专利名称：一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种猪口蹄疫苗用的佐剂及其制造方法，更具体地说，涉及一种利用 基因工程技术生产的复合分子型佐剂，以及猪口蹄疫病毒灭活抗原疫苗与这种佐剂配伍而 成猪口蹄疫苗组合物。本发明的这种佐剂是由CpG基序和猪IFN-Y基因克隆入真核表达 载体构成。
背景技术：
自从上世纪20年代以来，许多物质被尝试作为免疫佐剂，但只有铝胶获得了人类 疫苗佐剂的许可，并大量用于动物疫苗。它作为抗原的储存库和载体，缓慢释放抗原延长诱 导机体的体液免疫反应，但缺点是仅诱导Th2体液免疫反应，抗体以IgGl型为主，无TCL反 应；油佐剂和弗氏完全佐剂虽能明显提高免疫应答能力，但在实际应用中常出现不良反应， 如注射部位肿胀、疼痛、发烧，或发生过敏等，仅限用于实验室内动物试验；206佐剂是目前 商品化的高效动物疫苗油佐剂，已广泛使用于动物疫苗中，实践证实是可靠的、有效的和安 全的，但需要进口，价格较高。CpG基序已经报道的有三种类型(Klinman，et al，2004)。传统的CpG ODN也叫做 K型CpG ODN或是B型CpG 0DN，可以活化B细胞和诱导巨噬细胞产生细胞因子。D型CpG 0DN,也叫做A型CpG，其活化B细胞与巨噬细胞能力较弱，但具有较强的诱导浆细胞样树突 状细胞产生I型干扰素的能力。C型CpG ODN可以诱生I型干扰素，以及活化B细胞等功能。 它由多个CpG基序重复的硫代磷酸骨架和5’端的TCG 二聚体所组成。CpG基序能够刺激机 体的免疫系统产生免疫应答，主要是由于免疫细胞具有能够识别CpG基序的受体结构。目 前CpG ODN在免疫增强效应方面的研究已取得了一定的进展。非甲基化CpG基序的免疫 增强作用已被许多研究所证实，含非甲基化的CpG寡核苷酸序列(简称CpG 0DN)能使B、 T细胞激活，同时增强机体的特异性细胞免疫和体液免疫，它能诱导强烈的Thl型反应，以 IgG2a型为主，有TCL反应，同时能与铝胶等其他佐剂配伍使用，有较好的协同作用(Risini D. W, M J. McCluskie, Yu Xu, et al. CpG DNA induces stronger immune responses with less toxicity than other adjuvant. Vaccine, 2000,18 :1755_1762)。中国发明专利200410033878. 1公开的一种新型免疫佐剂，其主要成分是从卡介 苗菌中提取的CpG-DNA，其为富含CpG基序的DNA。该佐剂为免疫刺激型佐剂，本身具有免 疫活性作用，在体内诱导的是Thl型免疫应答，可作为治疗与预防用疫苗佐剂。中国发明专利200310106226. 1公开的能促进畜禽疫苗效价的用作 畜禽疫苗佐剂的CpG DNA的基因工程重组体，该基因工程重组体是根据由 序列为5' -GGTGCATCGATGCAGGGGGG-3'、5' -GGTGCGTCGATGCAGGGGGG-3'及 5，-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT—3，串联而成的D 19D282006目的片段DNA的序列，合成其 寡核苷酸正链和负链，在合成的寡核苷酸末端加上能与线形载体末端相匹配的碱基序列， 然后将此寡核苷酸片段、退火缓冲液、及无菌重蒸水混合后，于90°C 100°C水浴中孵浴3 分钟以上，自然冷却至室温，形成含D19D282006序列的DNA片段，此后将此DNA片段插入线性载体的相应的酶切位点，最后，将其转化感受态大肠杆菌而得到的基因工程重组体。IFN- Y是由Thl细胞和NK细胞分泌的多功能细胞因子，具有广谱的抗病毒活性， 对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用。发现IFN除具有抗病毒、抗肿瘤活性以 外，还有强大的免疫调节活性，通过刺激细胞表达MHC I类分子和II类分子增强免疫反应。 近年来，随着研究的深入，人们发现以重组IFN-Y为疫苗佐剂，不仅能特异性的增强疫苗 的免疫效果，而且可增强机体抗感染的能力。Schijns等用IFN-Y对狂犬病灭活苗免疫 的增强效果，结果表明IFN-Y对该疫苗免疫佐剂作用相当，可使疫苗达到50%保护的稀释 倍数提高50倍，当标准疫苗做1 10000稀释时，仍可有效提高机体免疫保护力(Schijns VECJ, 1994)。Virgil等(2002)用狂犬病毒和杯状病毒与表达猫IFN- γ的重组杆状病毒免 疫猫，结果发现IFN-Y可促进抗体的产生，增强抗原的特异性抗体水平，人IFN-Y作为乙 肝疫苗佐剂也能增强抗体的水平。中国发明专利200510119720.0公开的一种猪疫苗使用的基因佐剂，其特征在于 重组表达质粒中含有猪Y-干扰素基因(PlFN-Y)，在动物细胞中表达后发挥免疫增强作 用。但这种佐剂的免疫增强作用类型单一、程度有限，成本相对较高。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足，有更高安全性和高效、廉价的猪口蹄疫苗 用的复合分子型佐剂，以及这种佐剂的制造方法，同时提供一种使用这种佐剂的猪口蹄疫 苗组合物。本发明的这种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂是由CpG基序和猪IFN-Y基因克 隆入真核表达载体构成的重组质粒。本发明的猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，其CpG基序为至少由3个GTCGTT、2个 GACGTT和1个AACGTT特殊序列构成的一段基序，其序列为SEQ No :1，用其构建的PcDNA3. 1 重组质粒，并在大肠杆菌中增殖。本发明的猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂是由CpG基序构建的重组质粒，其序列 为 SEQ No :2ο本发明的猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，所用的猪IFN-Y基因为含信号肽的 序列，其序列为SEQ No :3，用其构建的PcDNA3. 1重组表达质粒，使IFN-γ基因处在启动子 的下游、CpG序列的上游，并能在哺乳动物细胞中表达。本发明的猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂的制备方法是人工设计、合成一段基本 骨架由3个GTCGTT、2个GACGTT和1个AACGTT所构成的CpG基序以及其配对序列，同时在 其5’端分别设计EcoRI和Xhol酶切位点的部分碱基，并使其成为双链DNA，通过基因重组 方法构建到经EcoRI和Xhol酶切的真核表达载体中，获得含CpG基序的重组质粒；然后利 用猪 IFN-Y 特异引物上游引物5，端CCCAAGCTTACAATGGGTTATACAACTACTTATTTCT Hid III ；下游 5，端GGAATTCTTATTTTGATGCTCTCTGGCCT EcoR I，在 pGEM-Teasy-pIFN-γ 重组 质粒，参见“猪IFN-Y基因的克隆与序列分析”窦永喜、景志忠等，《中国兽医科技》2003， 33(9) :11_15，上克隆pIFN-γ基因片段扩增获得IFN-γ基因，再分别将含CpG基序的重组 质粒和IFN- γ基因经相应的酶切后连接，得到PcDNA-pIFN- y -CpG DNA重组质粒。本发明的猪口蹄疫苗用复合分子型佐剂制备方法中，首先将构建的PcDNA-pIFN- y -CpG DNA重组质粒转化到大肠杆菌，再用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，提 取重组质粒测序鉴定后，选择高拷贝的阳性菌株，接种到含氨苄的LB培养基中大量增殖， 扩增PcDNA-pIFN- y -CpG DNA重组质粒，用SDS碱裂解法大量提取重组质粒DNA。本发明的猪口蹄疫苗组合物是用猪口蹄疫病毒灭活抗原疫苗与前述的佐剂配伍 而成。本发明有如下优点本发明的猪口蹄疫苗用pIFN-Y-CpG的复合分子DNA新型 佐剂，其中既含有具有免疫刺激活性的未甲基化CpG基序，也含有可在动物细胞内表达的 IFN-Y基因，这保证了 PlFN-γ-CpG重组表达质粒可分别发挥其佐剂分子的各自功能—— 非特异性的免疫刺激作用，且使其二者通过协同作用发挥更有效的激起机体的免疫应答； 而且这种复合分子佐剂的重组表达质粒可在大肠杆菌等原核宿主菌中简单易行地得到扩 增和大量提取，其制备成本较低；该方法制备的PlFN-γ-CpG DNA新型佐剂含量可达2. 5 4. Og/L,纯度可达 1. 78 1. 85 (0D260/0D280)。pIFN- y -CpG重组质粒的复合分子DNA新型疫苗佐剂具有明显的免疫增强效果 具体表现在(1)能增强小鼠抗口蹄疫灭活抗原免疫反应，同时具有较高的体液免疫和细胞 免疫即Thl反应。实验表明，本发明用PlFN- γ和CpG基序复合分子的重组DNA质粒能诱 导显著高于(p<0.01)pcDNA-CpG+Ag组(单一 CpG基序成分)的中和抗体水平，能够促进 T淋巴细胞的增殖可达6. 28%显著高于其它组(P < 0. 01)，而且能够促进⑶8+T淋巴细胞 增殖可达31. 61%，与其它组相比差异极显著(ρ <0.01)。(2)能明显增强猪口蹄疫灭活 疫苗的免疫效果，其免疫后21天的抗体滴度可达144，是标准疫苗(普通商品疫苗)的2. 5 倍以上。(3)具有使用剂量小、毒性低的特性。20 μ g pIFN-γ-CpG DNA的小鼠免疫剂量可 达到比铝胶、206佐剂标准剂量更好的免疫效果，在IOOOyg剂量也未发现对小鼠的毒副作 用。
图1表明了 pcDNA-pIFN-Y-CpG重组质粒对猪口蹄疫病毒灭活抗原疫苗免疫小 鼠的抗体滴度增强效果。在图1中TE代表接种不含抗原的疫苗稀释液免疫组；Ag代表猪 亚洲I型口蹄疫灭活抗原疫苗组；pcDNA+Ag代表空质粒加抗原免疫组；pcDNA-CpG+Ag代表 pcDNA-CpG 重组质粒加抗原免疫组；pcDNA-pIFN- y -CpG+Ag 代表 pcDNA-pIFN- y -CpG 重组 质粒加抗原免疫组。纵轴代表阻断ELISA法检测的抗体滴度值，横轴代表免疫后的天数。图2是流式细胞仪检测小鼠淋巴细胞增殖反应图。以说明pcDNA-p IFN-γ-CpG 重组质粒对猪口蹄疫病毒灭活抗原免疫小鼠后增强脾淋巴细胞增殖效果。图2中TE、Ag、 pcDNA+Ag, pcDNA-CpG+Ag、pcDNA-pIFN-γ-CpG+Ag 所代表试验组与图 1 的相同；ConA 代表 阳性对照组，纵轴代表小鼠脾淋巴细胞增殖的百分数，横轴代表不同的试验组别。图3为小鼠体内特异性CTL活性检测，检测pcDNA-pIFN-Y-CpG重组质粒对猪口 蹄疫病毒灭活抗原疫苗免疫小鼠后增强体内特异性CTL杀伤反应。其组别与图1相同，纵 轴代表体内脾细胞裂解的百分数，横轴代表免疫的组别。图4是小鼠IFN-Y的分泌水平，表明了本发明的pcDNA-pIFN-Y-CpG重组质粒对 猪口蹄疫病毒灭活抗原疫苗免疫小鼠后体内促进IFN-Y含量分泌情况。图中mative代 表正常细胞组，positive代表利用PMA刺激的阳性对照这组，irrelevant代表与实验不相
5关的蛋白BSA刺激细胞组，其它组别与图3相同。横坐标代表组别，纵坐标代表IFN-Y分 泌的含量。图5小鼠IL-6的分泌水平，表明了本发明的pcDNA-pIFN- y -CpG重组质粒对猪 口蹄疫病毒灭活抗原的免疫小鼠后促进体内细胞因子含量IL-6的分泌。图中mative， positive, irrelevant与图4中代表的组别相同；横坐标代表组别，纵坐标代表IL-6的含量。图6为pcDNA-pIFN- y -CpG重组质粒对猪口蹄疫病毒灭活抗原疫苗免疫猪的 抗体滴度增强效果图。图中CPG/pc代表pcDNA-CpG质粒免疫组；pIFN-Y-CpG/pc代表 pcDNA-pIFN- y -CpG质粒免疫组；横坐标代表免疫天数，纵坐标代表抗体的滴度。
具体实施例方式本发明以下结合实施例作进一步详述含有猪Y-干扰素基因(PlFN-Y)及人工筛选的CpG序列的重组质粒 pcDNA-pIFN- y -CpG 的构建1、PcDNA3. I-CPG-IFN-γ复合分子引物的合成根据所用载体的特性，依据已获 得的PlFN-γ全基因序列(SEQ No 3)设计引物，用DNAStar软件设计1对引物，并在不同 引物的序列前加酶切位点，引物如下ρIFN-γ 引物(SEQ No 5 和 SEQ No 6)上游5 端CCC AAG CTT ACA ATG GGTTATACAACTACTTATTTCT Hid III下游5 端G GAATTC TTATT TTGATG CTC TCT GGC CT EcoR I2PcDNA3. I-CpG重组质粒的构建CpG基序序列的重组克隆人工合成的基本骨架由3个GTCGTT、2个GACGTT和1个 AACGTT 所构成的 CpG 基序，并其 5，端加入 EcoRI S卩(5，AATTCTCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTTT CGACGTTTGACGTTTAACGTTTC3，(SEQ No 1)同时合成其配对序列并在5，端加入Xhol部分碱 基，采用控温变性、复性技术使其成为双链DNA;再经基因工程重组技术，将其定向克隆入 经EcoRI和Xhol双酶切PcDNA3. 1载体，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用氨苄青霉素抗 性筛选阳性克隆，提取质粒测序鉴定，确认将含有CpG基序序列克隆到质粒载体中，及获得 PcDNA-CpG重组质粒，其序列为SEQ No :2。SEQ No 2 -TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGACGTTTGACGTTTAACGTTTC-3、3pcDNA-pIFN- y -CpG 重组质粒的构建3. IpIFN-Y基因片段扩增利用所设计的pIFN- γ引物，从先前构建的pGEM-T easy-pIFN- γ重组质粒上 克隆pIFN-γ基因片段，扩增体系为pGEM-T easy-pIFN-y 1 μ 1，上、下游引物(50pmol/ μ 1) (SEQ No :5禾口 SEQ No :6)，各 1μ 1, IOXPCR buffer (Mg2+free) 5 μ l,25mM MgCl2 3 μ 1， 2. 5mM dNTP Mixture 2 μ 1，1 μ 1 (5U/ μ 1) Taq DNA 聚合酶，菌双蒸水加至 50 μ 1。PCR 反应 条件为95°C预变性 5min 后，进行 35 个循环(94°C lmin,50°C 30s, 72°C 5min)，最后 72°C 延伸5min。扩增完成后，取PCR产物5 μ 1用1. 2%琼脂糖凝胶(含0. 5 μ g/ml溴化乙锭， EB)电泳分析，扩增到一条大小约501bp的CPG片段，产物经DNA凝胶快速回收试剂盒纯化回收，得到猪IFN-Y，即SEQ No :3οSEQNo ,3
ATGAGTTATACAACTTATTTCTTAGCTTTTCAGCTTTGCGTGACT45
TTGTGTTTTTCTGGCTCTTACTGCCAGGCGCCCTTTTTTAAAGAA90
ATAACGATCCTAAAGGACTATTTTAATGCAAGTACCTCAGATGTA135
CCTAATGGTGGACCTCTTTTCTTAGAAATTTTGAAGAATTGGAAA180
GAGGAGAGTGACAAAAAAATAATTCAGAGCCAAATTGTCTCCTTC225
TACTTCAAATTCTTTGAAATCTTCAAAGATAACCAGGCCATTCAA270
AGGAGCATGGATGTGATCAAGCAAGACATGTTTCAGAGGTTCCTA315
AATGGTAGCTCTGGGAAACTGAATGACTTCGAAAAGCTGATTAAA360
ATTCCGGTAGATAATCTGCAGATCCAGCGCAAAGCCATCAGTGAA405
CTCATCAAAGTGATGAATGATCTGTCACCAAGATCTAACCTAAGA450
AAGCGGAAGAGAAGTCAGACTATGTTCCAAGGCCAGAGAGCATCA495
AAATAA5013. 2PcDNA3. I-IFN- y -CPG 重组质粒的构建将含有CpG基序的PcDNA3. I-CpG重组质粒和pIFN- γ目的片段利用Hid III/ EcoRI双酶切，用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收后连接，连接体系同上，连接产物 转入大肠杆菌JM109感受态细胞)。用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，提取质粒测序鉴定， 确认将含有PlFN-γ序列克隆到PcDNA3. I-CPG质粒载体中，转变为pIFN-γ-CpG DNA重组 质粒形式，其序列为SEQ No :4。SEQ No 4
ATGGGTTATACAACTTATTTCTTAGCTTTTCAGCTTTGCGTGACTTTGTGTTTTTCTGGC60
TCTTACTGCCAGGCGCCCTTTTTTAAAGAAATAACGATCCTAAAGGACTATTTTAATGCA120
AGTACCTCAGATGTACCTAATGGTGGACCTCTTTTCTTAGAAATTTTGAAGAATTGGAAA180
GAGGAGAGTGACAAAAAAATAATTCAGAGCCAAATTGTCTCCTTCTACTTCAAATTCTTT240
GAAATCTTCAAAGATAACCAGGCCATTCAAAGGAGCATGGATGTGATCAAGCAAGACATG300
TTTCAGAGGTTCCTAAATGGTAGCTCTGGGAAACTGAATGACTTCGAAAAGCTGATTAAA360
ATTCCGGTAGATAATCTGCAGATCCAGCGCAAAGCCATCAGTGAACTCATCAAAGTGATG420
AATGATCTGTCACCAAGATCTAACCTAAGAAAGCGGAAGAGAAGTCAGACTATGTTCCAA480
GGCCAGAGAGCATCAAAATAAGAATTCTCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGACGTTTG540
ACGTTTAACGTTTC554
4、pIFN- y -CpG DNA质粒的大量扩增、提取和纯化
选择高拷贝的阳性菌株，接种到IOOOml含氨苄的LB培养基中，在摇床中220rpm37°C培养12 14小时后，用SDS碱裂解法大量提取重组质粒DNA。粗提取的质粒经5M冰
冷的LiCl分离后，其上清用等体积异丙醇沉淀，再用70%乙醇洗涤沉淀，离心除去上清；将 沉淀用含RNase的TE buffer溶解，室温处理30分钟后，再用酚氯仿抽提2次，2倍无水 乙醇沉淀离心；用Iml灭菌水溶解沉淀后，加入0. 5ml PEG-MgCl2溶液(30mM MgCl2中加入 40% PEG 8000)，充分混勻后放置15分钟，13000rpm离心20分钟，沉淀用70%的乙醇洗涤 2次，再用TE buffer或无菌水溶解沉淀，用核酸蛋白检测仪测定其含量和纯度，4°C保存备
7用。本发明的佐剂，由于原核大肠杆菌在DNA复制时没有甲基化修饰功能，故外源的目的重 组表达质粒在复制增殖时不会被甲基化，而真核细胞的DNA复制时具有甲基化修饰功能， 因此，不能用真核细胞增殖目的质粒。由于在设计构建PcDNA-pIFN-Y-CpG DNA时，专门将 IFN-Y基因放在质粒启动子的下游、CpG序列的上游，并在其序列末端加了表达终止密码 子，使IFN- γ表达后，不再使下游的序列表达，因此CpG序列不表达。5、pIFN- y -CpG DNA质粒新型佐剂的免疫增强效果与毒副作用试验将经大量扩增、提取和纯化所得的pIFN- y -CpG DNA质粒在小鼠、猪体上进行重要 疫病疫苗的配伍试验，确定其免疫效应。1)将提取纯化的pIFN- y -CpG DNA质粒100 μ g单独作为亚洲I型口蹄疫灭活抗 原的佐剂，制备疫苗免疫小鼠，用间接血凝和液相阻断ELISA法检测其抗体滴度，并在加强 免疫后第4周处死小鼠，制备脾细胞，利用流式细胞仪检测脾淋巴细胞增殖反应及CD4+和 CD8+细胞的变化，在加强免疫后第二周，利用流式细胞仪检测体内CTL杀伤反应，其结果参 见图1。图1结果分析表明pIFN-Y-CpG DNA能增强小鼠抗亚洲I型口蹄疫抗原的体液免 疫和细胞免疫应答。实验表明本发明的佐剂PlFN-γ-CpG DNA诱导的抗体水平较高，而且 由图1还可见pcDNA-pIFN- y -CpG重组质粒免疫组的抗体滴度远高于其它各组。本发明的pIFN- y -CPG DNA引起较强的T细胞的增殖情况和细胞毒T淋巴细胞反 应参见图2和图3。图2表明pcDNA-pIFN- y -CpG+Ag组淋巴细胞增殖率显著高于对照组和空质粒加 抗原组(P < 0. 05)。图3表明pcDNA-pIFN- y -CpG+Ag组杀伤率为65. 42%而抗原组和pcDNA+Ag杀伤 率分别为20%、20. 01%差异极其显著(ρ < 0. 01)，说明本发明的重组质粒作为佐剂能够显 著增强细胞免疫反应。由以上试验表明，本发明用pIFN-γ和CpG基序复合分子的重组DNA质粒能诱导 显著高于(P < 0. 01)pcDNA-CpG+Ag组(单一 CpG基序成分)的中和抗体水平，能够促进T 淋巴细胞的增殖可达6. 28%显著高于其它组(P < 0. 01)，而且能够促进⑶8+T淋巴细胞增 殖可达31. 61%，与其它组相比差异极显著(ρ < 0. 01)。由图4可见pcDNA-pIFN- y -CpG组IFN- γ分泌水平显著高于抗原组和 pcDNA+Ag (ρ < 0. 05)，其能够促进该细胞因子的分泌。实验还表明本发明的佐剂能够促进细胞因子IL-6的分泌，参见图5。图5表明 pcDNA-pIFN- y -CpG组IFN- γ分泌水平显著高于抗原组和pcDNA+Ag (ρ < 0. 05)，说明其能 够促进该细胞因子的分泌。将提取纯化的pIFN- y -CpG DNA质粒与猪Asia I型口蹄疫灭活抗原疫苗(普 通商品苗)配伍后共同免疫试验猪，同时用该商品疫苗作为阳性标准疫苗，用间接血凝和 液相阻断ELISA法检测其抗体滴度，具体应用时以IOOyg质粒和100 μ 1疫苗配伍，用此 “疫苗”免疫后21天经检测抗体滴度可达1 144，参见图6，显示出本发明的复合分子佐 剂有较强的免疫增强作用，表明本发明能明显增强猪口蹄疫灭活疫苗的免疫效果，其免疫 后21天的抗体滴度可达144，是标准疫苗(普通商品疫苗)的2. 5倍以上。将提取纯化的 pIFN-y-CpG DNA质粒按10、20、100、200、1000 μ g的剂量作为小鼠的免疫佐剂进行动物试 验，发现该佐剂具有剂量小，毒性低等特性，即使在作用剂量为200 μ g至1000 μ g剂量也未发现对小鼠的毒副作用。这些试验表明本发明具有使用剂量小、毒性低的特性。由图6可 见pcDNA-pIFN- y -CpG重组质粒免疫组的抗体滴度远高于其它各组，由此可知加有本发明 的佐剂的疫苗混合物，其免疫效果明显优于其它各对照组。
权利要求
一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，其特征在于这种佐剂是由CpG基序和猪IFN γ基因克隆入真核表达载体构成的重组质粒。
2.权利要求1所述的一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，其特征在于CpG基序为至 少由3个GTCGTT、2个GACGTT和1个AACGTT特殊序列构成的一段基序，其序列为SEQ No 1，用其构建的PcDNA3. 1重组质粒，并在大肠杆菌中增殖。
3.权利要求2所述的一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，其特征是由CpG基序构建 的重组质粒，其序列为SEQ No :2。
4.权利要求3所述的一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，其特征在于所用的猪 IFN-y基因为含信号肽的序列，其序列为SEQ No :3，用其构建的PcDNA3. 1重组表达质粒， 使IFN-y基因处在启动子的下游、CpG序列的上游，并能在哺乳动物细胞中表达。
5.权利要求2-4所述的一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂的制备方法，其特征在于 人工设计、合成一段基本骨架由3个GTCGTT、2个GACGTT和1个AACGTT所构成的CpG基序 以及其配对序列，同时在其末端分别设计EcoRI和Xhol酶切位点的部分碱基，并使其成为 双链DNA，通过基因重组方法构建到经EcoRI和Xhol酶切的真核表达载体中，获得含CpG基 序的重组质粒；然后利用猪IFN-y特异引物上游引物5，端CCCAAGCTTACAATGGGTTATAC AACTACTTATTTCT Hid III ；下游5，端GGAATTCTTATTTTGATGCTCTCTGGCCT EcoR I，以pGEM-T easy-pIFN-y重组质粒为模板克隆pIFN-y基因片段，扩增获得猪IFN-Y基因，再分别将 含CpG基序的重组质粒和IFN- y基因经相应的酶切后连接，得到PcDNA-pIFN- y -Cp⑶NA 重组质粒。
6.根据权利要求4所述的一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂的制备方法，其特征在 于构建的PcDNA-pIFN- y -CpG DNA重组质粒，先转化大肠杆菌，用氨苄青霉素抗性筛选阳性 克隆，提取重组质粒测序鉴定后，选择高拷贝的阳性菌株，接种到含氨苄的LB培养基中大 量增殖，扩增PcDNA-pIFN- y -CpG DNA重组质粒，用SDS碱裂解法大量提取重组质粒DNA。
7.一种猪口蹄疫苗组合物，其特征在于猪口蹄疫病毒灭活抗原疫苗与权利要求1至4 所述的任一佐剂配伍而成。
全文摘要
本发明涉及一种猪口蹄疫苗用的、由CpG基序和猪IFN-γ基因克隆入真核表达载体构成的佐剂及其制造方法，以及猪口蹄疫病毒灭活抗原疫苗与这种佐剂配伍而成猪口蹄疫苗组合物。本发明的这种复合分子型佐剂，其CpG基序为至少由3个GTCGTT、2个GACGTT和1个AACGTT特殊序列构成的一段基序，其序列为SEQ No1，用其构建的PcDNA3.1重组质粒，并在大肠杆菌中增殖。
文档编号C12N15/117GK101954080SQ20101029746
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者房永祥, 才学鹏, 景志忠, 曾爽, 窦永喜, 蒙学莲, 贾怀杰, 赵娜, 陈国华 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所