一种检测日本血吸虫卵的核酸适配体及其在制备检测制剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸适配体及其应用，特别是涉及一种可用于日本血吸虫卵及临 床样本组织检测的核酸适配体及其制备检测试剂的应用方法。
【背景技术】
[0002] 血吸虫病一直是一种严重危害人类身体健康和阻碍社会经济发展的重大传染病。 日本血吸虫成虫雌雄合抱寄居在宿主肠系膜静脉，每条雌虫每日产卵约300~3000个，所 产的虫卵沉积于肠壁小血管中，部分随血流进入肝。发育成熟（产出后11天左右）的血吸 虫卵毛蝴分泌物能透过卵壳，破坏血管壁，并造成周围组织炎症坏死，因肠的蠕动、腹内压 增加，致使坏死组织向肠腔溃破，少量虫卵随溃破组织落入肠腔，随粪便排出体外。
[0003] 血吸虫卵在血吸虫病发生发展、疾病传播流行等环节意义重大，主要表现在：一是 血吸虫卵卵壳和其分泌产物均能激发宿主产生强烈的免疫反应而形成虫卵肉芽肿发应以 及随后产生慢性肝（肠）纤维化等临床症状，血吸虫卵被公认为主要致病因子。二是血吸 虫卵从粪便中排出到外界后，在有钉螺的孳生环境中，血吸虫卵内的毛蝴孵化出来，钻入媒 介生物-钉螺体内，在钉螺体内完成其无性生殖生活史阶段，发育成尾蝴，尾蝴在水中感染 人及其它哺乳动物后又能在人体（或其它哺乳动物）内发育成虫并产出虫卵，血吸虫卵在 维系血吸虫病传播流行环节中作用关键。目前诊断日本血吸虫感染的主要途径包括基于血 吸虫卵抗体（或抗原）的血清学检测和从粪便中检测血吸虫卵的病原学方法。
[0004] 因为从粪便中获得血吸虫卵被公认为血吸虫病诊断的金标准（Gold Standard)， 目前检测血吸虫卵的病原学方法有Kato-katz镜检法（WHO推荐方法）和集虫卵孵化法。两 者缺点有耗时长（前者隔夜，后者需4小时以上），漏检率高。现阶段血吸虫病防控需要高 敏感、特异、耗时短、简洁的诊断方法。
[0005] 核酸适配体（nucleic acid aptamer)是从人工合成的随机单链核酸库中筛选出 来的能高亲和性结合靶分子的20-50碱基的寡聚核苷酸，包括DNA适体和RNA适体。适配 体因其结构的多样性而具有靶分子广、亲和力高、特异性强等特点，同时，相比传统抗体，适 配体分子量小、易改造修饰、制备方便且无免疫原性。因此，适配体在基础研宄、临床诊断、 药物研制等方面展现了广阔的应用前景。近年来为研宄者们广泛使用的基于完整细胞的 SELEX核酸适配体筛选技术（CELL-SELEX)可以不需要提前获得细胞表面靶分子的相关信 息并在保持细胞膜表面蛋白天然生理状态直接筛选获得和待测细胞结合的核酸适配体，并 能利用这些适配体对其所结合的细胞表面的靶分子进行表征和检测，有助于发现新的生物 标志物。核酸适配体已经被广泛应用于识别各种靶标分子，发现新的生物标志物。核酸适 配体靶标范围广泛，对寄生虫也有良好的亲合力，核酸适配体能特异识别宿主血液中锥虫、 利什曼原虫，疟原虫等寄生虫病原体，对于开辟新的寄生虫检测方法和治疗策略提供了新 的途径。
[0006] 通过Cell-SELEX技术，我们已成功筛选出能高特异性与血吸虫卵特异性结合的 适配体，因核酸适配体具有以下优点：体外筛选且周期短、容易合成和进行化学修饰、不同 批次之间差异小、稳定性好、可常温运输、免疫原性小和快速的组织穿透能力。因此，血吸虫 卵特异性结合的核酸适配体筛选将为下一步建立新型血吸虫病诊断方法提供依据；并为将 来发展血吸虫病靶向治疗及药物疗效评价手段提供新的思路。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的提供一种高度特异性、稳定性、可用于血吸虫卵的检测及其体内样 本检测的核酸适配体及其制备检测试剂的应用方法。
[0008] -种检测日本血吸虫卵的核酸适配体，为以下序列中的任一条：
[0009] 序列1:核酸适配体LC6:
[0010] 5,-ACGCTCGGATGCCACTACAGTGATAGAATGGTAGTTGAGTAGTTTGTGTATATGTGGGGCCTCATG GACGTGCTGGTGAC-3'
[0011] 序列2 :核酸适配体LC15 :
[0012] 5,-ACGCTCGGATGCCACTACAGTGAGATATAAAGGGCAGAAATAAGTAGGGGCTCATGGACGTGCTGG TGAC-3'。
[0013] 所述的检测日本血吸虫卵的核酸适配体，还可以在保持LC6,LC15下划线部分的 保守核苷酸序列不变的情况下将核酸适配体进行修饰和改造。
[0014] 具体包括以下三种中的任一种：
[0015]a)核酸适配体LC6,LC15下划线部分的保守核苷酸序列不变，不变序列两端的核 苷酸进行删减；
[0016]b)核酸适配体LC6,LC15下划线部分的保守核苷酸序列不变，不变序列两端核苷 酸的碱基进行人工碱基替换；
[0017]c)核酸适配体LC6，LC15连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或者 酶标记。
[0018] 所述的检测日本血吸虫卵的核酸适配体的应用方法，将所述的检测日本血吸虫卵 的核酸适配体用于制备检测日本血吸虫卵的制剂。
[0019] 另一方面，本发明筛选核酸适配体LC6,LC15的方法，包括如下步骤：用血吸虫卵 对核酸文库进行筛选，得到与血吸虫卵特异结合的核酸适配体；所述核酸文库为单链的随 机核苷酸序列的文库；
[0020] (1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：
[0021] 随机核酸文库：
[0022] 5 ' -ACGCTCGGATGCCACTACAG(45N)CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3 '
[0023]上游引物：5'-异硫氰酸荧光素-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3'；
[0024]下游引物：5'-生物素-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3'；
[0025] (2)正筛选：将上述随机核酸文库与血吸虫卵孵育；孵育完成后，收集血吸虫卵； 95°C加热变性分离与血吸虫卵结合的适配体，即为第一次筛选的核酸文库；
[0026] (3)PCR扩增第一次筛选的核酸文库：将步骤（2)中筛选得到的文库进行常规PCR 扩增，得到扩增产物；
[0027] (4)制备DNA单链文库：用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记步骤（3)中的 PCR扩增产物；然后利用2M氢氧化钠使双链DNA变性解链，收集异硫氰酸荧光素标记的DNA单链文库；
[0028] (5)反筛：将步骤⑷所得到的DNA文库与肝吸虫卵孵育，孵育完成后收集肝吸虫 卵孵育后的上清，即排除掉与肝吸虫卵结合的核酸序列；
[0029] (6)正筛：将步骤（5)中所制上清液与血吸虫卵孵育，洗脱结合在血吸虫卵表面的 高亲和力适配体库，即为第二次筛选的核酸文库；
[0030] (7)核酸适配体循环筛选：以步骤（6)所得的核酸文库取代步骤（3)所得到的扩 增产物，并重复步骤（4)~（6)的筛选过程，直到筛选得到与血吸虫卵结合能力强的核酸文 库；
[0031] (8)将筛选获得的最终核酸文库进行高通量测序，确定核酸适配体。
[0032] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过筛选得到的核酸适配体具有比 蛋白抗体更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同 部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存；便于标记等优势。采用本发明的核酸适配体 进行血吸虫卵检测时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适配体的合成成本较抗体制备 成本低，且周期短，重现性好。
【附图说明】
[0033] 图1为Real-time PCR熔解曲线的变化过程：峰形代表原始文库、第1轮筛选产 物、第7轮筛选产物、第9轮筛选产物通过扩增后的熔解曲线；
[0034] 图2为标记异硫氰酸荧光素的核酸适配体（LC15,LC6)与血吸虫卵及反筛肝吸虫 卵结合能力激光共聚焦显微镜分析；
[0035] 在图2中，前三幅图分别为阴性对照核酸适配体（起始文库）、LC6、LC15与血吸虫 卵结合情况的展示，后两幅图分别是LC6、LC15与肝吸虫卵的结合情况的展示；在激光共聚 焦图片中能够明显看出LC6和LC15这两条Aptamer能够很好的富集在血吸虫卵表面，可见 绿色荧光，图片结果表明，LC6与LC15的荧光强度明显高于文库组的荧光强度，而且都不与 肝吸虫卵结合，没有荧光（后两幅图），说明具有很好的特异性；
[0036] 图3为吲哚