赤芝萜类合酶GL-TS1编码基因cDNA序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体地说，设及赤芝祗类合酶化-TSl编码基因CDNA序 列及其应用。
【背景技术】
[0002] 灵芝为担子菌纲度asidiomycetes)，多孔菌科（Polyproraceae)灵芝属 (Ganoderma)真菌赤芝（GanodermaIucidum)和紫芝（G.sinense)的总称。灵芝作为我国 传统的药用真菌，几千年来一直被用于疾病治疗和养生保健，具有悠久的药用历史。对于灵 芝的药用记载最早出现在两千多年前的《神农本草经》中，目前灵芝已被《美国草药药典与 治疗纲要》（AmericanHerbalPharmacopoeiaandTherapeuticCompendium)收录，其药 用价值已得到世界各国的广泛认可。灵芝中含有多种生物活性物质，截止目前，已有400多 种不同的化合物被鉴定出来，包括150余种祗类化合物、灵芝多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸 等，因此灵芝又被称为"生物活性成分细胞工厂"。现代药理学研究已经证明，灵芝具有多种 重要的医学价值，例如抗肿瘤、降血压、抗病毒W及增强免疫能力等，其在疾病治疗、新药研 发等领域中具有广阔的应用前景。
[0003] 灵芝祗类与灵芝多糖是灵芝药用活性成分的主要组成部分。灵芝祗类中主要活性 成分是灵芝=祗，其他祗类如单祗、倍半祗W及二祗也具有较强的药理活性。运=类祗在灵 芝中的含量极少，并且提取分离困难，化学合成亦面临着巨大挑战。同位素标记实验显示： 灵芝祗类通过甲径戊酸途径（MevalonicAcidPathway，MVP)合成，羊毛酱醇是祗类化合物 和麦角酱醇（真菌细胞膜的重要组分）的共同环状前体，但是目前对于灵芝祗类下游特异 性合成途径的研究还是空白，对于从单一前体羊毛酱醇形成种类繁多的灵芝祗类的分子机 制还不清楚。灵芝祗类生物合成途径相当复杂，参与其中的关键酶、限速酶亦数目繁多。
[0004] 近年来，研究人员已经展开了对灵芝祗类合成的MVP途径中关键酶基因的克隆及 特征描述等相关研究，并取得了显著的进展。化ngmeiLuo等构建了灵芝子实体CDNA文库， 并对其做表达序列标签巧xpressedSequence化g，EST)分析。研究人员从文库中随机抽 取了 1023个克隆，最终获得879条高质量的ESTs,经序列比对后发现运些ESTs与多种已 知功能的基因具有极高的相似度，其中包括编码整締环氧酶（S巧W及法呢基焦憐酸合成 酶（FPPS)的基因。化an曲Ua化ang等从灵芝中分离得到了编码3-径基-3-甲基戊二酸 辅酶A还原酶（HMGR)的基因，并获得了其CDNA全长化及基因组序列全长。HMGR编码基因 的cDNA序列（GenBank编号：EU263989)中开放阅读框（OpenReadingRrame, 0RF)全长为 368化P，编码一条包含1226个氨基酸的多肤链；HMGR编码基因的DNA序列（GenBank编号： EU263990)全长为4262bp，包含7个外显子和6个内含子。此外，DingYX等W及ZhaoMW 等则分别从灵芝中克隆得到了法呢基焦憐酸合成酶（FPP巧编码基因的CDNA序列全长W及 整締合成酶（SQ巧编码基因的CDNA序列全长和基因序列全长。运些基因的获得对后续进 行灵芝祗类生物合成途径的异源构建及表达等相关研究提供了极其宝贵的数据和资料。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的是提供赤芝祗类合酶化-TSl编码基因CDNA序列及其应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的赤芝祗类合酶化-TS1，其为： 阳007] 1)由SeqIDNo. 1所示的氨基酸序列构成的蛋白；或
[0008] 2)SeqIDNo. 1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等 功能的由1)衍生的蛋白。
[0009] 本发明还提供所述赤芝祗类合酶化-TSl的编码基因。
[0010] 本发明还提供所述赤芝祗类合酶化-TSl编码基因CDNA序列，其为：
[0011] i)SeqIDNo. 2所示的核巧酸序列；或
[0012] ii)SeqIDNo. 2所示的核巧酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核巧酸且 表达相同功能蛋白质的核巧酸序列；或
[0013] iii)在严格条件下与SeqIDNo. 2所示序列杂交的核巧酸序列；
[0014] 所述严格条件为在含0. 1 %SDS的0. 1XSS阳或含0. 1 %SDS的0. 1XSSC溶液中， 在65°C下杂交，并用该溶液洗膜。
[0015] 本发明还提供含所述赤芝祗类合酶化-TSl编码基因或所述赤芝祗类合酶化-TSl 编码基因CDNA序列的载体。
[0016] 本发明还提供含所述赤芝祗类合酶化-TSl编码基因或所述赤芝祗类合酶化-TSl 编码基因CDNA序列的宿主细胞、工程菌及转基因细胞系。
[0017] 本发明还提供所述赤芝祗类合酶化-TSl编码基因或所述赤芝祗类合酶化-TSl编 码基因CDNA序列在调控真菌及植物祗类化合物合成中的应用。
[0018] 本发明还提供所述赤芝祗类合酶化-TSl编码基因或所述赤芝祗类合酶化-TSl编 码基因CDNA序列在调控祗类化合物体外合成中的应用。
[0019] 所述应用是W大肠杆菌内源性FPP(法尼基焦憐酸）为底物，通过转化赤芝祗类合 酶化-TSl的编码基因或其CDNA序列，实现在大肠杆菌内异源合成祗类化合物（倍半祗）。
[0020] 本发明还提供用于PCR扩增所述赤芝祗类合酶化-TSl编码基因CDNA序列的特异 性引物对，包括：
[0021] 正向引物：5' -TAAAGGCGGTGTCCGTGAA-3'
[0022] 反向引物：5' -GGGCATTAGTAGGCGTCCAT-3'
[0023] 本发明利用同源序列捜索和结构域捜索的方法，根据灵芝基因组（GenBank编号： AGAX00000000. 1)公开的序列信息，，获得候选祗类合酶基因CDNA序列，使用引物设计软件 LasergenePrimerSelect对该基因序列进行分析，在其开放阅读框（ORF)前后10化P的范 围内寻找最适引物对，最终确定引物序列为：
[0024] 正向引物：5' -TAAAGGCGGTGTCCGTGAA-3' 阳0巧]反向引物：5' -GGGCATTAGTAGGCGTCCAT-3'
[00%] 所述祗类合酶编码基因CDNA克隆方法为：提取赤芝菌丝总RNA，反转录合成cDNA， 利用上述引物对，W赤芝菌丝cDNA为模板进行PCR反应，回收PCR扩增产物与载体链接，转 化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆并测序。
[0027] 本发明提供的赤芝祗类合酶化-TSl的开放阅读框（ORF)长度为116化P(SeqID No. 2)，编码386个氨基酸（SeqIDNo. 1)。将化-TSl全长开放读码框用BLAST程序在 NCBI数据库中进行同源性检索，该基因在氨基酸水平上进行BLASP比对分析显示，赤芝 化-TSl基因编码的蛋白质氨基酸序列与其它物种的同源性较高，其中与已进行功能验证的 Dichomi1:ussqualensLYAD-421SSl(污叉丝孔菌）相似度最高，达 80%。
[0028] 祗类合酶基因是一类WGPP(彼牛儿基焦憐酸）、FPP(法尼基焦憐酸）和GGPP(彼 牛儿基彼牛儿基焦憐酸）为底物，分别催化单祗、倍半祗及二祗生物合成的一类酶家族成 员。本发明的赤芝祗类合酶化-TSl能够催化上述祗类物质的合成，通过W大肠杆菌内源性 FPP为底物，转化赤芝祗类合酶基因GkTS1，从而实现在大肠杆菌内异源合成祗类化合物。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明实施例2中化-TSl基因在赤芝不同组织部位（菌丝mycelia、原基 primordia、子实体fruitingbodies)的表达情况。
[0030] 图2为本发明实施例3中重组质粒祀T28a-GkTSl的PCR鉴定结果；其中，M为 DL5000DNAMaker, 1 为祀T28a-GkTSl重组质粒。
[0031] 图3为本发明实施例3中酶促反应产物的GC-MS分析结果（色谱图）。
[0032] 图4、图5、图6、图7、图8为本发明实施例3中酶促反应产物的GC-MS分析结果 (质谱图）。
【具体实施方式】
[0033] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实 施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&RussellDW， Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0034] 实施例1赤芝祗类合酶化-TSl编码基因CDNA序列的获得
[0035] 1、根据已经测得的灵芝全基因组（GenBank编号：AGAX00000000. 1)数据，通过拼 接、注释等操作，获得候选祗类合酶基因CDNA序列。
[0036] 2、取生长旺盛的灵芝菌丝，使用QiaGenRNeasy?Mini试剂盒进行RNA的提 取，利用逆转录试剂盒（PROMEGA)进行逆转录，对获取的CDNA为模板，使用引物设计软件LasergenePrimerSelect对该候选基因cDNA序列进行分析，在其开放阅读框（ORF)前后 IOObp的范围内寻找最适引物对，最终确定引物序列为：
[0037]正向引物：5' -TAAAGGCGGTGTCCGTGAA-3'
[0038] 反向引物：5' -GGGCATTAGTAGGCGTCCAT-3'
[0039] 引物由北京S博远志生物技术有限责任公司合成。
[0040] 3、琼脂糖凝胶电泳表明约在1000 bp处出现特异片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒 (Takara)回收目标片段，克隆至pGEM-Teasy载体（Promega)中，鉴定阳性克隆并进行测序 验证（北京农业科学院测序中屯、），用于表达载体的构建。
[0041] 实施例2化-TSl基因CDNA序列的生物信息学分析及组织表达分析
[0042] 1、本发明的赤芝祗类合酶化-TSl的开放阅读框（ORF)长度为116ibp(SeqID No. 2)，编码386个氨基酸（SeqIDNo. 1)。将化-TSl全长开放读码框用BLAST程序在 NCBI数据库中进行同源性检索，该基因在氨基酸水平上进行BLASP比对分析显示，赤芝 化-TSl基因编码的蛋白质氨基酸序列与其它物种的同源性较高，其中与已进行功能验证的 Dichomi1:ussqualensLYAD-421SS1(污叉丝孔菌）相似度最高，达 80%。 柳创 2、提取赤芝；个不同生长时期菌丝、原基和子实体的总RNA，利用逆转 录试剂盒（PROMEGA)进行逆转录，W蛋白憐酸酶2A(PP2A)基因为内参基因，进 行巧光定量PCR分析，正向引物为：5 ' -TTCATTTCGCCGCCTCA-3 '，反向引物为： 5' -TGTCCTTGTCGGTGAACTCG-3'，结果表明该基因在菌丝中的表达明显高于其在原基和子 实体期的表达（图1)。
[0044] 实施例3化-TSl基因CDNA序列的原核表达及功能分析
[0045] 1、根据赤芝祗类合酶的全长CDNA序列，设计PCR扩增完整开放阅读框的引物，分 别在正、反向引物上加入限制性酶切位点NdeI和化ndlll。所设计的引物为：
[0046]正向引物：5' -CGCCATATGATGGAACGT-3'
[0047]反向引物：5' -CCCAAGCTTCTACGCGTC-3'
[0048] W全长CDNA片段为模板，经PCR扩增后，保证赤芝祗类合酶基因的阅读框完全正 确，并用NdeI和HindIII内切酶进行酶切反应，回收目的片段116化P;大肠杆菌表达载体 祀T28a用NdeI和HindIII内