步骤(3)修饰的工作电极表面滴加3 μ LU.0 mmol/L的硫堇于电极表面，待电极表面干后，用Tris-HCl-NaCl溶液清洗两次，最后将其放在4 °0冰箱内保存备用；
所述的磁珠SA-Fe3O4是用链霉亲和素修饰的；
所述的核酸适配体B1-ssDNA是用生物素标记的；
2.重金属离子的检测方法
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，将构建的基于核酸适配体的电化学传感器作为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，在10 mL、50 mmol/L、pH 5.80 ~ 8.49的PBS缓冲溶液中进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法DPV对重金属离子进行检测，设置扫描电位范围为-0.4-0 V，扫速为0.1 V/s，扫描完成后记录峰电流的大小，并保存数据；
(3)根据所得的峰电流的大小与重金属离子浓度的关系，绘制工作曲线；
(4)将待测水样品溶液代替重金属离子进行检测。
[0008]所述的重金属离子可以是汞离子Hg2+或者银离子Ag +。
[0009]本发明的有益成果
(I)将链霉亲和素修饰的磁珠引入电化学传感器的构建过程中，利用磁性玻碳电极，从而增加了修饰电极的稳定性。
[0010](2)利用链霉亲和素与生物素特异性结合反应，增加了电极的稳定性。
[0011](3)利用“T-Hg2+-T”及“C-Ag+-C”结构，设计特定序列的核酸适配体，从而增强了电极对重金属离子的选择性，增加了传感器的特异性。
[0012](4)本发明制备的电化学传感器用于重金属离子的检测，具有较高的选择性和抗干扰能力，检测限低，线性范围宽。用于分析汞离子的检测限为0.33 nmol/L，线性范围1-200 nmol/L。
[0013]所述的基本试剂与材料均可在试剂公司购买。
【具体实施方式】
[0014]实施例1一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法
(1)将直径为4mm的磁性玻碳电极用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨，接着用蒸馏水将电极表面冲洗干净后用吸水纸擦干。然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2?0.6 V扫描，峰电位差小于110 mV ;然后滴加6 yL、l mg/mL的磁珠SA-Fe3O4，静置晾干；
(2)滴加6yL、200 nmol/L的核酸适配体B1-ssDNA，室温孵育30 min，接着用pH=7.4Tris-HCl-NaCl冲洗电极，洗去多余的B1-ssDNA ；
(3)将修饰的工作电极浸入到不同浓度的重金属离子中，保持30min ；
(4)滴加3μ LU.0 mmol/L的硫堇与电极表面，待电极表面干后，用Tris-HCl-NaCl溶液清洗两次，最后将其放在4 °C冰箱内保存备用；
所述的磁珠SA-Fe3O4是用链霉亲和素修饰的；所述的核酸适配体B1-ssDNA是用生物素标记的。
[0015]实施例2—种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法 (1)将直径为4mm的磁性玻碳电极用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨，接着用蒸馏水将电极表面冲洗干净后用吸水纸擦干。然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2?0.6V扫描，峰电位差小于110 mV ;然后滴加6 μ L、3mg/mL的磁珠SA-Fe3O4，静置晾干；
(2)滴加6yL、200 nmol/L的核酸适配体B1-ssDNA，室温孵育30 min，接着用pH=7.4Tris-HCl-NaCl冲洗电极，洗去多余的B1-ssDNA ；
(3)将修饰的工作电极浸入到不同浓度的重金属离子中，保持30min ；
(4)滴加3μ LU.0 mmol/L的硫堇与电极表面，待电极表面干后，用Tris-HCl-NaCl溶液清洗两次，最后将其放在4 °C冰箱内保存备用；
所述的磁珠SA-Fe3O4是用链霉亲和素修饰的；所述的核酸适配体B1-ssDNA是用生物素标记的。
[0016]实施例3—种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法
(1)将直径为4mm的磁性玻碳电极用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨，接着用蒸馏水将电极表面冲洗干净后用吸水纸擦干。然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2?0.6 V扫描，峰电位差小于110 mV ;然后滴加6 yL、5 mg/mL的磁珠SA-Fe3O4，静置晾干；
(2)滴加6yL、200 nmol/L的核酸适配体B1-ssDNA，室温孵育30 min，接着用pH=7.4Tris-HCl-NaCl冲洗电极，洗去多余的B1-ssDNA ；
(3)将修饰的工作电极浸入到不同浓度的重金属离子中，保持30min ；
(4)滴加3μ LU.0 mmol/L的硫堇与电极表面，待电极表面干后，用Tris-HCl-NaCl溶液清洗两次，最后将其放在4 °C冰箱内保存备用；
所述的磁珠SA-Fe3O4是用链霉亲和素修饰的；所述的核酸适配体B1-ssDNA是用生物素标记的。
[0017]实施例4电化学传感器用于重金属Hg2+的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，将构建的基于核酸适配体的电化学传感器作为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，在10 mL、50 mmol/L、pH 5.80 ~ 8.49的PBS缓冲溶液中进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法DPV对Hg2+进行检测，设置扫描电位范围为-0.4-0 V，扫速为
0.1 V/s，扫描完成后记录峰电流的大小，并保存数据；
(3)根据所得的峰电流的大小与Hg2+浓度的关系，绘制工作曲线；
(4)将待测水样品溶液代替Hg2+进行检测。其检测限为0.33nmol/L，线性范围1~200nmol/L。
[0018]实施例5电化学传感器用于重金属Ag+的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，将构建的基于核酸适配体的电化学传感器作为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，在10 mL、50 mmol/L、pH 5.80 ~ 8.49的PBS缓冲溶液中进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法DPV对Ag+进行检测，设置扫描电位范围为_0.4~0V，扫速为0.1V/s，扫描完成后记录峰电流的大小，并保存数据；
(3)根据所得的峰电流的大小与Ag+浓度的关系，绘制工作曲线；(4)将待测水样品溶液代替Ag+进行检测。
【主权项】
1.一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)将直径为4 mm的磁性玻碳电极用1.0、0.3、0.05 μ m的Al2O3抛光粉打磨，接着用蒸馏水将电极表面冲洗干净后用吸水纸擦干；将电极置于5mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2?0.6V扫描，峰电位差小于IlOmV ;滴加6 μ L、l~5 mg/mL的磁珠SA- Fe3O4,静置晾干； (2)在步骤(I)修饰的电极表面滴加6yL、200 nmol/L的核酸适配体B1-ssDNA，室温孵育30 min，接着用pH=7.4Tris-HCl_NaCl缓冲溶液洗工作电极，洗去多余的ssDNA ； (3)将步骤(2)修饰的工作电极浸入到不同浓度的重金属离子中，保持30min ; (4)在步骤(3)修饰的工作电极表面滴加3 μ LU.0 mmol/L的硫堇于电极表面，待电极表面干后，用Tris-HCl-NaCl溶液清洗两次，最后将其放在4 °0冰箱内保存备用； 所述的磁珠SA-Fe3O4是用链霉亲和素修饰的； 所述的核酸适配体B1-ssDNA是用生物素标记的。2.根据权利要求1所述的制备的一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器用于重金属离子的检测，其特征在于，步骤如下: (1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，将构建的基于核酸适配体的电化学传感器作为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，在10 mL、50 mmol/L、pH 5.80 ~ 8.49的PBS缓冲溶液中进行测试； (2)用差分脉冲伏安法DPV对重金属离子进行检测，设置扫描电位范围为-0.4-0 V，扫速为0.1 V/s，扫描完成后记录峰电流的大小，并保存数据； (3)根据所得的峰电流的大小与重金属离子浓度的关系，绘制工作曲线； (4)将待测水样品溶液代替重金属离子进行检测。3.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述的重金属离子可以是汞离子Hg2+或者银离子Ag +。
【专利摘要】本发明涉及一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法及应用，属于分析化学技术领域。基于核酸适配体中特定碱基与金属离子的特异性结合，涉及不同序列的核酸适配体，显著提高了传感器对金属离子的选择性，适应于检测水质中的汞和银；用于分析汞离子的检测限为0.33 nmol/L，线性范围为1~200 nmol/L。
【IPC分类】G01N27/48
【公开号】CN104931570
【申请号】CN201510305386
【发明人】魏琴, 马洪敏, 闫涛, 吴丹, 范大伟, 庞雪辉, 张勇, 胡丽华, 杜斌
【申请人】济南大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月8日