一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产生物技术技术领域，具体设及一种提高牙解有丝分裂雌核发育双 单倍体诱导效率的方法。
【背景技术】
[0002] 有丝分裂雌核发育是一种用射线灭活的精子激活卵子，再在特定时期对卵子施W 物理或化学方法抑制其卵裂的特殊生殖方式。通过诱导有丝分裂雌核发育所获得的个体称 为双单倍体，具有基因组完全纯合的特点。双单倍体是极为珍贵的育种基础材料，基于双单 倍体可快速建立纯合克隆系和杂合克隆系。无论纯合克隆系或杂合克隆系，都是进行数量 性状定位、功能基因挖掘W及全基因组测序的最佳材料。模拟实验显示，利用双单倍体进行 全基因组范围的OTL定位，具有比其他交配模式更好的检测能力。
[0003] 在作物上，基于双单倍体所形成的克隆系因其系内整齐一致、无杂合位点等特点， 无论在育种实践还是基础研究中，与经过多代连续自交而产生的系相比具有一定的优越 性。运也成为北美和欧洲商业化育种主要的选系方法。
[0004] 在鱼类上，基于双单倍体的育种研究一直进展缓慢。虽然在一些鱼类上成功的诱 导了双单倍体及克隆系。运个和作物上有较大的差距。究其原因，双单倍体的低诱导效率和 低成活率是众多潜在原因中最为重要的两个。运大大的制约了鱼类育种中双单倍体技术的 应用。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种提高牙解有丝分裂雌核发 育双单倍体诱导效率的方法。本发明通过对诱导有丝分裂雌核发育双单倍体前，先对所用 母本的纯合度进行鉴定，筛选出纯合度高的亲本，再进行诱导，从而提高了诱导效率。
[0006] 本发明所采用的技术方案为:一种提高牙解有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率 的方法，在进行有丝分裂雌核发育诱导之前，先进行纯合度的鉴定和筛选:使用微卫星标记 对母本进行纯合度的鉴定，并筛选母本进行双单倍体的雌核发育诱导。
[0007] 在本发明中，筛选纯合度大于0.2000的母本进行双单倍体的雌核发育诱导。
[000引优选地，利用覆盖牙解24个染色体的24个微卫星标记对雌性亲鱼的纯合度进行鉴 定。
[0009] 本发明中，所使用的微卫星标记，为覆盖牙解24个连锁群(对应牙解24条染色体） 的24个高重组率微卫星标记，使用所述微卫星标记对雌性亲鱼的纯合度进行鉴定，能够得 到更为全面的牙解纯合度数据。
[0010] 所述微卫星标记的重组率均大于0.667。所述重组率是根据所述微卫星标记与着 丝粒之间在第一次减数分裂四分体时期发生交换频率的高低来计算的。理论上来说，如果 不存在交叉干设，微卫星标记与着丝粒之间的重组率最大为0.667。重组率越高，代表发生 交换的频率越高。
[0011] 连锁群序号和对应的微卫星标记的信息见表1
[001 ^ 表1:微卫星标记倍島表
[0015]按照上表从上到下的顺序，发明人提供了符合《专利法》规定的序列表，序列表的 编号从沈Q ID NO: 1~沈Q ID NO:48。
[0016] 优选地，所述提高牙解有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法，包括W下步 骤：
[0017] A、纯合度的鉴定和筛选；
[0018] B、精子和卵子的采集:采集牙解雌鱼卵子和雄性真觸精子；
[0019] C、精子灭活:用Ringer ' S液对精子进行稀释，随后用紫外线进行照射灭活；
[0020] D、人工授精:将卵子和灭活后的精子混匀，并激活解化；
[0021] E、诱导双单倍体:解化完成后，对步骤D中得到的精卵混合物进行静水压处理，处 理结束后，将卵子转移至解化缸解化。
[0022] 在进行传统的有丝分裂雌核发育诱导之前，筛选纯合度高的母本，能够得到更高 的诱导效率，即更高的解化率和更低的崎形率;在诱导解化完成之后，对获得的后代进行纯 合度检验，W验证诱导有丝分裂雌核发育的效果。
[0023] Ringer'S液又被称为林格氏液，一种与哺乳动物的血液和淋己大致等渗的盐溶 液，Ringer's液被广泛应用于组织、细胞和一些低等动物培养或保存。本发明中，林格氏液 为海水鱼用林格氏液。
[0024] 优选的，步骤E诱导双单倍体之后，还包括纯合度检验：用上述微卫星引物对有丝 分裂雌核发育诱导所获得的个体进行纯合度检验。
[0025] 作为一种具体的实施方式，步骤B精子和卵子的采集中，挤压筛选得到的雌性牙 解，将卵子挤入烧杯中，避光保存备用;积压筛选得到的雄性真觸，将精液挤入注射器中，显 微镜检查精子活力，并对精子进行筛选备用。
[00%]优选地，步骤C精子灭活中，用海水鱼用Ringer's液对精子进行稀释，精子和海水 鱼用Ringer's液的质量比为1:40;稀释后用紫外线对精子进行照射，照射剂量为73mJ/cm2; 照射后的精子避光保存，并在显微镜下检查筛选备用。
[0027] 优选地，步骤D人工授精中，将卵子和灭活后的精子混匀，用17°C的过滤海水激活， 并在17 °C的解化箱内解化60min。
[0028] 优选地，步骤E诱导双单倍体中，解化完成后，对步骤D中得到的精卵混合物进行 650kg/cm2的静水压处理6min;处理结束后，将精卵混合物转移至解化缸，流水解化;并统计 受精率和解化率。
[0029] 受精率为原肠期上浮胚胎数占诱导所用总卵数的百分比；
[0030] 解化率为解化仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比。
[0031] 本发明中，采用使用紫外线灭活的真觸精子对牙解卵子进行受精处理，W上参数 是发明人根据所用的实验材料的属性并结合多次试验所作出的最优选择，当然，本领域技 术人员也可根据现有技术采用不同的试验参数，在此就不再寶述。
[0032] 本发明的有益效果为:本发明提供了一种提高牙解有丝分裂雌核发育双单倍体诱 导效率的方法。本发明通过对诱导有丝分裂雌核发育双单倍体前，先对所用母本的纯合度 进行鉴定，筛选出纯合度高的亲本，再进行诱导，从而提高了诱导效率。利用本发明，可W在 牙解上实现有丝分裂雌核发育双单倍体的批量化、规模化诱导，从而为牙解生物学性状的 功能基因挖掘、数量性状控制位点定位W及良种的克隆化奠定坚实基础。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限 于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0034] 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均 可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规 方法。
[0035] 实施例1
[0036] -种提高牙解有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法，包括W下步骤：
[0037] A、纯合度的鉴定和筛选;利用覆盖牙解24个连锁群的24个高重组率微卫星标记对 雌性亲鱼的纯合度进行鉴定，筛选纯合度大于0.2000的母本进行双单倍体的雌核发育诱 导。
[0038] B、精子和卵子的采集：筛选纯合度高的雌性牙解，轻置于软垫上，用毛巾覆盖全 身，W防其拍打软垫，用干毛巾轻轻擦去其生殖孔周围的污物和水，沿生殖腺自鱼体后部向 前轻轻的缓慢挤压，将卵子挤入1000 ml的干净烧杯中，避光保存，备用；筛选处于繁殖盛期 的雄性真觸，用毛巾覆盖全身，用干毛巾轻轻擦去其生殖孔周围的污物和水，沿生殖腺自鱼 体后部向前轻轻的缓慢挤压，将精液挤入5ml的注射器中，显微镜检查精子活力，筛选游动 时间长的精子备用；
[0039] C、精子灭活：用海水鱼用Ringer's液对精子进行稀释，精子和海水鱼用Ringer's 液的质量比为1:40;稀释后用紫外线对精子进行照射，照射剂量为73mJ/cm2;照射后的精子 避光保存，并在显微镜下检查活力，选取游动时间长的精子备用；
[0040] D、人工授精:将卵子和灭活后的精子混匀，用17°C的过滤海水激活，并在17°C的解 化箱内解化60min;
[0041] E、诱导双单倍体:解化完成后，对步骤D中得到的精卵混合物进行650kg/cm2的静 水压处理6min;处理结束后，将精卵混合物转移至解化缸，流水解化;并统计受精率和解化 率。
[0042] 受精率为原肠期上浮胚胎数占诱导所用总卵数的百分比；
[0043] 解化率为解化仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比。
[0044] F、纯合度检验：用微卫星引物对有丝分裂雌核发育诱导所获得的个体进行纯合度 检验。
[0045] 试验例
[0046] 为验证本发明的诱导效率，发明人做了如下试验：
[0047] 本试验例中，分为四组平行实验，四组分别为对照组、实验一组、实验二组和实验 =组，其中对照组不经母本纯合度的鉴定和筛选步骤，直接进行雌核发育诱导，实验组均按 照实施例1中纯合度的鉴定和筛选步骤之后，再进行雌核发育诱导。实验一组采用杂合克隆 做母本、实验二组采用有丝分裂杂合子做母本;实验=组采用减数分裂雌核发育一代做母 本。每个组别统计最终的受精卵、解化率W及检测纯合度，检测结果见表2和表3:
[0048] 表2:受精卵、解化率W及崎形率统计表
[0050] 表3:24对微卫星引物鉴定结果表
[0052] 上表说明：随着母本纯合度的提高，雌核发育双单倍体的诱导效率有上升的趋势 (受精率、解化率上升，后代纯合个体比例上升）。利用本发明所提供的技术方案，能使牙解 有丝分裂雌核发育的诱导更为可行、成功率更高。
[0053] 最后所应说明的是，W上实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，W上所述仅为本发明的具体实施 方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 SEQUENCE LISTING <110>中国水产科学研究院北戴河中也实验站 <120> - -种提高牙解有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法 <]30> 2010
[0054] <1 说> 斗& <170> PatentIn version 33 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> ..'才解（F*ai.aliclithysolivaceus) <400> 1
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[0化引 <2巧> 牙餅（化ralichthys oiiv.ace版） <400> 9 gatctgcaga aacacac 过 Ct Ca 22 <2]0'- 10 <211> 20 <212> DNA <213> 才?钟（化ralichthysolivacwS') <400> IG gc'g 过 gttctt' CCteaaatgC 20 <210> 11 <211> 25 <212> DNA -213之牙即（J，araHchl:hys 〇1 ivaccus) <400> 11 tggaagagat gtgcacttga clgtc 25
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