专利名称：一种迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗及 其制备和应用。
背景技术：
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)为革兰氏阴性菌，属于爱德华氏菌属。该 菌是一种条件性人/鱼共患病原菌，能够感染人类和多种鱼类，后者包括牙鲆、大菱鲆、真 鲷、罗非鱼等。迟缓爱德华氏菌是世界性鱼类重要病原，每年给水产养殖业造成极大的经济 损失。在我国以及许多其它国家，迟缓爱德华氏菌病防治主要依赖抗生素类药物的使用。然 而，抗生素类药物的大量应用已导致多种不良后果，包括环境污染和耐药菌株的产生等。由 于疫苗具有安全、环境友好等特点，因此已成为公认的病害防控主要方法。目前，由于各种 原因，迟缓爱德华氏菌疫苗大多处于实验室研究阶段，实际应用于产业的疫苗极少。因而， 高效、适于产业化的迟缓爱德华氏菌疫苗亟待开发。发明内容
本发明目的在于提供一种迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗表面展示型疫苗为序列表SEQ ID No. 1中 的碱基序列所示。
迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗的制备方法菌株DH5 α /pSAl的构建以迟缓爱 德华氏菌TXl为模板，采用Fl和Rl为引物进行PCR扩增，PCR产物用NdelAhoI双酶切回 收2. 31Λ，待用；而后将质粒pBT3用NdeIAhoI双酶切回收4. 5kb片段，将回收的两片段 用T4DNA连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α得菌株DH5 α /pSAl,即得表达序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫苗菌株；
所述引物为Fl :5，-GATCATATGGCAGATGGTTTCGTAGTGA-3，和 Rl :5，-AGTACTCTCGAG CCAGGTTTTACCGATATTA-3’。
迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗的应用所述序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列 所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫苗菌株具有抑制迟缓爱德华氏菌的作用。
将所述序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫 苗菌株经LB培养基培养至0D_为0. 8-1后悬浮于PBS缓冲液中至终浓度为lX108cfu/ml， 所得的疫苗制备液具有抑制迟缓爱德华氏菌的作用。
本发明具有如下优点
1.制备简单。本发明的疫苗抗原只需简单的常规细菌培养，无需任何提取、纯化过程。
2.高保护效应。本发明所得疫苗保护效应可达80%以上。
图1为本发明实施例提供的疫苗蛋白于细菌外膜的表面展示图。(其中，Western Blot分析DH5 α /pSAl的外膜蛋白。泳道1，分子量marker ；泳道2，DH5 α /pSAl ；泳道3，阴 性对照(DH5 α /pBT 3)。箭头所指为疫苗蛋白。)具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆 使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)；
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
迟缓爱德华氏菌疫苗，由序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所示(参见序列表1)。
序列表1
ATGGCGATGAMMGTTGCTCTTAGCGTOGCTGCTGITTGGCAGCGCMOOGTATAOGGTGCAGATGGITTOGTAGTGM
MATATTCAITTOGMGGACTGCAGCGGGTOGCOGTOGGTGCGGCGTTACTTMCATGCOGGTAOGCGTAGGCGATAOOG
TCTCTGATGAGGATCTGAGTMTA0CAT00GCGCGCTGTA0GCCA00GGTMCTTTGAGGATGTGCGGGTACTGCGTGAT
GGTMCMTCTGATTGTGCAGCTTMGGMOGCCOGAOGATOGCCAGCAnACCTTCTCTGGCMCMGTCAGTGMGGA
OGAGATGCTAMGCAGMOCTGGAGGCCTCOGGGGTTOGCGTOGGCGAGGCGCTOGATOGCACCAOCTTATOCAGCAnG
MMAGGGCTGGAGGATTTCTACTACAGCGTOGGTMATACMOGCCACOGTGMGGCOGTTCTTACACOGCTGCOGCGC
MT0GCGT0GATCTGMGCTGGTGTTTA00GAGGGTMAT0GGCGCAGATCCAGCAGATTMTAT0GT0GGCMCCATGC
GTTCAGCAGCGC0GAGCTGCTGGGGCACTT0CAGCTGCGCGA0GATGTA00GTGGTGGMCCTGATGGC0GAT0GCMAT
ACCAGMGCAGMGCTGGCOGGCGACCTTGAGGCGCTGCGCAGCTACTATCTGGATOGCGGCTAOGCGCGITTOGCCATT
AMTOGAOGCAGGTGAGCCTGAOGCOGGATMGAMGGGATCTACATCAOCATCMCATCAOOGAMGCGAGCAGTATM
GCTGGAGGGGGTGGA0GTCA00GGCMTATGGC0GGCTACAGCGC0GAGATCA0C0GCTTGACCMGGTAGAGC0GGGTG
AGCTGTATMOGGCGCCMGGTCAOCMGATGGMGATGAGATCMGCAGCTGCTGGGGCGCTATGGCTATGCCTACOOG
TGCGTACAGAOGCAGCOGGAGATCMTGACMGGACMGAOmGTOCTGCACATGMTATOGATGCOGGTMCOGCTA
CTATGTGCGTCAGATCOGCnTGTOGGCMOGACACCAGCAMGAOGCOGTACTGCGCOGTGAGATGCGCCAGATGGMG
GCTCTTGGCTGGGCAGCGACCAGGTOGAGCAGGGGMAGAGCGTCTGMOOGTACOGGTTACnTGAGMOGTOGAOGTG
GAGAOCCAGCGCGTACOOGGTAOGCOGGATCAGCTTGATGTTATCTATMGGTGAMGAGCGTMTAOOGGCAGCTTTM
CTT0GGTAT0GGCTA0GGCA00GAMGCGGCGTCAGCTTCCAGGT0GGGGTGCAGCAGGATMCTGGCTGGGCAC0GGCA
A0GTGGTGGCGATCM0GGCACCMGM0GACTA0CAGA0CTA0GC0GAGCTGT0GCTGAC0GAT00GTACTTTACGGTG
M0GGCGTCAGCCTGGGCGGC0GACTGTTCTATM0GACTTTMGGCCM0GA0GC0GATCTGTCTGACTATA0CMCAG
CAGCTATGGCTTTGA0GGCA0CCTGGGCTT0C0GATCM0GAGMCMCT0GCTGCGCA00GGCCTGGGCTATGTACACA
A0GA0CTGTC0GACATGCAGC0GCAGGTGGCGATGTGGCGCTATCTGCGCT00GTGGGTCAGMT00GAGCGATAGCCAG
0GCGCCAGCTACMGGC0GATGACTATA0CTGGA00GC0GGCTGGGCCTACMCMCCTGGAC0GCGGCTTCTTC00GAC
GGCOGGTAGCMGGCCTOGCTGMOGGTMGATCAOGCTGCOGGGCTOOGACMOGMTACTACMGCTGACnTOGACA
GCCAGAGCTATTTCOOGATCMOCAGGATOGTACCTGGGTGGTGCTGGGAOGTACOOGCCTGGGCTAOGGTMOGGCTTC
GGCGGCMAGAGATGCOCTTCTATGAGMCTTCTAOGCOGGTGGCTCTGGTACOGTAOGCGGCTTOCAGTCCMTMCAT
OGGTOOGMGGCGGTGTAOCTGMOGGCGATGGCAGCGTGGATCAGAGCMGAOOGGCGACMOGAOGCGGTGGGCGGTA
AOGCCATGGCGGTOGCCAGCCTGGAGCTGATCACOCOGAOGCOGTTOGTCAGCGAGCAGTATGCCMCTCTCTGCGCACC
TCOGTCTTTATGGATGCOGGTAOOGTATGGGATAOCMCTGGGATCAGGCOGCCTACOOGAOGCTGCOGGACTACAGCM
GGCGACCMOGTGCGTCTGTOGGCOGGTATOGCGCTGCAGTGGATGTOGCOGCTGGGGCOGCTGGTCTTCTOCTATGCCC
AGCCGGTCAAGAAGTATGAGGGCGATAAGGCGGAGCAGTTCCAGTTTAATATCGGTAAAACCTGGTAA
(a)序列特征
长度2388bp
类型碱基序列
链型单链
拓扑结构线性
(b)分子类型双链DNA
(c)假设否
(d)反义否
(e)最初来源迟缓爱德华氏菌TXl
(f)特异性名称SA1
空间结构分析表明SAl是外膜蛋白，其碱基1-23构成一个信号肽，碱基M-421构 成5个重复性抗原N端可变区(Surf_Ag_VNR)，碱基448-795构成一个细菌表面抗原功能域 (Bac_Surf_Ag)。
实施例2
表面展示型迟缓爱德华氏菌疫苗的构建方法
菌株DH5a/pSAl的构建以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用F1/R1为引物进 行 PCR 扩增，PCR 条件为94°C 60s 预变性模板 DNA，然后 94°C 40s, 50°C 60s, 72°C 60s, 5 个循环后改为94°C 40s, 60°C 60s, 72°C 60s，25个循环后再在72°C延伸反应lOmin。PCR 产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后用NdeIAhoI双酶切回收2. 3kb,待用；而后将质 粒pBT3用NdeIAhoI双酶切回收4. 5kb片段，所述质粒pBT3构建过程参见^iang W，Sun K, Cheng S, Sun L. Characterization of DegQvh, a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain. Appl Environ Microbiol 2008 ； 74 :6254 62.；将上述回收两片段用T4DNA连接酶于室温连接2_4小时，连接液转化大肠杆 菌DH5 α后在含有100ug/ml Ap的LB固体培养基上培养M小时，挑取1个转化子，命名为 DH5a/pSAl。将DH5 a/pSAl在含有100ug/ml Ap的LB培养基中过夜培养，提取质粒，用 引物 F2 (5，-ACGGTGCAGATGGTTTCGTAG-3，)测序，结果表明 DH5 a /pSAl 含有序列表 SEQ ID No. 1中迟缓爱德华氏菌疫苗碱基序列。Western Blot分析(具体方法参见^iang W，Sun K, Cheng S, Sun L. Characterization OfDegQvh, a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain. Appl Environ Microbiol 2008 ； 74 :6254 62.)表明，DH5 α /pSAl中具序列表SEQ ID No. 1中迟缓爱德华氏菌疫苗碱基序列的疫苗蛋白展示在细胞表面(图1)。
所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠， 97. 5%蒸馏水；所述菌株TXl保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2330，分类命名为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。
所述引物为Fl :5，-GATCATATGGCAGATGGTTTCGTAGTGA-3，和 Rl :5，-AGTACTCTCGAG CCAGGTTTTACCGATATTA-3’。
实施例3
迟缓爱德华氏菌疫苗的应用
步骤1)疫苗制备液以及疫苗对照液的制备。将上述所得疫苗表达菌株DH5 α/ PSAl在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；取0. Iml过夜后的培养液，将其加 入IOml新鲜的含Ap (50ug/ml)的LB液体培养基中，于37°C下转速ISOrpm摇动培养至0D_ 为0. 8-1，而后将培养液离心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为 lxl08cfu/ml,即为疫苗制备液。
所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl,0. 02 % KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12H20,0. 024% NaH2P04。
步骤2~)疫苗的免疫注射。将50条牙鲆(每条重约9. Ig)随机分为2组，每组25 条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤1)疫苗制 备液，将B组的每条鱼分别腹腔注射lOOulPBS。
步骤3)迟缓爱德华氏菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养迟缓爱德华氏菌 TXl至OD600为0. 7，然后离心(5000g, 4°C，IOmin)。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度 为lxl07cfu/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液。
步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤幻免疫注射后的第60天，用上述步骤 3)的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤幻的A和B组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在 以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A 组，4条；B组，M条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)
RPS = 100x(l-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)
由此得出DH5 α /pSAl中具序列表SEQ ID No. 1中迟缓爱德华氏菌疫苗碱基序列 的疫苗蛋白针对迟缓爱德华氏菌的免疫保护效率为83. 3%。
因此，DH5 α /pSAl中具序列表SEQ ID No. 1中迟缓爱德华氏菌疫苗碱基序列的疫 苗蛋白能够高效地保护牙鲆抵御迟缓爱德华氏菌侵染。
权利要求
1.一种迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗，其特征在于表面展示型疫苗为序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所示。
2.—种权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗的制备方法，其特征在于 菌株DH5 α /pSAl的构建以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用Fl和Rl为引物进行PCR扩 增，PCR产物用NdeIAhoI双酶切回收2. 31Λ，待用；而后将质粒pBT3用NdelAhoI双酶切 回收4. 51Λ片段，将回收的两片段用T4DNA连接，连接液转化入大肠杆菌DH5得菌株DH5 α / pSAl，即得表达序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫 苗菌株；所述引物为 Fl :5，-GATCATATGGCAGATGGTTTCGTAGTGA-3，和 Rl :5，-AGTACTCTCGAGCCAG GTTTTACCGATATTA-3，。
3.—种权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗的应用，其特征在于所述 序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫苗菌株具有抑制 迟缓爱德华氏菌的作用。
4.按权利要求3所述的迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗的应用，其特征在于将所述 序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫苗菌株经LB培 养基培养至0D_为0. 8-1后悬浮于PBS缓冲液中至终浓度为lX108cfu/ml，所得的疫苗制 备液具有抑制迟缓爱德华氏菌的作用。
全文摘要
本发明涉及分子免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌表面展示型疫苗及其制备和应用。表面展示型疫苗为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。制备方法以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物F1/R1进行PCR；PCR产物与质粒pBT3连接，连接液转化大肠杆菌，即为即得表达序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫苗菌株。所述序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所编码的迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的疫苗菌株具有抑制迟缓爱德华氏菌的作用。本发明所得疫苗的制备非常简单，无需任何提取、纯化、灭活过程，并且在使用中无需任何佐剂。
文档编号C12N15/31GK102028940SQ20101055240
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者孙云, 孙黎 申请人:中国科学院海洋研究所