切酶进行酶切反应，回收目的片段5化。将经过酶切的赤芝 祗类合酶基因的目的片段克隆至酶切的祀T28a表达载体上，转化大肠杆菌化21，提取重组 子的质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。图2为重组质粒祀T28a-GkTSl的PCR鉴定结果。 W例 2、蛋白表达的诱导及产物分析
[0050] 挑取单克隆接种于3mL的LB液体培养基（含卡那霉素）中，37°C振荡培养至摇 床培养过夜，次日按照1 : 100稀释加入到50mL液体培养基中，继续37°C培养，待ODe。。为 0. 6-1. 0时，加入IPTG至终浓度0. 5mM，28°C诱导目的蛋白表达6-8小时后，50°C水浴，固相 微萃取15min后，手动进样，GC-MS分析催化产物（图3和图4)。所得祗类化合物（根据出 峰时间依次编号A、B、C、D、和E，分别对应质谱图的图4、图5、图6、图7和图8)--倍半祗的 结构如下所示：
[0051]
[0052] 在大肠杆菌内异源合成倍半祗的过程如下：
[0053]
[0054] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可^对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 [00巧]参考文献
[00 己 6] [l]Wachtel-GalorS,TomlinsonB,BenzieIFF.Ganoderma Iucidum( "Lingzhi''），aChinesemedicinalmushroom:biomarkerresponsesina controlledhumansupplementationstudy.BrJNutr，2004,91 :263-269 [00己7] [2]PatersonM民民.Ganoderma-Atherapeuticfungalbiofactory. Phytochemistiy，2006,67 :1985-2001
[00日引 [3]SanodiyaB.S.，ThakurG.S.，BaghelR.K.，PrasadG.B.&Bisen P.S.GanodermaIucidum：apotentpharmacologicalmacrofungus.Curr.Pharm.Biotechnol. ,2009,10 :717-742
[00己9] [4]ShiaoM.S.NaturalproductsofthemedicinalfungusGanoderma Iucidum:occurrence，biologicalactivities，andpharmacologicalfunctions.Chem. 民ec. ,2003,3 :172-180
[0060] [5]BohB.，BerovicM.，ZhangJ. &Zhi-BinL.GanodermaIucidumandits pharmaceuticallyactivecompounds.Biotechnologyannualreview2007,13 :265-301
[0061] [6]YunTK.UpdatefromAsia：Asianstudiesoncancerchemoprevention.Ann NYAcadSci，1999,889 :157-192
[0062] [7]SlivaD.CellularandphysiologicaleffectsofGanoderma Iucidum巧eishi).Mini-RevMedQiem，2004,4 :873-879
[0063] [8]WangSY，HsuML,HsuHC，TzengCH，LeeSS，ShiaoMS,HoCK.Theantitumor effectofGanodermaIucidumismediatedbycytokinesreleasedfromactivated marophagesandtlymphocytes.IhtJCancer，1997,70 :699-705
[0064] [9]LinZB，ZhangHN.Anti-tumorandimmunoreguIatoryactivitiesof GanodermaIucidumanditspossiblemechanisms.ActaPharmacolSin，2004,25 : 1387-1395
[0065] [10]LeeSS，WeiYH，ChenCF,WangSY，ChenKY.Anti-tumoreffectsof Ganodermalucidum.JChinMed，1995,6 :1-12
[0066] [11]ShiL.，RenA.，MuD.&ZhaoM.Currentprogressinthestudyon biosynthesisandregulationofganodericacids.Appl.Microbiol.Biotechnol.， 2010,88 :1243-1251.
[0067] [12]HirotaniM，AsakaI，FuruyaT.Investigationofthebiosynthesisof 3a-hydroxytriterpenoids，g过noderic过cidsT过ndS，by过pplic过tionof过feeding experimentusing[l，2-13划acetate.JChemSocPerkinTrans，1990，l:2751-2754.
[0068] [13]WuQ，So打gJ，SimY，etal.Tra打scriptprofilesofPa打axqui打quefolius fromflower，leafandrootbringnewinsightsintogenesrelatedtoginsenosides biosynthesisandtranscriptionalregulation.PhysiolPlant，2010,138 (2) : 134-149.
[0069] [14]DingYX，Ou-YangX，ShangCH，RenA，ShiL，LiYX，ZhaoMW.Molecular cloning，ch过r过cteriz过tion，过nddifferentialexpressionof过f过rnesyl-diphosph过te synthasegenefromthebasidiomycetousfungusGanodermalucidum.Biosci BiotechnolBiochem，2008,72 :1571-1579.
[0070] [I引RenA.，QinL.，ShiL，DongX.，MuD.S.，LiY.X.&ZhaoM.W.Methyl jasmonateinducesganodericacidbiosynthesisinthebasidiomycetousfungus Ganodermalucidum. 2010,Bioresourcetechnology，101 :6785-6790.
[0071] [16]LeeMH，JeongJH，SeoJK，etal.Enhancedtriterpeneandphytosterol biosynthesisinP过n过xginsengoverexpressingsqu过Ienesynth过segene.PlantCell Physiol, 2004,45(8) :976-984.
[0072] [17]HanJY，InJG，KwonYS，etal.民egulationofginsenosideand phytosterolbiosynthesisbyRNAinterferencesofsqualeneepoxidasegenein Panaxginseng.Phytochenmistry，2010,71(I) :36-46.
[0073] [18]HongmeiLuo?ChaoSun，JingyuanSong，etal.Generationandanalysisof expressedsequencetagsfromacDNAlibraryofthefruitingbodyofGanoderma lucidum. 2010, 5 :9
[0074] [19]ShangCH，ZhuF，LiN，Ou-YangX，ShiL，ZhaoMW，LiYX.Cloningand characterizationofageneencodingHMG-CoAreductasefromGanodermalucidum anditsfunctionalidentificationinyeast.BiosciBiotechnolBiochem，2008,72 : 1333-1339.
[00巧] [20]ZhaoMW，LiangWQ，ZhangDB,WangN，WangCG，PanYJ.Cloningand characterizationofsqualenesynthase(SQS)genefromGanodermalucidum.J MicrobiolBiotechnol，2007,17 :1106-1112.
【主权项】
1. 赤芝萜类合酶GL-TSI，其特征在于，其为： 1) 由Seq ID No. 1所示的氨基酸序列构成的蛋白；或 2. Seq ID No. 1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能 的由1)衍生的蛋白。2. 权利要求1所述赤芝萜类合酶GL-TSl的编码基因。3. 赤芝萜类合酶GL-TSl编码基因cDNA序列，其特征在于，其为： i) Seq ID No. 2所示的核苷酸序列；或 ii) Seq ID No. 2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核昔酸序列；或 iii) 在严格条件下与Seq ID No. 2所示序列杂交的核苷酸序列； 所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0. 1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在 65 °C下杂交，并用该溶液洗膜。4. 含有权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列的载体。5. 含有权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列的宿主细胞。6. 含有权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列的工程菌。7. 权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列在调控真菌及植物 萜类化合物合成中的应用。8. 权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列在调控萜类化合物 体外合成中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，以大肠杆菌内源性FPP为底物，通过转化 赤芝萜类合酶GL-TS1的编码基因或其cDNA序列，实现在大肠杆菌内异源合成萜类化合物。10. 用于PCR扩增权利要求3所述编码基因cDNA序列的特异性引物对，包括： 正向引物：5 ' -TAAAGGCGGTGTCCGTGAA-3 ' 反向引物：5' -GGGCATTAGTAGGCGTCCAT-3'。
【专利摘要】本发明涉及赤芝萜类合酶GL-TS1编码基因cDNA序列及其应用，所述赤芝萜类合酶GL-TS1编码基因的cDNA序列如Seq？ID？No.2所示，编码386个氨基酸。本发明通过赤芝萜类合酶基因GL-TS1转化大肠杆菌，以内源性FPP为底物，实现在大肠杆菌内异源合成萜类化合物。
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/11, C12N15/113, C12N9/88, C12N15/60, C12N15/63
【公开号】CN105154421
【申请号】CN201510563019
【发明人】孙超, 陈士林, 曾欣宜, 王丽芝, 李滢
【申请人】中国医学科学院药用植物研究所
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月8日