专利名称：一种石杉碱甲高产菌及用其发酵生产石杉碱甲的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种石杉碱甲高产内生菌一胶孢炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides isolate) YLJ-13，及该菌种的分离纯化及压力筛选， 同时还涉及利用该菌种高产发酵生产石杉碱甲的方法。
背景技术：
石杉碱甲是治疗早老性痴呆的特效药物，世界人口老龄化加剧，石杉碱甲的临床用药供给已呈现严重不足局面。目前石杉碱甲来源有四条途径①从植物中提取分离，目前已知含石杉碱甲的石杉科植物为获取石杉碱甲的主要植物来源，但其自我繁殖能力低下， 自然生长周期长达10 15年，人工栽培皱边石杉等石杉科植物难以成活。王俊等(2003 年)测定了 6种石杉科植物中石杉碱甲含量，仅为0. 0481% 0. 0706%，亲缘关系较近的马尾杉植物中石杉碱甲含量也只有0. 0061% 0. 0345%。②从石杉科植物的组织培养材料中获取。石杉科植物组织培养因其表面消毒困难，只有极少数获得了初步成功。Wojciech Szypula等研究报道，以伏贴石杉进行组织培养，其幼嫩新梢石杉碱甲为3. 33mg g^d.w,,但未见其大田培养成功，难以大规模获得石杉碱甲。③人工合成石杉碱甲。鉴于石杉碱甲及其相关化合物在治疗早老性痴呆的特效功能，意大利的科学家Kozikowski AP等(1989年) 进行了石杉碱甲类似物合成、英国的Lucey C等(2007年)进行了石杉碱甲的全合成。由于石杉碱甲结构比较复杂，合成的石杉碱甲是左旋和右旋的混合物，且产率低。只有极少数石杉碱甲类似物具有明显治疗早老性痴呆活性，化学合成很难实现石杉碱甲的有效供给。 这些类似物的合成大都依赖于天然石杉碱甲作为其最初的分子合成骨架，这些骨架目前也多是从稀有石杉科植物资源中直接提取获得。因此，人工合成石杉碱甲也不能形成有效供给。④石杉碱甲微生物合成。从微生物发酵途径生产石杉碱甲，我国研究起步很晚。黎万奎等(2007年)从蛇足石杉中分离出支顶孢属(Acremonium)内生真菌菌株2F09P03B，可能产生微量与宿主植物相同的活性成分石杉碱甲。寻找石杉碱甲高产菌株，发酵生产获得石杉碱甲，国内还是空白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种石杉碱甲高产菌株——胶孢炭疽菌，同时还提供一种采用该菌种发酵生产高产石杉碱甲的方法，以缓解目前石杉碱甲临床用药供给严重不足的局面。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种石杉碱甲高产菌株是取新鲜皱边石杉外植体，消毒后，以改良MS培养基培养，目标菌株经分离、纯化，压力筛选获得，该皱边石杉新鲜材料取自湖南湘西自治州原始次森林小溪国家自然保护区。该菌株经形态学鉴定及ITSl-5.8Sr RNA-ITS4分子生物学鉴定，确定为胶孢炭疽胃(Colletotrichum gloeosporioides)白勺禾中，g 力月交 包胃 H 胃(Colletotrichum gloeosporioides isolate) YLJ-13,现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年7月16日，保藏编号为CCTCC N0.M2010181，保藏单位地址中国.武汉.武汉大学。以改良PDA平板培养基进行本发明的胶孢炭疽菌YLJ-13的保存及活化，以改良马铃薯液体培养基发酵培养获得石杉碱甲。对液体发酵培养碳源种类及其用量、PH值、培养温度、摇床转速、培养时间等进行单因素试验，在此基础上进行正交试验，获得相对优化的发酵条件。在该优化的发酵条件下，每升培养体系可获得石杉碱甲高达199. 6mg/L。比收获自然生长的石杉科植物及运用组织培养收获新梢提取石杉碱甲更加便利，周期短、效率高、 生产成本低。以此菌株进行放大发酵培养，每升培养体系可获得石杉碱甲高纯品产品(纯度> 98% )至少可达178. 4mg，证明该菌株具备放大生产的实际应用能力。使用该菌进行发酵生产获得石杉碱甲，既保护了现有珍稀石杉科植物资源，也为促进石杉碱甲在抗老年痴呆药物及开发记忆力保健品等方面的产业化提供了物质保障。结合
图1，对本发明进行细化说明1胶孢炭疽菌YLJ-13的分离纯化1. 1皱边石杉外植体内生菌的初步培养将新鲜皱边石杉材料小心刷净表面杂物后用流动自来水冲洗4 6h，先用0. OlM HC1,5% NaOCl,2. 4mM柠檬酸依次洗涤约lmin，再用70%乙醇消毒lmin，然后依次用5% NaOCl消毒10 15min，7% H2O2消毒10 15min，最后用灭菌蒸馏水洗涤4 5次。取茎段，叶片、不定根分别接种于改良MS培养基。于黑暗条件下，24 28°C进行培养。取培养 2 4周后仍保持鲜绿的菌团，转接于改良PDA平板培养，以备后续各菌株分离纯化之用。本说明书中提及的改良MS培养基的配方及制备为每IOOOmL培养体系中，加入有蔗糖20 30g、琼脂5 15g、磷酸二氢钠0. 2 2. 0g、及活性炭1. 5 5. Og,再按照下表 1加入1/10MS培养基母液，加入蒸馏水补充体积至IOOOmL,调整pH值至5. 0 6. 5，最后 121°C灭菌20 30min，取出冷却至室温备用。本说明书中提及的改良PDA培养基的配方及制备为每1000 IOOOOmL培养体系，是取200 2000g去皮土豆煮沸30 60min，3层纱布过滤获滤液，于滤液中加入葡萄糖、蔗糖、淀粉或蜂蜜15 150g，及琼脂粉7 70g，再加蒸馏水补充体积至1000 IOOOOmL,调整pH值至4. 0 7. 5 ；于121°C灭菌20 30min，取出冷却至60 70°C，加入无菌链霉素至链霉素终浓度为0. lg/L，混勻。倒PDA平板，每一平板约20mL培养基为宜。本说明书中发酵培养本发明菌株所使用的培养基为改良马铃薯液体培养基，则是改良PDA培养基中仅不添加琼脂粉；其制备为每1000 IOOOOmL培养体系，是取200 2000g去皮土豆煮沸30 60min，3层纱布过滤获滤液，于滤液中加入葡萄糖、蔗糖、淀粉或蜂蜜15 150g,再加蒸馏水补充体积至1000 IOOOOmL,调整pH值至4. 0 7. 5 ；于121 °C 灭菌20 30min，取出冷却至60 70°C，加入无菌链霉素至链霉素终浓度为0. lg/L,混勻。表11/10MS培养基母液配方
权利要求
1.一种石杉碱甲高产菌，其分类命名为胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides isolate)YLJ-13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年7月16日，保藏编号为CCTCC N0.M2010181，保藏单位地址中国.武汉.武汉大学。
2.如权利要求1所述的一种石杉碱甲高产菌，其特征在于所述胶孢炭疽菌是取皱边石杉外植体消毒后接种于改良MS培养基，培养2 4周后外植体仍保持鲜绿的菌团，及取新鲜材料组织破碎法获得的长菌团，一并转接于改良PDA平板培养基，经反复分离、纯化; 经压力筛选得到。
3.如权利要求2所述的一种石杉碱甲高产菌，其特征在于所述改良MS培养基是每 IOOOmL培养体系中，加入有蔗糖20 30g、琼脂5 15g、磷酸二氢钠0. 2 2. Og、及活性炭1. 5 5. Og,再加入1/10MS培养基母液，加入蒸馏水补充体积至IOOOmL,调整pH值至 5. O 6. 5，最后121°C灭菌20 30min，冷却至室温而成。
4.如权利要求2所述的一种石杉碱甲高产菌，其特征在于所述改良PDA培养基的制备为每1000 IOOOOmL培养体系，是取200 2000g去皮土豆，煮沸30 60min过滤， 于滤液中加葡萄糖、蔗糖、淀粉或蜂蜜15 150g，琼脂粉7 70g，加入蒸馏水补充体积至 1000 IOOOOmL,调整pH值至4. O 7. 5 ；于121°C灭菌20 30min，取出冷却至60 70°C， 加入无菌链霉素至链霉素终浓度为0. lg/L，混勻而成。
5.如权利要求2所述的一种石杉碱甲高产菌，其特征在于所述压力筛选用的压力筛选培养基的制备方法如下(1)称取50 500g皱边石杉磨碎干样，加入50 500mL分析纯氯仿，超声浸提10 60min,收集浸提液；于浸提液中加入等体积分析纯氯仿超声浸提10 60min，再重复2次， 合并滤液；(2)减压浓缩回收氯仿，用分析纯甲醇洗出浓缩物，该浓缩物转入培养皿中，在通风橱中挥发至干，冷冻干燥24h，收集干燥物，4°C封存待用；(3)称取0.1 l.Og上述提取的皱边石杉干燥物，装入试管，加入分析纯乙醇，振荡溶解，并称取0. 1 0. 5g酵母粉、及5 15g琼脂溶解在SOOmL沸水中，趁热加入该已溶解的皱边石杉提取物，振荡混勻，定容至lOOOmL，121°C灭菌20min，取出冷却至60_70°C，加入无菌链霉素，使链霉素终浓度为0. lg/L，混勻。
6.一种发酵生产石杉碱甲的方法，其特征在于发酵所用培养基为改良马铃薯液体培养基；发酵所用菌株为权利要求1所述的菌株；发酵培养条件为按重量接种0.01 0. 02%的菌丝体于发酵培养液中，pH值4. 0 7. 5，温度25 34°C，时间为60 168小时， 转速为100 160转/分钟；发酵罐培养时，通气量1 0. 3 0. 7，罐压0. 03 0. 05MPa。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵培养条件为按重量接种0.01% 的菌丝体于发酵培养液中，PH值为5. 80，转速为130转/分钟，温度为30°C，时间为96小时，发酵罐培养时，通气量1 0.4，罐压0.0410^。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述改良马铃薯液体培养基是每 1000 IOOOOmL培养体系，是取200 2000g去皮土豆煮沸30 60min，过滤，于滤液中加入葡萄糖、蔗糖、淀粉或蜂蜜15 150g，加入蒸馏水补充体积至1000 IOOOOmL,调整pH 值至4. 0 7. 5 ；于121°C灭菌20 30min，取出冷却至60 70°C，加入无菌链霉素至链霉素终浓度为0. lg/L，混勻。
全文摘要
本发明公开了一种石杉碱甲高产菌及用其发酵生产石杉碱甲的方法，属于生物技术领域。该石杉碱甲高产菌是胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioidesisolate)YLJ-13，2010年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2010181。本发明的菌种经压力筛选从皱边石杉中分离纯化得到，经分子生物学手段鉴定该菌种为胶孢炭疽菌的一新种。该菌株在改良马铃薯液体培养基进行发酵，从发酵液中得到石杉碱甲。发酵生产获得石杉碱甲可分泌到胞外，以改良马铃薯液体培养基作为生物转化的前体物，每升培养体系可获得石杉碱甲高达199.6mg/L。采用本发明的菌种生产石杉碱甲，既保护了现有珍稀药用石杉科植物资源免遭破坏，还缓解了石杉碱甲用药需求短缺的格局。
文档编号C12P17/12GK102168017SQ20101029698
公开日2011年8月31日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者刘仲华, 史云峰, 禹利君, 胡维新, 黄建安 申请人:湖南农业大学