玉米花色素苷调节基因Lc应用于快速培育高黄酮含量红米水稻及方法和表达载体的制作方法

专利名称：玉米花色素苷调节基因Lc应用于快速培育高黄酮含量红米水稻及方法和表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体说，是涉及玉米花色素苷调节基因Zc应 用于快速培育高黄酮含量红米水稻及方法和表达载体。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球至少有一半人口以稻米为主粮。随着 生活水平的提高，具有较高保健价值的功能性水稻新品种培育已越来越受到人们的关注。类黄酮，又称黄酮类物质，是一类在植物界广泛存在的低分子量的多酚类次生代 谢产物。目前已有较多文献报道，黄酮类化合物是一类生物活性很强的物质，是一种天然 的抗氧化剂，具有降低心肌耗氧量、防治血管硬化等作用，具有抗衰老、增强机体免疫力、 抗癌防癌等功效(Knekt 等，Am. J. Epidemiol.，1997，146 (3) :223_230 ； Knekt 等，Eur. J. Clin. Nutr. ,2000，54(5) :415-417 ;Middleton 等，Pharmacol Rev. ,2000,52(4) 673-751 ;Williams 等，Free Radical Biol Med. ,2004,36(7) :838 - 849)。黄酮类物质对 人体具有多种保健功效，目前它在增强人体免疫力以及防治多种慢性病等方面的作用越来 越受到人们的重视。在有色水稻稻米中含有类黄酮中的重要成员，花色素与糖基结合形成的花色 苷。Koide等试验表明，红米的花色素苷水解产物能明显抑制肿瘤细胞的生长(Koide等， Cancer Biother Radiopharm，1996，11 (4) :273_277)。Ling 等的研究显示，采用红米饲养 兔子，能够降低动脉粥样硬化斑块面积，而且还能够提高血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL)和 载脂蛋白AI (ApoAI)水平，同时肝勻浆活性氧(ROS)和主动脉丙二醛(MDA)指标也显著降 低。他们认为产生该现象的原因可能是通过提高HDL和ApoAI水平促进胆固醇的逆运转， 从而可加速体内胆固醇的清除达到抗动脉粥样硬化的作用，该作用可能与有色稻米具有较 高微量元素有关，也可能是因为体内ROS水平降低提高了机体的抗氧化的能力(Ling等， J. Nutr,2001,131(5) :1421_1426)。中国农业科学院作物科学研究所韩龙植研究员实验室，在2006年发表的“水稻花 色苷含量的遗传研究进展”综述一文中，也概括了目前国内外关于有色水稻对人体的保健 功能，如红米稻花色苷水解物能明显抑制肿瘤细胞的生长(孙明茂等，植物遗传资源学报， 2006,7(2) :239-245)。中山大学生物系许实波教授指导硕士研究生何容飞完成的毕业论 文，研究了水稻总黄酮对老年性痴呆症的药理作用，并指出水稻黄酮对实验鼠老年性痴呆 症状有明显改善效果(何容飞等，中药材，2002，25 (2):108-111);许东晖等报道了水稻黄酮 能够明显缓解大鼠实验性肝纤维化现象(许东晖等，哈尔滨商业大学学报(自然科学版)， 2002,18 (1):34-36)。有色水稻除了具有如上这些特殊功效外，还有较高的营养价值。韩 龙植等曾分析了他们培育获得具有特殊性状的稻米营养成分。结果发现，甜红米糙米蛋白 质、赖氨酸、脂肪、油酸和亚油酸、维生素Bl和钙含量较高；红米的蛋白质、锌和硒含量较高 (韩龙植等，植物遗传资源学报，2003,4 (3) 207-213)。
因此，从有利于人类健康方面考虑，如能够设法培育红米水稻，从而提高稻米类黄 酮物质以及其他重要的营养成分的含量都具有极其重要的意义。天然的红米水稻一般属于野生稻，野生稻的许多性状不适合在栽培稻中存在，因 此，天然的红米水稻不能直接在水稻生产中被应用。虽然目前人们已有利用常规杂交方法 成功培育能够作为栽培稻使用的红米水稻新品种的报道(叶小英等，四川大学学报(自然科 学版)，2008，45 (3) :656-662)，但众所周知，采用杂交技术培育水稻新品种所需的时间较 长，如将野生的红米水稻与高产常规水稻杂交，将培育的Fl植株自交获得具有多种性状组 合的F2种子，再通过对F2植株筛选出多种性状相对较好的红米水稻单株，完成这个过程 至少需要三个季节种植水稻，就是利用海南进行冬季增加繁殖一代也需要一年半时间。要 使被筛选到的单株遗传组成完全纯合可能还需要经过6至7代种植筛选。因此，使用常规 杂交技术培育水稻新品种，就是利用南繁加代加快育种进度，一年种两季一般至少也需要4 年半到5年的时间；而且采用杂交育种技术，由于两个亲本对后代遗传物质的贡献率各为 50%，假如原先是红米的水稻品种各种性状不理想，即使是再怎样扩大种植具有多种性状组 合的F2植株群体，也难免在培育出的水稻新品种中完全消除原先不理想的亲本水稻留下 的某些性状。自20世纪70年代随着基因工程技术的建立与完善，使利用转基因技术改良作物 品质已成为可能。采用转基因方法改良作物品质，从表达载体构建、水稻遗传转化至筛选到 纯合后代整个过程，同样一年种两季只需要2年时间。而且，通过转基因技术培育的水稻新 品种，除了目标性状外，植株的其他性状一般不会被改变。类黄酮生物合成途径主要由两类基因控制结构基因和调节基因。其中，结构基 因直接编码与类黄酮生物合成有关的各种酶类，而调节基因则是控制结构基因表达强度 和表达方式的一类基因。目前与类黄酮生物合成的主要结构基因和调节基因在一些植物 中被克隆，主要结构基因编码的酶的生化作用机制也已被阐明(Holton等，Plant Cell, 1995,7(7) 1071-1083 ；Winkel-Shirley, Plant Physiol.，2001a，126(2) :485_493 ； ffinkel-Shirley, Plant Physiol. ,2001b, 127(4) :1399_1404)。目前，已被分离、鉴定与调 控类黄酮生物合成有关的调节基因主要有两大类转录因子MYB和MYC (bHLH)。玉米CV基因所编码的蛋白是第一个从植物中发现的MYB类转录因子(Paz-Ares 等，EMBO J. ,1987,6(12) =3553-3558) 0玉米Zc基因是一个参与调控叶脉、叶舌、叶耳等组 织产生花色素苷的调节基因(Dooner等，Genetics，1976，82 (2) :309_322)，是第1个在植物 中发现的具有bHLH结构域的转录因子(Ludwig等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1989， 86(18) =7092-7096)，属于/P基因家族成员。Llody等人1992年在美国科学杂志首次报道，将玉米花色素苷调节基因Zc在烟 草和拟南芥两种植物中异源表达时，转基因烟草的花冠檐和花丝变成红色，转Zc基因的拟 南芥在叶、茎、萼片中花色素含量增加，但在根、花瓣、雄蕊这些部位没有花色素的产生。单 独转入Cl基因的拟南芥和烟草都没有明显的性状。将分别转入Zc基因和Cl基因的拟南 芥杂交得到的Fl代，能在原来不产生花色素部位如根、花瓣、雄蕊产生花色素(Lloyd等， Science, 1992, 2581773-1775)。以后，又有学者先后将Zc基因分别导入矮牵牛(Quattrocchio等，/VaW Cell, 1993，5 (11) 1497-1512 ；Bradley 等，PlantJ.，1998，13(3) 381-392)和苜蓿(Heather等，Plant Physiol, 2003, 132(3) 1448 - 1463)中，也发现有些转基因植株的愈伤组织或 花色或叶片颜色因此而发生变化。Bovy等将Zc基因和CV基因一同导入番茄，转基因番茄 叶片为紫色，在果肉中黄酮醇含量提高，总黄酮醇(flavonols)含量为对照的20倍(Bovy 等，Plant Cell,2002,14(10) :2509_2526)。2005年Li等将Zc基因导入观叶植物双色 贝母，也引起了叶片颜色的明显改变(Li等，/Vafli Cell 7 印，2005，23716 - 720)。Li 等人将Zc基因成功导入苹果，转基因愈伤组织、叶、茎都变成红色、紫红(Li等，Planta, 2007,226:1243-1254)。2005年，由中国农业大学生物学院遗传学专业朱登云副教授指导 杨翅春硕士研究生撰写的毕业论文，部分工作也是利用玉米花色素苷调节基因Zc转化烟 草，结果也显示，转基因烟草花色发生了改变(杨翅春，中国农业大学生物学院遗传学专业 硕士毕业论文，2005)。我们实验室曾将组成性表达的CaMV35S启动子引导Zc基因转化水 稻，然而，转基因水稻的愈伤组织和叶片的颜色都没有出现改变的现象。单丽波等报道，将CaMV35S启动子引导玉米CV和调节基因表达载体转化小麦、 玉米、水稻和烟草，结果发现愈伤组织中可见红色斑点，由此他们认为CV和/ 调节基因可作 为衡量基因枪转化效果的指标(单丽波，遗传学报，2000, 27 (1) :65-69)。Gandikota等也曾 将玉米的调节基因Cl和/ ，以及结构基因C2 (chalcone synthase) 一起转化水稻，结果水 稻愈伤组织出现紫红色，但是其它只表达CV和/P、只表达C/、或只表达都不会出现类似情 况(Gandikota 等，Molecular Breeding,2001,7 (1) :73_83)。2006年，Shin等利用水稻胚乳特异性表达的醇溶蛋白基因启动子M货忍引导来 自于玉米的两种调节基因CV和基因as 基因也是/P基因家族成员)构建的表达载体， 在水稻种子糊粉层特异表达了 Cl和基因，使普通的白米水稻糙米变成红棕色，同时经 检测类黄酮物质比对照明显提高，但是转基因糙米的粒重、米粒长、宽、厚等农艺性状出现 了明显的下降，如夏季和冬季种植收获的转基因水稻种子重量分别只有对照的58%和36% (Shin 等，Plant Biotechnology, 2006,4 (3) :303_315)。根据陈惠哲等人研究结果显示， 种子饱满度越差发芽率越低，当种子由于饱满度降低导致千粒重从23. 5克降低到16. 1克 (相当于只有饱满种子重量的68. 5%)时，种子发芽率只有34. 6%，而且饱满度差的种子成苗 率也低，同时饱满度差还会导致植株分蘖力减弱(陈惠哲等，福建农业科学，2004，19 (2) 65-67)，这会直接影响到水稻的产量。在水稻生产中，要求被使用的常规水稻种子发芽率必 须超过85% (国家标准GB 4404.1-2008)。因此，由Shin等培育的转基因红米是难以在水 稻生产中被应用的。目前还没有一种快速培育稻米高黄酮含量同时植株各项农艺性状综合评价较好 的红米水稻的方法。概括目前人们对于Zc基因序列(GenBank :M26227. 1)的研究，在双子叶植物，人们 主要单独使用Lc基因或同时使用Lc基因和Cl基因，用于改变花色，或植株颜色，或果实的 颜色等。在单子叶植物，除了本实验室外，目前还未见单独使用Zc基因转化单子叶植物的 报道，只有在同时使用CV基因和与Zc基因同家族的基因共同转化水稻的报道。因此，需要建立一种快速培育稻米黄酮含量得到明显提高的红米水稻的新方法， 以克服目前采用常规杂交技术培育红米水稻需要育种时间太长、同时在培育的红米水稻新 品种中难以完全去除不良亲本留下的产量可能较低、品质较差等不利性状，或避免同时将 MYB和MYC两类转录因子作为目的基因构建的表达载体同时转化水稻，不仅使表达载体构建的工作量增大、转基因后代稻米干瘪严重等不良农艺性状伴随出现，从而影响到成功培 育的红米水稻难以在生产中被应用。

发明内容
本发明的目的是旨在将玉米花色素苷调节基因(Zc基因)应用于快速培育高黄酮 含量红米水稻。本发明还提供了快速培育高黄酮含量红米水稻的表达载体。本发明还提供了上述快速培育高黄酮含量红米水稻的方法。本发明的技术方案是，玉米花色素苷调节基因(Zc基因)应用于快速培育高黄酮含 量红米水稻。一种快速培育高黄酮含量红米水稻的表达载体，在质粒载体的序列中依次包含以 下序列
A:启动子，选自水稻中贮藏蛋白质基因的启动子，优选为谷蛋白位1基因的启动子； B: 5’ UTR序列，为启动子所属同一基因单元的5’ UTR序列，优选为谷蛋白位1基因的 5' UTR序列；
C:玉米花色素苷调节基因Zc ； D:终止子；
在启动子下游的5’ UTR与目的基因Zc序列之间，还可以包括启动子所属同一基因单 元编码信号肽片段的核苷酸序列，即位1基因的启动子下游5’ UTR序列与玉米花色素苷调 节基因Zc之间有位1基因编码信号肽片段的核苷酸序列。优选的，表达载体中还包括潮霉素抗性基因和^AS报告基因。上述表达载体用于转化白米水稻，经筛选得到高黄酮含量红米水稻。一种快速培育高黄酮含量红米水稻的方法，步骤包括
(1)将含有玉米花色素苷调节基因Zc的表达载体导入白米水稻受体组织，方法优选 为将含有玉米花色素苷调节基因Zc的表达载体的根癌农杆菌与白米水稻受体组织共培 养；或利用基因枪法用含有玉米花色素苷调节基因Zc的表达载体转化白米水稻受体组织；
表达载体中依次包含启动子、5’UTR序列、玉米花色素苷调节基因Zc和终止子，还包括 潮霉素抗性基因和^^报告基因；
启动子选自水稻中贮藏蛋白质基因的启动子，5’ UTR序列为启动子所属同一基因单元 的5，UTR序列；
在启动子下游的5’ UTR与目的基因Zc序列之间，还可以包括启动子所属同一基因单 元编码信号肽片段的核苷酸序列；
优选的启动子为谷蛋白位1基因的启动子，5’ UTR序列为谷蛋白位1基因的5’ UTR序
列；
(2)用潮霉素筛选转化后的水稻受体组织，进行再生和种植获得Ttl代植株；
筛选Ttl代植株是否含有Zc基因的方法优选为，用SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的下列引物进行PCR检测目的基因
上游引物 LCl 5，-GCCGGCTCTCTGTCGCCGGA-3，， 下游引物 LC3 5，-GTCTGCTGCGGCCTCGCCGGTCTC-3’从含有Ic基因的Ttl代植株收获T1代种子，筛选呈红米的后代；
(3)对T1代红米进行gM报告基因检测，将⑶S检测胚乳呈阳性的红米发苗，种植得 到T1植株，PCR检测进一步确定T1代植株是否含有Zc基因；
检测方法优选为，从T1代红米植株上取糙米，切取不含胚的部分糙米，进行GUS染色， 将胚乳呈阳性的糙米含胚的其余部分在培养基中发苗，种植得到T1植株；
(4)从含有Zc基因的T1代植株上收获T2代种子，继续种植T2代种子获得T2代幼苗， 采用PCR检测目的基因Lc,筛选得到无Zc基因分离的转基因纯合后代。还可采用以下技术方案一种快速培育高黄酮含量红米水稻的方法，步骤包括
(1)将表达载体B和含有玉米花色素苷调节基因Zc的表达载体A—同转化白米水稻 受体组织；方法优选为将含有表达载体A的根癌农杆菌与含有表达载体B的根癌农杆菌 按照6 10 :1的比例混合，与白米水稻受体组织共培养转化白米水稻受体组织；
或利用基因枪法，将表达载体A和表达载体B按照6 10 1的比例混合，转化白米水 稻受体组织；
表达载体A中依次包含启动子、5’ UTR序列、玉米花色素苷调节基因Lc和终止子；表达 载体B中含有潮霉素抗性基因和^as报告基因；
启动子选自水稻中贮藏蛋白质基因的启动子，5’ UTR序列为启动子所属同一基因单元 的5，UTR序列；
在启动子下游的5’ UTR与目的基因Zc序列之间，还可以包括启动子所属同一基因单 元编码信号肽的核苷酸序列；
优选的启动子为谷蛋白位1基因的启动子，5’ UTR序列为谷蛋白位1基因的5’ UTR序
列；
(2)用潮霉素筛选转化后的水稻受体组织，进行再生和种植获得含有Zc基因的Ttl代 植株；
筛选Ttl代植株是否含有Zc基因的方法优选为，用SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的下列引物进行PCR检测目的基因
上游引物 LCl 5，-GCCGGCTCTCTGTCGCCGGA-3，，
下游引物 LC3 5，-GTCTGCTGCGGCCTCGCCGGTCTC-3’
从含有Zc基因的Ttl代植株收获T1代种子，筛选呈红米的后代；
(3)对T1代红米进行gM报告基因检测，将⑶S检测胚乳呈阴性的红米发苗，种植得到 T1植株；经目的基因PCR检测保留含有Zc基因的T1代植株；
检测方法优选为，从T1代红米植株上取糙米，切取不含胚的部分糙米，进行GUS染色， 将胚乳呈阴性的糙米含胚的其余部分在培养基中发苗，种植得到T1植株；
通过如此操作即可得到不含潮霉素抗性基因和^as报告基因，只含有Zc基因的转基因 植株；
(4)从含有Zc基因的T1代植株上收获T2代种子，继续种植T2代种子获得T2代幼苗， 采用PCR检测目的基因Lc,筛选得到无Zc基因分离的转基因纯合后代。进一步，优选的方案，对上述两种方法得到的无Zc基因分离的转基因纯合T2代植 株开花后结出的幼嫩种子中的Zc基因进行RT-PCR检测，并使用水稻h-actin基因作为内 对照，筛选Zc基因高表达单株；
8再检测Zc基因纯合的T2代植株成熟种子的总黄酮含量，保留总黄酮含量高的转化子 后代。在构建表达载体时，在启动子下游的5’UTR与目的基因Zc序列之间，不论是否插 入该启动子原所属基因编码信号肽片段的核苷酸序列，都能够提高转基因水稻稻米的黄酮 含量，但是不使用编码信号肽的核苷酸序列比使用编码信号肽的核苷酸序列的表达载体提 高稻米黄酮含量会更明显。转基因后代糙米颜色深浅与糙米总黄酮含量的提高程度一般存在正向关系，因 此，在从Ttl代植株上收获T1代种子后，通过剥去颖壳观察糙米表现出红色的程度，尽量保留 糙米颜色较深的单株上收获的种子-U基因RT-PCR检测结果与转基因后代糙米总黄酮含 量之间一般也存在正向关系，因此，可通过对植株幼嫩种子Zc基因进行RT-PCR检测后，保 留Zc基因高表达的转化子。本发明的有益效果在于，(1)利用杂交育种技术可以培育出红米新品种，但采用常 规方法进行水稻育种，不仅操作烦琐、盲目性太大、所需时间长，而且有些不良的农艺性状 有时很难去除，育种目标与结果往往比较难做到一致。利用本发明提供的表达载体和培育 转基因红米水稻的方法，就能够实现快速、有效地培育高产、食味品质好等多种农艺性状都 优质的高黄酮含量红米水稻；
(2)现有转基因技术进行红米育种，是将来自玉米的MYB和MYC两类转录因子中的Cl 和 TP-S基因同时转化水稻(Shin 等，Plant Biotechnology, 2006,4 (3) :303_315)。因此， 在表达载体构建中需要构建两个基因单元，即两个嵌合基因。本发明只需要将玉米MYC类 转录因子中的Zc基因转化水稻即可成功培育出高黄酮含量的红米水稻。因此，利用本发明 培育红米水稻，构建表达载体的操作更为简便；
(3)利用CV和TP-S两个基因同时转化水稻，尽管也成功培育了高黄酮含量的红米水稻， 但是在不同季节中收获的转基因水稻种子重量都明显减轻，最好的也只有对照的58%(Shin 等，Plant Biotechnology, 2006,4 (3):303_315)。使用本发明构建的表达载体进行水稻遗 传转化培育的高黄酮含量红米水稻，转基因后代种子的发芽率完全能够满足水稻生产上的 要求；
(4)如果将本发明构建的表达载体进行水稻转化获得的独立转化子能够超过30个，在 转基因后代中将能够获得糙米总黄酮含量比非转基因水稻糙米提高300%以上的后代。


图1是实施例1构建的表达载体，其中(A)是实施例1构建的含有由水稻谷蛋 白位1基因启动子和5’ UTR序列以及含有或不含有位1基因编码信号肽的核苷酸序列 引导玉米花色素苷调节基因Zc表达载体pCAMBIA1301-位I-Zc-Nos或pCAMBIA1301-位1 (S)-Zc-Nos的T-DNA结构图，在这两个表达载体的T-DNA上同时还具有潮霉素抗性基因和 gus报告基因；
图I(B)是实施例2构建的含有由水稻谷蛋白位1基因启动子和5’ UTR序列以及含 有或不含有位1基因编码信号肽的核苷酸序列引导玉米花色素苷调节基因k表达载体 pCAMBIA1300-^il-Zc-35Ster 或 pCAMBIA1300_位 1 (S)-Zc-35Ster 的 T-DNA 结构图，在这 两个表达载体的T-DNA上不具有潮霉素抗性基因和gM报告基因。
图2为实施例3部分Ttl代转基因植株和非转基因对照水稻PCR检测图。图中M 为标准分子量DNA ；Z为以本发明构建表达载体为模板进行PCR扩增的产物；C为以非转基 因对照水稻基因组DNA为模板PCR扩增的产物；1-21为部分转基因植株基因组DNA为模板 PCR扩增的产物。图3为实施例3部分Ttl代转基因水稻和非转基因对照水稻糙米性状观察。图中 A为非转基因对照水稻；B是从一棵已转化了 pCAMBIA1301-位I-Zc-Nos表达载体T-DNA的 转基因T。植株上收获的红米。图4是实施例3的RT-PCR检测图。其中图4 A是在非转基因对照和部分 转基因(pCAMBIA1301-位7-Z c-Nos)水稻开花15天后对幼嫩种子内源β -actin基 因cDNA质量在调平后的RT-PCR检测图；图4 B是在非转基因对照和部分转基因 (pCAMBIA1301-^7-Zc-Nos)水稻开花15天后对幼嫩种子Zc基因RT-PCR检测图。图中 C为非转基因对照水稻；C3、C4、C6、C8、C9、C12、C14、C17、C19、C22均为已转化了表达载体 pCAMBIAl301-^iI-Zc -Nos T-DNA 的转基因植株。图5是实施例1中pCAMBIA1301质粒的T-DNA结构图。图中LB、RB为T-DNA的左 右边界；35S-pro、35S-ter为CaMV 35S基因启动子和终止子-’hpt为潮霉素抗性基因 ’gus 为b-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Nos-ter为胭脂碱合成酶基因终止子；Xh、Ε、Sa、K、S、B、X、 Sal、P、H 分别为损ο I、EcoRl ,Sacl, Kpn Y、SmaY、BairMl、XbaY、SalY、PstY、Hind III 的缩写， 并表示相应的酶切位点。图6是实施例2中pCAMBIA1300质粒的T-DNA结构图。图中LB、RB为T-DNA的左 右边界；35S-pro、35S-ter为CaMV 35S基因启动子和终止子-,hpt为潮霉素抗性基因；Xh、 Ε、Sa、K、S、B、X、Sal、P、H 分别为损ol JcoTPI、Sad,KpnI、SmaY、BarrMUXbaY、Sail,PstI, ^iW III的缩写，并表示相应的酶切位点。
具体实施例方式实施例1
本实施例是为了说明含有k基因，同时具有潮霉素抗性基因及^AS报告基因的表达 载体pCAMBIAl301-Gil-Zc-Nos (不含位7基因编码信号肽的核苷酸序列)和pCAMBIA1301 -Gtl (S)-Zc-Nos (含位7基因编码信号肽的核苷酸序列)的构建。如图1 (A)所示，图中的Gil-pro为水稻谷蛋白位1基因编码链ATG上游5. 3kb 序列，包括位1基因启动子及5’ UTR序列；仍1-pro (S)除了含有水稻谷蛋白位1基因编 码链ATG上游5. 3kb序列外，还含有位1基因编码信号肽的核苷酸序列-U为玉米花色素 苷调节基因；Nos-ter为胭脂碱合成酶基因终止子；35S-pro、35S-ter分别为CaMV 35S基 因启动子和终止子.Mpt为潮霉素抗性基因-’gus为b-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；LB、RB分别 为 T-DNA 的左、右边界；Xh、E、S、X、H、N 分别是内切酶炀ol JcoTPUffl3 I ,Xbal.Hind IIL AfcoI的缩写，并表示相应的酶切位点。具体操作过程如下
a) 以pCAMBIA1301质粒为载体，简称pl301，来自于中科院上海植物生理与生态研究 所王宗阳研究员，T-DNA结构如图5，其中LB、RB为T-DNA的左、右边界；35S-pro、35S_ter 为CaMV 35S基因启动子和终止子-’hpt为潮霉素抗性基因柳s为b_葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Nos-ter为胭脂碱合成酶基因终止子；Xh、Ε、Sa、K、S、B、X、Sal、P、H、N分别为损ol、 EcoRl,Sacl,KpnY、SmaY、BairMl、Xbal、Sal\、Pst\、Hind III、AfcoI 的缩写，并表示相应的酶 切位点；
在pCAMBIA1301质粒载体Nos终止子两端设计PCR引物 5 ‘ -CCCGGGATCGTTCAAACATTTGG-3‘禾Π
5 ‘ - GAATTCCCCGATCTAGTAACATAG-3 ‘，上游和下游引物5 ‘端分别引入Sma I和 EcoR I酶切位点；将PCR产物与T载体连接得到T-I载体，并转化大肠杆菌感受态细胞；然 后用Sma I和I对T-I质粒进行酶切，电泳回收小片段，将该小片段与pCAMBIA1301 质粒Saa I和I酶切产物进行连接，得到pCAMBIAl301-Nos载体，转化大肠杆菌感受 态细胞；采用PCR、酶切及测序鉴定；
b)参照本实验室递交的位1基因序列(GenBank:AY649098)，在位1基因编码区起 始密码子 ATG 上游 5319bp 处设计上游引物5 ‘ -GGAAGCTTTCTCCGGGTCATCGATAGGTGGGG C-3'，在位1基因5，UTR下游结束处设计下游引物5，-GGGTCTAGAGTTGTTGTAGGACTAATGAA CTGA-3'或在位1基因编码信号肽的72个核苷酸下游结束处设计下游引物5' -GGGTCTA GAGGCTAGGGAGCCATCGCACAAG-3 ‘，上、下游引物5 ‘端分别引入Hind III和Xba I酶切位点， 以常规水稻叶片DNA为模板进行PCR扩增获得位1基因5. 3kb启动子和5，UTR或5. 3kb启 动子和5’UTR及编码信号肽的核苷酸序列，将PCR产物与T载体连接得到T-2载体，并转化 大肠杆菌感受态细胞；通过酶切、PCR及测序鉴定T-2载体；然后用历·/^ III和损a I对T-2 质粒进行酶切，电泳回收大片段，将该大片段与pCAMBIA1301-Nos质粒历III和损a I酶 切产物进行连接，得到pCAMBIAl301-Gil-Nos或pCAMBIA130im (S)-Nos载体，转化大肠 杆菌感受态细胞；采用PCR、酶切及测序鉴定；
c)参照GenBank公布的Zc基因序列(GenBank:M26227. 1 )，在Zc基因编码链起始密码 子ATG和终止密码子TGA处分别设计上、下游引物5' -GTCTAGAATGGCGCTTTCAGCTTGG-3‘ 和5 ‘ -CCCGGGTCACCGCTTCCCTATAG-3 ‘，引物5 ‘端分别引入损a I禾口 Sma I酶切位点。 提取玉米叶片RNA再通过反转录获得Zc基因编码序列，将RT-PCR产物与T载体连接得到 T-3载体，并转化大肠杆菌感受态细胞；通过酶切、PCR及测序鉴定T-3载体；然后用I 和损a I对T-3质粒进行酶切，电泳回收小片段，将该小片段与pCAMBIAl301-Gil-Nos 或pCAMBIA1301-位1 (S) -Nos载体经Sim I和Xba I酶切产物进行连接，得到 PCAMBIA1301-位I-Zc-Nos和pCAMBIA1301_位1 (S) -Zc-Nos载体，转化大肠杆菌感受态细 胞；采用PCR、酶切及测序鉴定。构建的含有由水稻谷蛋白似1基因启动子和5’UTR序列以及含有或不含有位1基 因编码信号肽的核苷酸序列引导玉米花色素苷调节基因Zc表达载体的T-DNA结构图如图 1 (A)所示，同时还具有潮霉素抗性基因和^as报告基因。实施例2
本实施例是为了说明含有^基因，不具有潮霉素抗性基因及^AS报告基因的表 达载体pCAMBIA1300-位7-Zc-35Ster (不含位7基因编码信号肽的核苷酸序列)和 PCAMBIA1300-位7 (S)-Zc_35Ster (含位7基因编码信号肽的核苷酸序列)的构建，如图 1 (B)所示，在这两个表达载体的T-DNA上不具有潮霉素抗性基因和gM报告基因。具体操作过程如下a)以pCAMBIA1300质粒为载体，简称pl300，来自于中科院上海植物生理与生态研究 所王宗阳研究员，T-DNA结构图如图6所示。其中LB、RB为T-DNA的左右边界；35S_pro、 35S-ter为CaMV 35S基因启动子和终止子.,hpt为潮霉素抗性基因；Xh, E、Sa、K、S、B、X、 Sal、P、H 分别为损οI、EcoRl,Sacl,KpnI, Smal,Bamm、XbaY、SalY、PstY、Hind III的缩写， 并表示相应的酶切位点；
b)同样参照本实验室递交的位1基因序列(GenBank:AY649098)，在位1基因编码区起 始密码子ATG上游5319bp处设计上游引物，在位1基因5’ UTR下游结束处设计下游引物
5 ‘ -GGAAGCTTTCTCCGGGTCATCGATAGGTGGGGC-3‘禾 Π 5' -GGGTCTAGAGTTGTTGTAGGACTAATGAACTGA-3'，
或在位1基因编码信号肽的72个核苷酸结束处设计下游引物5' -GGGTCTAGAGGCTAG GGAGCCATCGCACAAG-3 ‘，上、下游引物5 ‘端分别引入Hind III和Xba I酶切位点，以常规水 稻叶片DNA为模板进行PCR扩增获得位1基因5. 3kb启动子和5，UTR或5. 3kb启动子和 5'UTR及编码信号肽的核苷酸序列，将PCR产物与T载体连接得到T-4载体，并转化大肠杆 菌感受态细胞；通过酶切、PCR及测序鉴定T-4载体；然后用历III和损a I对T-4质粒进 行酶切，电泳回收大片段，将该大片段与PCAMBIA1300质粒历III和损a I酶切产物进行 连接，得到PCAMBIA1300-位1或pCAMBIA1300m (S)载体，转化大肠杆菌感受态细胞；采 用PCR、酶切及测序鉴定；
c)同样参照GenBank公布的Zc基因序列(GenBank:M26227. 1 )，在Zc基因编码链起始 密码子ATG和终止密码子TGA分别设计上、下游引物
5 ‘ -GTCTAGAATGGCGCTTTCAGCTTG-3‘禾 Π 5 ‘ -CTCGAGTCACCGCTTCCCTATAG-3‘，
引物5'端分别引入损a I和损ο I酶切位点。提取玉米叶片RNA再通过反转录获得 Lc基因编码序列，将RT-PCR产物与T载体连接得到T-5载体，并转化大肠杆菌感受态细胞； 通过酶切、PCR及测序鉴定T-5载体；然后用I和损a I对T-5质粒进行酶切，电泳回收 小片段，将该小片段与PCAMBIA1300-兌1或pCAMBIA1300-兌1 (S)载体经损ο I ^PXba I 酶切产物进行连接，得到 PCAMBIA1300-位l-Zc-35ter 和 pCAMBIA1301_位 1 (S) -Zc-35ter 载体，转化大肠杆菌感受态细胞；采用PCR、酶切及测序鉴定。实施例3
本实施例是为了说明用实施例1制备的含有Zc基因，同时具有潮霉素抗性基因及^AS 报告基因的表达载体pCAMBIA1301-Gi7-Zc-Nos 或 pCAMBIA1301_位7 (S) -Zc-Nos 转化普 通白米水稻培育高黄酮含量红米水稻的过程。(1)选取高产水稻新品系“超2-10”作为利用转基因技术培育高黄酮含量红米水 稻的受体材料。首先将“超2-10”水稻成熟种子或开花12 15天的幼嫩种子的胚在愈伤组织 诱导培养基上进行愈伤组织诱导，将诱导出的愈伤组织与含有实施例1所得PCAMBIA1301-Gtl -Lc- Nos载体或pCAMBIA1301-位1 (S)-Zc-Nos载体的根癌农杆菌进行共培养，或是 使用基因枪直接将含有Zc目的基因的载体导入“超2-10”水稻的愈伤组织。(2)经过两轮潮霉素抗性筛选、预分化、分化和生根培养从抗性愈伤组织再生出 幼苗。再经过常规培养获得Ttl植株。利用与目的基因Zc同源配对的上、下游引物对转基因Ttl植株进行PCR检测，结果
12显示所有转基因植株都能够扩增出与表达载体相同的369 bp条带，非转基因水稻无扩增条 带；
上游引物 LCl 5，-GCCGGCTCTCTGTCGCCGGA-3，， 下游引物 LC3: 5，-GTCTGCTGCGGCCTCGCCGGTCTC-3，；
部分Ttl代转基因植株和非转基因对照水稻PCR检测图如图2所示，其中M为标准分子 量DNA ；Z为以本发明构建表达载体为模板进行PCR扩增的产物；C为以非转基因对照水稻 基因组DNA为模板PCR扩增的产物；1-21为部分转基因植株基因组DNA为模板PCR扩增的 产物；
从Ttl植株上收获T1种子。剥开两种类型转基因水稻颖壳，结果显示，在转化 PCAMBIA1301-位1- Lc- Nos载体的后代中约有一半植株糙米呈现不同程度的红色；在转化 pCAMBIAl301-^il (S) -Zc-Nos载体的后代中约有1/3植株糙米呈现不同程度的红色；
部分Ttl代转基因水稻和非转基因对照水稻糙米性状观察对比如图3所示，其中A为非 转基因对照水稻；B是从一棵已转化了 pCAMBIA1301-位I-Zc-Nos表达载体T-DNA的转基因 Ttl植株上收获的红米，颜色呈红棕色。尽管，转基因水稻糙米比非转基因对照水稻略微减 小，但是，其外观正常，没有出现干瘪现象。(3)对呈现为红米的T1代糙米进行gM报告基因检测，切取半粒不含胚的糙米进 行GUS染色，将GUS检测胚乳呈阳性的另半粒糙米用1/2MS培养基进行发苗，种植获得T1代 植株；采用PCR进一步确认在T1代植株中是否含有Zc基因。(4)从含有Zc基因的T1代植株上收获T2代种子，继续种植T2代种子获得T2代幼 苗，采用PCR检测目的基因Zc，筛选得到无Zc基因分离的转基因纯合后代。以水稻的β -actin基因作为内参对照，在转基因纯合单株开花15天后取幼嫩种 子，采用RT-PCR比较两种载体转化获得的转基因水稻Zc基因表达水平，结果显示，转化 pCAMBIAl301-^il -Zc-Nos载体的转基因水稻Zc基因表达水平相对较高。同样以水稻的β-acii/ 基因作为内参对照(图4A)，使用RT-PCR比较已转化 pCAMBIA1301-^7-Zc-Nos表达载体的不同转化子的纯合植株幼嫩种子中Zc基因表达水 平，筛选出Zc基因高表达的转化子后代(图4B )。观察含有Zc基因的T2代糙米，都依然呈红色，由此表明，转基因红米性状是能够 稳定遗传的。以芦丁为标准品，检测T2代植株成熟种子糙米的总黄酮含量，结果显示，糙米总黄 酮含量均有提高。糙米总黄酮含量比对照提高明显的转基因植株主要是转化 PCAMBIA1301-位I-Zc-Nos载体的类型。其中有部分转化子种子总黄酮含量比非转基因对照 水稻提高300%以上。分析总黄酮含量提高最明显的转化子后代糙米的千粒重，结果显示，转基因水稻 粒重是对照的90%以上。分析陈惠哲等人研究结果显示，当种子由于饱满度降低导致千粒 重由23. 5克减轻为19. 6克(相当于饱满种子重量的83. 4%)时，这两种种子的发芽率分别 为98. 2%和97. 7%，成苗率分别为72. 4%和75. 1%，两者的发芽率和成苗率统计分析差异都 不显著(陈惠哲等，福建农业科学，2004，19 (2):65-67)。因此，由本发明培育的转基因红米 水稻从发芽率角度分析是完全能够满足水稻生产上的要求。
实施例4
本实施例是为了说明含有ZC基因，不具有潮霉素抗性基因，及^AS报告基因的表达载 体PCAMBIA1300-位l-Zc-35Ster，转化普通白米水稻培育无抗性基因、无报告基因符合转基 因安全的高黄酮含量、高产、优质红米水稻的过程。“宝农34”水稻(原编号99-34)由宝山区农业良种繁育场育成，2003年9月通过 上海市农作物品种审定委员会审定，经多年、多点示范和推广，该品种表现为穗大粒多、产 量高、米质优、适应性广等特性(朱一峰等，上海农业科技，2007，(4) :24)。“宝农34”水稻 2003年12月获上海市科学技术成果证书。“宝农34”稻米煮饭具有特别好的口感，食味感 觉与优质日本稻米相当。在2009年12月初，上海市农业技术推广服务中心、上海市作物学 会、上海市种子行业协会组织的首届上海市优质稻米品鉴活动中获首届上海市优质稻米评 比唯一金奖(以米粒外观品质和蒸煮品质两个项目9个子项目及适口性为评判标准)。(1)以“宝农34”水稻为受体材料，首先将“宝农34”水稻成熟种子或开花12 15 天的幼嫩种子的胚在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导；
含有实施例2构建的表达载体pCAMBIA1300-位l-Zc-35Ster的根癌农杆菌与含有 PCAMBIA1301质粒载体的根癌农杆菌按9 1的比例混合，与诱导出的“宝农34”水稻愈伤组 织共培养；或是将pCAMBIA1300m-Zc-35Ster质粒载体与pCAMBIA1301质粒载体按9 1 的比例混合，利用基因枪导入“宝农34”水稻愈伤组织。(2)转化后水稻愈伤组织的抗性筛选、预分化、分化和生根培养及Ttl植株目的基 因PCR检测操作，与实施例3的步骤(2)相同。(3)获得Ttl代转基因植株后，再按照李建粤等人的报道(李建粤等，科学通报， 2004，49 (24):2556-2561)进行只含有玉米Zc基因、无抗性基因和报告基因的转基因水稻 后代筛选。即，切取半粒不含胚的糙米进行GUS染色，将GUS检测胚乳呈阴性的另半粒糙米用 1/2MS培养基进行发苗，种植获得T1代植株；采用PCR进一步检测在T1代植株中是否含有 Lc基因。得到不含潮霉素抗性基因和^as报告基因，只含有Zc基因的转基因植株。对采用Zc目的基因PCR检测无抗性基因和报告基因T2植株中筛选到的Zc基因 纯合后代同样进行幼嫩种子的RT-PCR分析和成熟种子糙米总黄酮含量分析，由此获得了 能够在水稻生产中被使用的黄酮含量比非转基因对照水稻提高300%以上、高产、优质红米 水稻。
权利要求
玉米花色素苷调节基因Lc在快速培育高黄酮含量红米水稻方面的应用。
2.一种快速培育高黄酮含量红米水稻的表达载体，其特征在于，在质粒载体的序列中 依次包含以下序列A:启动子，选自水稻中贮藏蛋白质基因的启动子；B: 5’ UTR序列，为启动子所属同一基因单元的5’ UTR序列；C:玉米花色素苷调节基因Zc ；D:终止子。
3.权利要求2所述一种快速培育高黄酮含量红米水稻的表达载体，其特征在于，在启 动子下游的5’ UTR与目的基因Zc序列之间，包括启动子所属同一基因单元编码信号肽片 段的核苷酸序列。
4.权利要求2或3所述一种快速培育高黄酮含量红米水稻的表达载体，其特征在于，还 包括潮霉素抗性基因和^^报告基因。
5.一种快速培育高黄酮含量红米水稻的方法，其特征在于，步骤包括(1)将含有玉米花色素苷调节基因Zc的表达载体导入白米水稻受体组织将含有玉 米花色素苷调节基因Zc的表达载体的根癌农杆菌与白米水稻受体组织共培养；或利用基 因枪法用含有玉米花色素苷调节基因Zc的表达载体转化白米水稻受体组织；所述表达载体中依次包含启动子、5’UTR序列、玉米花色素苷调节基因Zc和终止子，还 包括潮霉素抗性基因和^^报告基因；所述启动子选自水稻中贮藏蛋白质基因的启动子，所述5’ UTR序列为启动子所属同一 基因单元的5’ UTR序列；(2)用潮霉素筛选转化后的水稻受体组织，进行再生和种植，筛选获得含有Zc基因的 T0代植株；从含有Zc基因的Ttl代植株收获T1代种子，筛选呈红米的后代；(3)对T1代红米进行gM报告基因检测，将GUS检测胚乳呈阳性的糙米发苗，种植得 到T1植株，PCR检测进一步确定T1代植株是否含有Zc基因；(4)从含有Zc基因的T1代植株上收获T2代种子，继续种植T2代种子获得T2代幼苗， 采用PCR检测目的基因Lc,筛选得到无Zc基因分离的转基因纯合后代。
6.一种快速培育高黄酮含量红米水稻的方法，其特征在于，步骤包括(1)将表达载体B和含有玉米花色素苷调节基因Zc的表达载体A导入白米水稻受体 组织将含有表达载体A的根癌农杆菌和含有表达载体B的根癌农杆菌按照6 10 :1的比 例混合，与白米水稻受体组织共培养转化白米水稻受体组织；或利用基因枪法，将表达载体A和表达载体B按照6 10 1的比例混合，转化白米水 稻受体组织；表达载体A中依次包含启动子、5’UTR序列、玉米花色素苷调节基因Zc和终止子；表达 载体B中包括潮霉素抗性基因和^as报告基因；所述启动子选自水稻中贮藏蛋白质基因的启动子，所述5’ UTR序列为启动子所属同一 基因单元的5’ UTR序列；(2)用潮霉素筛选转化后的水稻受体组织，进行再生和种植，并筛选获得含有Zc基因 的T。代植株；从含有Ic基因的Ttl代植株收获T1代种子，筛选呈红米的后代；(3)对T1代红米进行gM报告基因检测，将GUS检测胚乳呈阴性的糙米发苗，种植得 到T1植株；经目的基因PCR检测保留含有Zc基因的T1代植株；(4)从含有Zc基因的T1代植株上收获T2代种子，继续种植T2代种子获得T2代幼苗， 采用PCR检测目的基因Lc,筛选得到无Zc基因分离的转基因纯合后代。
7.权利要求5或6所述一种快速培育高黄酮含量红米水稻的方法，其特征在于，步骤 (1)中所述启动子为谷蛋白似1基因的启动子；所述5’UTR序列为谷蛋白似1基因的5’UTR 序列。
8.权利要求5或6所述一种快速培育高黄酮含量红米水稻的方法，其特征在于，步骤(1)中所述启动子下游的5’UTR与目的基因Zc序列之间，还包括启动子所属同一基因单元 编码信号肽片段的核苷酸序列。
9.权利要求5或6所述一种快速培育高黄酮含量红米水稻的方法，其特征在于，步骤(2)中所述筛选Ttl代植株是否含有Zc基因的方法为，用SEQID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的下列引物进行PCR检测目的基因上游引物 LCl 5，-GCCGGCTCTCTGTCGCCGGA-3，， 下游引物 LC3: 5，-GTCTGCTGCGGCCTCGCCGGTCTC-3，。
10.权利要求5或6所述一种快速培育高黄酮含量红米水稻的方法，其特征在于，对得 到的无Zc基因分离的转基因纯合T2代植株幼嫩种子中的Zc基因进行RT-PCR检测，筛选 Zc基因高表达单株；再检测T2代植株成熟种子的总黄酮含量，保留总黄酮含量高的转化子后代。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域，是将玉米花色素苷调节基因Lc应用于快速培育高黄酮含量红米水稻。构建了一种表达载体，其中依次包含启动子、5’UTR序列、玉米花色素苷调节基因Lc和终止子。将上述表达载体用于转化白米水稻，经筛选得到高黄酮含量红米水稻。本发明构建载体更为简单，只需要引入一种基因即可培育出高黄酮含量的红米水稻，转基因后代种子的发芽率完全能够满足水稻生产上的要求。
文档编号C12N15/63GK101948848SQ201010296308
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者张天庆, 李建粤, 沈忠伟, 白洁, 董彦君, 许昱 申请人:上海师范大学