一种冷冻保存的杂交鲆精子与牙鲆卵子的回交人工授精的方法
【技术领域】
[0001]本发明属海洋生物技术领域，具体的说是一种冷冻保存的杂交鲆精子与牙鲆卵子的回交人工授精的方法。
【背景技术】
[0002]杂交育种是比较容易实施也容易见效的一种育种方法，它利用现有的品种或物种进行杂交，从其后代选育出符合人们需要的基因组合。选择地理远缘的物种作为杂交亲本，可以增加杂交子代的多态性，易于从它们的杂交后代出现多种多样类型，比较容易从中获得符合要求的新类型。牙鲜(Paralichthys olivaceus)和杂交鲜(Paralichthysdentatus)是重要的海水养殖鱼种，分别分布于太平洋和大西洋沿岸，虽然属同一属，但地理分布距离较远。牙鲆(罕)与杂交鲆(? )作为亲本，通过人工授精方法，获得发育、生长正常的杂交子代。杂交子代经过三年培育，人工性腺发育成熟诱导，获得成熟精液，然后与牙鲆进行回交受精，回交子代具备本地牙鲆仔、稚、幼鱼期生长快，又具备幼鱼期后耐高温的特点。因此回交子代在养殖过程中表现出生长快、温度适应范围广，特别是耐高温等优点。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种冷冻保存的杂交鲆精子与牙鲆卵子的回交人工授精的方法。
[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0005]一种冷冻保存的杂交鲆精子与牙鲆卵子的回交人工授精的方法，将采集的杂交鲆精子经超低温冷冻保存，然后将长期超低温冷冻保存的杂交鲆精子经二步水浴解冻，溶解后加入杂交鲆冻精3-5倍体积的稀释液，离心收集沉淀，而后将沉淀与牙鲆卵子进行人工授精；其中，稀释液为NaCl 7g/L和KH2PO4L Og/L和水组成。
[0006]采集繁殖期精子活力85%以上的杂交鲆精子将其与抗冻液按体积比为1:2 — I:3的比例在碎冰中轻轻震荡、充分混匀平衡5-6min ;而后以-10 °C —-20 V /min的降温速率降温至_80°C，然后再以_30°C /min降温速率降至_150°C，置于液氮中进行长期超低温冷冻保存，得到长期超低温冷冻保存的杂交鲆精子。
[0007]所述抗冻液由抗冻剂和稀释液和添加剂组成；其中稀释液由NaCl和KH2PO4和水组成；抗冻剂为丙二醇(PG);添加剂为葡萄糖和海藻糖；抗冻液为NaCl 7g/L、KH2PO4L Og/L,葡萄糖10g/L、海藻糖10g/L，水IL以及上述各成分体积的9-13%的丙二醇(PG)。
[0008]所述二步水浴解是将长期超低温冷冻保存的杂交鲆精子先置于35-37?水浴锅中轻轻摇动90s，然后置于18-20°C的室温下轻轻摇动30s，实现二步水浴解，融解后置于0-4 °C的冰盒中保存。
[0009]将经二步水浴解冻后杂交鲆冻精与稀释液按体积比1:3-5的比例混合，混合后以300g的离心力离心5min-8min，然后去掉上清液，获得与稀释前同样体积的冻精悬液，放置于0-4°C冰盒，待用。
[0010]将上述所得冻精悬液与自然海水按体积比为1:40的比例混匀进行激活，激活后注入牙鲆卵子中，轻轻混匀，使牙鲆卵子与杂交鲆冻精充分接触，静置5-10min ;然后洗卵，用筛絹网过滤，将收集的受精卵放置于新鲜的海水中冲洗3?5次，冲洗后静置，取上浮卵进行孵化。
[0011]本发明所具有如下优点:
[0012]1.本发明采集性成熟杂交鲆雄鱼优质精子经过超低温冷冻保存，然后获得与其同步的牙鲆卵子进行回交进而实现人工授精。其中，杂交鲆精子的超低温冷冻保存技术可以长期保存杂交鲆冻精，随时、随地可以解冻应用。
[0013]2.本发明超低温冷冻保存杂交鲆精子时以9-13%丙二醇(PG)为渗透性抗冻剂，葡萄糖和海藻糖各10g/L作为费渗透性抗冻剂，增加对冻精的保护效果且有效的降低毒性。
[0014]3.本发明超低温冷冻保存杂交鲆精子解冻过程中采用35-37°C和18°C _20°C二步水浴解冻，避免了冻存管周围温度过高对冻精造成的损伤。
[0015]4.本发明冻精在用于人工授精前采用3倍体积稀释液稀释，300g的离心力离心洗脱，减少抗冻剂的毒性对冻精质量的影响同时不破坏精子的结构。
[0016]5.本发明人工授精过程中首先采用一定量海水将冻精激活然后倒入卵子中，海水在激活冻精的同时又可进一步洗脱抗冻剂对精子活力的影响；
[0017]6.本发明人工授精的重复性稳定性好，好冻精解冻后复苏率高，激活后运动率70-80 %，受精率在80-90 %，孵化率80-90 %。
【具体实施方式】
[0018]实施例1
[0019]2014年3月，采集正值杂交鲆生殖盛期的精子，即于日照养殖场鱼培育车间采集杂交鲆精子，并存于干净的离心管中，显微镜检测活力高于90%，置于碎冰上，0-4°C保存NaCl 7g/L 和 KH2PO4L Og/L 和水待用；
[0020]将上述采集的新鲜精子经过按1:2的体积比例与抗冻液混合在碎冰中(O°C )轻轻震荡、充分混匀3min，并分装到2ml冻存管中，而后以20 °C -/min的降温速率降温至-80 °C，然后以-30°C /min降至_150°C，分装到冻存盒，置于液氮容器中，进行长期超低温冷冻保存，保存冻精65管；
[0021]其中，抗冻液由抗冻剂、添加剂和稀释液组成；稀释液为质量浓度7g/L NaCl,1.0g/L KH2PO4和水；抗冻剂为10%的丙二醇(PG)，添加剂为浓度为10g/L的葡萄糖和1g/L海藻糖，即抗冻液为每升水中NaCl 7g，KH2PO4L 0g，萄糖糖10g，海藻糖10g，1mL PG(V/V) O
[0022]首先用蒸馏水配置稀释液，秤取NaCl 7g和KH2PO4L Og然后定容至IL备用；采用已配置的稀释液作为基础液配置抗冻液，其中含10% PG(ViV)(即10mL抗冻液含1mLPG);然后将已配置好的抗冻液作为基础液，加入葡萄糖lg，海藻糖Ig,定容至100mL。
[0023]将上述冷冻保存的杂交鲆冻精解冻采用37°C水浴解冻，将冻存管盒从液氮罐的层架中取出，放置于存有液氮的保温盒中，从冻存