一种用于mc-lr快速检测的核酸适配体比色传感器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水污染检测与治理领域，涉及一种快速检测微囊藻毒素-LR (MC-LR)的核酸适配体比色传感器的制备方法。
【背景技术】
[0002]微囊藻毒素-LR (MC-LR)是蓝藻菌在富含N、P等元素的富营养化水体内繁殖时释放的一种环状七肽类水环境污染物。MC-LR毒性巨大，主要以肝脏为靶器官，较低浓度的MC-LR即能抑制蛋白质磷酸酯酶PPl和PP2A的活性，引起肝细胞分解、破裂，导致肝细胞功能障碍，对人与动物均表现出有强烈的肝毒性及肿瘤诱导作用；MC-LR具有化学性质稳定，自然条件下难以降解的特点。近年来巢湖、太湖等淡水湖蓝藻频繁爆发，对居民的生活饮用水造成严重污染，因此实现对MC-LR的快速、灵敏检测具有重要的现实意义。
[0003]目前，测定MC-LR的方法主要有高效液相色谱法、质谱法、液-质联用法等，这些方法在分析MC-LR时表现出较高的灵敏度，但方法本身存在样品前处理复杂、仪器价格高昂、分析耗时等缺点。相对地，比色分析方法操作简便、响应迅速，且不需要借助复杂大型的仪器，因此可作为一种简便、实用的分析方法用于检测环境污染物。然而，环境水样往往是多种污染物的混合体系，比色分析方法在分析污染物时无法实现选择性分析检测。因此，构筑基于特异性识别元件的比色传感器，在复杂的水样中实现对MC-LR的检测，具有重要的环境意义。
[0004]核酸适配体(aptamer)是通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)体外筛选得到的一种单链的DNA或者RNA序列，对靶标分子具有极高的亲和力，因此赋予了对靶物质极高的识别能力。此外，核酸适配体还具有合成周期短、合成成本低、稳定性高、易于修饰等优点。因此在本发明中，将特异性识别MC-LR的核酸适配体与比色分析方法结合，实现了对MC-LR的快速、灵敏以及高选择性检测。具体如下:将具有特定碱基序列的核酸适配体溶液和较高浓度的氯化钠溶液加入到金纳米粒子溶胶中。由于核酸适配体对金纳米粒子的保护作用结合较高浓度氯化钠的静电屏蔽作用，金纳米粒子倾向于互相分离。当向上述体系加入MC-LR溶液后，核酸适配体高亲和力特异性结合MC-LR分子，金纳米粒子保护作用被抵消。在较高浓度氯化钠作用下下，金纳米粒子团聚，特征等离子共振吸收峰由521 nm红移至646 nm,溶液颜色由红色变蓝色。利用吸光度比值A646A521的变化与MC-LR浓度之间的关系实现对MC-LR的分析检测。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有检测MC-LR方法的仪器价格昂贵、操作复杂、分析耗时等不足而提供的一种基于特定序列的核酸适配比色传感器的分析方法。利用具特异性识别MC-LR功能的核酸适配体分子作为传感器的识别元件，提高了比色传感器的选择性，增加了比色分析方法的灵敏度。同时，该比色分析方法具有制备简单、响应迅速、操作简便等优点。
[0006]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
通过向制备的金纳米粒子溶胶中加入特定碱基序列的核酸适配体溶液和较高浓度的氯化钠溶液，室温下培育10~20min，构筑得到基于特定碱基序列的核酸适配体比色传感器。该核酸适配体比色传感器以MC-LR为检测对象，通过将不同浓度的MC-LR溶液加入到比色传感器溶液中，室温下培育10~20分钟后，采用紫外-可见分光光度计测定上述混合溶液的紫外-可见吸收光谱。通过测定的吸光度比值A646A521与MC-LR浓度之间的关系可实现对MC-LR的高灵敏度和高选择性分析检测；具体步骤如下:
(O向洁净的三口烧瓶中加入40~60 mL浓度为0.03~0.06 mol/L的氯金酸(HAuCl4)溶液，持续加热至沸腾；磁力搅拌下，将4~6 mL浓度为0.03~0.04 mol/L柠檬酸钠溶液加入到沸腾的HAuCl4S液中，持续20~40分钟后停止加热；待溶液冷却至室温，用0.22 μ m的滤膜过滤得到金纳米粒子溶胶；
(2)向样品管加入400~450 μ L的步骤(I)得到的金纳米粒子溶胶，并分别加入30~40μ L的MC-LR的核酸适配体溶液和20~30 μ L的NaCl溶液，反应10~20分钟后，得到核酸适配体比色传感器；其中，使用的MC-LR的核酸适配体的碱基序列为:
5 ’ -GGCGC-CAAAC-AGGAC-CACCA-TGACA-ATTAC-CCATA-CCACC-TCATT-ATGCC-CCATC-TCCGC-3’。
[0007]本发明制备方法得到的核酸适配体比色传感器应用于MC-LR的检测，具体步骤如下:
将不同浓度的MC-LR标准溶液分别加入到核酸适配体比色传感器溶液中，室温下培育
10-20分钟，用紫外-可见分光光度计分别测定不同样品的紫外-可见吸收光谱。根据吸光度Α646/Α521的比值与MC-LR浓度的对数之间的线性关系建立工作曲线。
[0008]本发明制备方法得到的核酸适配体比色传感器应用于MC-LR的选择性检测，具体步骤如下:
向含有核酸适配体比色传感器的溶液中分别加入MC-LR溶液和50倍MC-LR浓度的干扰物溶液，采用紫外-可见分光光度计测定混合液的紫外-可见吸收光谱。根据加入的MC-LR和干扰物引起的金纳米粒子吸光度比值A646A521的变化实现对MC-LR的选择性分析；其中:所述的干扰物为啶虫脒、草甘膦、敌百虫、四螨嗪或阿特拉津中任一种。
[0009]本发明将操作简便、响应迅速的比色分析技术与对MC-LR具有特异性识别能力的核酸适配体技术相结合，构筑了一个新颖的MC-LR核酸适配体比色传感器。利用特异性识别MC-LR功能的核酸适配体分子作为传感器的识别元件，提高了比色传感器的选择性，增加了比色分析方法的灵敏度。该传感器可同时实现对MC-LR的高灵敏度和高选择性分析检测。与现有MC-LR的检测技术相比，本发明具体以下优点:
(1)与传统分析方法如高效液相色谱法、质谱法相比，本发明中构筑的核酸适配体比色传感器不需要借助复杂大型的仪器、操作简单、灵敏度高、可实现对MC-LR的快速检测；
(2)与现有的生物传感器相比，本发明直接将核酸适配体溶液与金纳米粒子溶胶混合，制备得到核酸适配体比色传感器，该传感器制备简单，具有较高的稳定性和重现性；选取合成成本低、稳定性高、易于修饰等优点的核酸适配体作为传感器的识别元件，提升了比色分析方法的灵敏度和选择性。
【附图说明】
[0010]图1不同浓度的MC-LR的核酸适配体比色传感器溶液的紫外-可见吸收光谱，;插图为MC-LR的核酸适配体碱基序列。
[0011]图2构筑的核酸适配体比色传感器的吸光度比值A646ZA521与MC-LR浓度对数的线性关系图。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0013]实施例1
一种用于MC-LR快速检测的基于特定碱基序列的核酸适配体比色传感器，以金纳米粒子溶胶为基体，通过MC-LR与金纳米粒子竞争结合核酸适配体引起金纳米粒子聚集程度的改变，实现对MC-LR的分析。核酸适配体比色传感器的具体制备步骤如下:
(I)所用玻璃仪器均经过王水浸泡、高纯水清洗干净并烘干待用。制备时，向洁净的三口烧瓶中加入50 mL的浓度为0.05 mol/L的氯金酸(HAuCl4)溶液，持续加热至沸腾；持续搅拌下，将5 ml浓度为0.0388 mol/L柠檬酸钠溶液加入到沸腾的HAuCl4溶液中，反应持续30分钟后停止加