基于微卫星标记Paraoliva-1的牙鲆基因型检测引物和方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于微卫星标记Paraoliva?1的牙鲆基因型检测引物和方法。首先提取牙鲆肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用牙鲆DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对牙鲆不同地理群或牙鲆群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得牙鲆的遗传多态性图谱。本发明的特点是可快捷的获得牙鲆遗传标记Paraoliva?1的遗传变异图谱，方法简便。
【专利说明】
基于微卫星标记Paraol iva_1的牙鲆基因型检测引物和方法
技术领域
[0001 ] 本发明属于牙鲜(ParaiicAiAjs o2iraceus)DNA分子遗传标记技术，涉及一种检测牙鲜微卫星标记Parao I i va_ I的技术方法，具体是牙鲜微卫星标记Parao I i va_l的基因型检测方法。
【背景技术】
[0002]牙齊(ParaIich thy s olivaceus)属于鱗形目(Pleuronectiformes)、牙鲜科(Paralichthyidae)、牙鲜属(ParaJicAiAjs)，在我国称之为比目鱼(Flatfish, Fluke)，左鲜(Left-eyed flounder)牙片和偏口(Plaice)，是冷水性、底栖的海产名贵经济鱼类。在我国的渤海、黄海以及东海有广泛的分布。牙鲆具有生长快，个体大，繁殖力强，洄游性小，回归性强等特点，特别适宜于在沿海发展增养殖业。我国从80年代开始牙鲆的人工育苗和商品养殖，目前已在海水养殖中占有重要地位。然而，近年来过度捕捞已使其资源量严重衰减，而增养殖业的迅猛发展，也对牙鲜自然群体的遗传本质、种质资源和遗传多样性产生了不可低估的影响。分子标记可以应用于牙鲆的遗传多样性分析、个体识别和系谱认证等方面。虽然同工酶标记、RAH)标记及AFLP标记技术也可以用于研究牙鲆的遗传结构及其遗传多样性，然而由于这些标记都属于显性遗传标记，检测效率不如微卫星标记等共显性标记高。另外，同工酶标记的缺点是多态性低，RAH)标记的稳定性不好，AFLP标记操作繁琐，这些都大大限制了它们的应用。而微卫星序列广泛分布于真核生物基因组中，其特点是种类多，等位基因数目多，多态性高，共显性，孟德尔遗传方式，并随机分布于基因组中，而且微卫星标记检测效率高，结果稳定。当前，虽然牙鲆中已经开发了一些微卫星标记，但他们的缺点是等位基因少，多态性不高，限制了其应用，所以迫切需要获取高多态性的微卫星标记以进行牙鲆遗传多样性、个体识别和系谱认证等方面的研究和应用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种高多态性的牙鲆DNA分子遗传标记技术，即牙鲆微卫星标记Paraoliva-1的快速检测方法，以弥补已有技术的不足。
[0004]本发明的基本构思主要是利用牙鲆DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其两端设计特异性引物并进行PCR检测，从而快速地检测牙鲆每个个体在此微卫星区的遗传变异，获得该引物(微卫星标记Paraoliva-Ι)对牙鲆的多态性图谱，通过图谱直观地检测出每个个体的基因型。基于上述背景现状和实际要求，本发明从牙鲆DNA序列中获取了一个微卫星标记，命名为Paraoliva-1，该微卫星标记Paraoliva-1可用于牙鲆遗传多样性分析和系谱认证。
[0005]本发明是按照以下操作技术方案完成的:首先提取牙鲆肌肉中的基因组DNA并稀释备用;再利用牙鲆基因组DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物;然后使用该引物对牙鲆不同地理群或牙鲆群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定每个个体的基因型，获得牙鲆的遗传多态性图谱。
[0006]提取牙鲆基因组DNA，将其稀释为lOOng/μΙ，每个PCR反应中加入Ιμ?，反应总体积为25μ10
[0007]含有微卫星序列的DNA序列为:
I catcgactct agaggaccgt acagatttga agatggtaga aactcagcac acagccagag61 aacccctagg ggacctgtgg agagaacaaa gcacctcatg gttaggagag ccagagacct121 ctgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt181 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt241 gtcccgaaac ctggagacct gaccctcagc aactttttaa tgctagactg gaggccagat301 gagggagagg gttggtccga ctggtttgta tgatga其中微卫星核心序列为:gtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtParaoliva-1微卫星引物序列为:
正链5’- CATCGACTCTAGAGGACCGTACA -3’，
负链5 ’ - TCATCATACAAACCAGTCGGACCA _3 ’，使用该引物时的退火温度为60 °C。
[0008]微卫星核心序列和引物序列是本发明的核心，在牙鲆遗传多样性检测中呈现多态性。
[0009]PCR扩增的加样参数为:每个PCR反应总体积为25μ1，包括10ng牙鲆基因组DNA; 10X PCR Buffer，2.5μ1 ；Mg2+ 1.5mmol/L ； Tag酶Iu ； dNTP各0.1mmoI/L；上述的引物各1pmol ；加ddH20至25μ1。使用该引物时设置PCR仪的程序参数为:94°C变性2min;94°C30sec，60°C45sec，72°C40sec，该反应进行35个循环;72°C延伸5 min，4°C保存。
[0010]PCR产物的检测步骤:将PCR产物在8%的变性聚丙烯酰胺凝胶中以15W恒功率电泳
1.5小时进行分离。电泳结束后，首先用1 %的冰醋酸溶液浸泡3 O m i η，然后蒸馏水冲洗5min，再以0.1 %的硝酸银溶液浸泡30min，用3 %的碳酸钠溶液显色5min，最后用10 %的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到牙鲆微卫星标记Paraol iva-Ι的多态性图谱。
[00?1]因此，本发明的特点是可快捷的获得牙鲜的Paraoliva-1微卫星标记的遗传变异图谱，方法简便。而且，相对于其它分子遗传标记技术而言，微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，所得结果可直观地检测出牙鲆每个个体的基因型；而应用于不同地理群或牙鲆群内个体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。
【附图说明】
[0012]图1是本发明微卫星标记Paraoliva-1对牙鲆20个个体的检测图谱(编号I一20是牙鲆的20个个体)。
【具体实施方式】
[0013]下面通过实施例详细叙述牙鲆Paraoliva-1微卫星核心序列DNA分子遗传标记技术方法。首先提取牙鲆肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用牙鲆DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物;然后使用该引物对牙鲆不同地理群或牙鲆群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定每个个体的基因型，即获得牙鲆的遗传多态性图谱。
[0014]1、牙鲆基因组DNA的提取:将100μg牙鲆肌肉加入Eppendorf管中，再加入细胞裂解液500μ I和20mg/ml的蛋白酶K 5μ I，轻轻摇匀，37 °C过夜。然后在裂解好的样品中加入600μI酸氯:仿:异戊醇(25: 24:1)混合液，晃动20min后12000rpm离心1min，取上清液。再加入酚:氯仿:异戊醇混合液，重复上述操作3次。再取上清液，加入2倍体积冷却的无水乙醇和I/1体积的3mo I /L的醋酸钠，12000rpm离心I Omi η，弃去上清液，保留DNA沉淀，再用70 %乙醇洗涤该沉淀2次，待乙醇挥发完全后，以TE缓冲液溶解DNA，并稀释为10ng/μΙ，4 V保存。
[0015]2、微卫星引物的设计:在牙鲆DNA序列基础上，利用微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，据此在其两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微卫星DNA序列长度的变化，这是检测微卫星多态性的根源。本发明的微卫星区核心序列两端的特异性引物序列为:正链5’- CATCGACTCTAGAGGACCGTACA _3’，负链5’-TCATCATACAAACCAGTCGGACCA _3 ’，使用该引物时的退火温度为60°C。
[0016]3、PCR扩增:首先加样，加样量如下:牙鲆基因组DNA(100ng/L)，Ιμ?; 10 X PCRBuffer，2.5μ1;Mg2+ (25mmoI/L)，I.5μ1; Taq酶(5uM)，0.2μ1; dNTP(各2.5mmo/L)，Ιμ?;引物(各lOpmol/μΙ)，Ιμ?;加灭菌水至25μ1。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为:94°C变性2min;94°C30sec，60°C45sec，72°C40sec，35个循环；72°C延伸5min，4°C保存。
[0017]4、PCR产物的检测:将PCR产物在8%的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，电泳仪功率为15W，电泳时间为1.5小时左右。电泳结束后，首先用10 %的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馈水冲洗5min，0.1 %的硝酸银溶液浸泡30min，3 %的碳酸钠溶液显色5min，最后用10%的冰醋酸溶液浸泡5min即可得到牙鲆在Paraoliva-1微卫星核心序列的多态性图谱，如图1所示。图1结果表明，牙鲆的20个个体共扩增出22个等位基因，说明微卫星标记Paraoliva-1具有很高的多态性，适合进行牙鲆遗传多样性和遗传结构分析、个体识别和系谱认证等方面的研究和应用。
【主权项】
1.一组利用微卫星标记Paraoliva-1对牙鲆基因型进行检测的引物，其特征在于， 其中所述的引物为序列: 正链5’- CATCGACTCTAGAGGACCGTACA -3’， 负链5 ’ - TCATCATACAAACCAGTCGGACCA _3 ’，使用该引物时的退火温度为60 °C。2.利用微卫星标记Paraoliva-1对牙鲆基因型进行检测的方法，其特征在于，首先提取牙鲆肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用牙鲆DNA序列中含有的微卫星核心序列，使用特异性引物对牙鲆不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定牙鲆不同个体在Paraoliva-1核心序列区的基因型，其中所述的牙鲆微卫星标记Parao Iiva-1即特异性引物为: 正链5’- CATCGACTCTAGAGGACCGTACA -3’， 负链5 ’ - TCATCATACAAACCAGTCGGACCA _3 ’，使用该引物时的退火温度为60 °C。3.利要求2所述的利用微卫星标记Paraoliva-1对牙鲆基因型进行检测的方法，其特征在于，对不同牙鲆个体的基因组DNA进行的PCR扩增，其加样参数为:每个PCR反应总体积为25μ1，包括10ng牙鲆基因组DNA; 10 XPCR Buffer,2.5yl ；Mg2+ 1.5 111111。1/1汀39酶111;(1见130.1mmoI/L;权利要求1中的特异性引物各10 pmol;最后加ddH20至25μ1;设置PCR仪的程序参数为:94°C变性2min;94°C 30sec，60°C 45sec，72°C 40sec，该反应进行35个循环;72°C延伸5 min，4°C保存。4.利要求2所述的利用微卫星标记Paraoliva-1对牙鲆基因型进行检测的方法，其特征在于，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的步骤:将PCR产物在8%的变性聚丙烯酰胺凝胶中以15W恒功率电泳1.5小时进行分离，以10%的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，再以0.1 %的硝酸银溶液浸泡30min，用3 %的碳酸钠溶液显色5min，最后用10%的冰醋酸溶液浸泡5min。5.权利要求2-4所述的方法在牙鲆群体间遗传多态性图谱构建上的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105950727SQ201610332145
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】刘云国, 刘凌霄, 李瑶瑶, 刘传林
【申请人】烟台大学