专利名称：一种制备诱导多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备诱导多潜能干细胞的方法，试剂盒及用途。
背景技术：
(一 )干细胞多能性(pluripotency)的特点胚胎干细胞因为具有向三个胚层细胞的分化能力而被称为“多潜能”干细胞，此外，胚胎瘤(EC)细胞和胚胎生殖(EG)细胞均具有和胚胎干细胞类似的多能性。多潜能干细胞共同的特点是细胞核质比比较大，克隆样生长(人胚胎干细胞较扁平，而小鼠胚胎干细胞较为隆起，细胞界限不明显)，具有AP酶活性，特异地表达SSEA4，TRA1-60，TRA1-81等表面标志(小鼠胚胎干细胞还特异性地表达SSEAl，而人胚胎干细胞不表达SSEA1)，及0ct4， Nanog，Sox2, rexl (ZFP42)，⑶F3，lin28，TDGFl等标志性基因。此外，还可以在悬浮培养条件下，形成胚胎小体(Embryonid bodies)结构，并发生自发分化，EB形成6_9天后贴壁培养，可检测到向内、中、外三个胚层分化的细胞。( 二)诱导多能性干细胞(IPS细胞)的研究2006年8月，日本京都大学再生医科学研究所教授山中伸弥(Yamanaka)实验室首先宣布在小鼠的成纤维细胞中导入4个基因⑴ct4，Sox2, c-Myc和KLF4)成功地将其诱导成为全能性的干细胞，其性质和胚胎干细胞类似，(Takahashi and Yamanaka, 2006)从而首次揭示了通过转基因可以在分化的细胞中建立全能性。这是对许多年来的生物学观念的一次巨大的冲击，并且有望使基于干细胞技术的治疗性克隆彻底摆脱卵子来源的困境和破坏胚胎引起的伦理争议。目前使用这种人工干细胞米进行细胞治疗患者尚存在安全隐患，但它不久后可能被应用于疾病模型的制作和新药研发等研究工作。这一成果加快了再生医学的研究步伐，具有划时代的意义。在该实验中，Yamanaka等人首先选取了和小鼠胚胎干细胞自我更新及维持多能性相关的M个基因，分别将他们克隆到逆转录病毒载体，对胚胎成纤维细胞进行共转染，在进行基于 ^χ15报告体系的筛选之后，他们观察到了 ES-Iike的细胞集落的形成。经过对这M个基因的进一步分析，他们发现，仅转导0ct4，Sox2, c-Myc, KLF4就可以使胚胎成纤维细胞完全转变成为诱导的多潜能干细胞(iPS细胞-Induced Pluripotent Stem Cells，俗称“诱导的多潜能干细胞”)。该IPS细胞拥有正常的核型，表达类似胚胎干细胞的分子标志，可以在体外被诱导分化为内、中、外三个胚层的终末分化的细胞，能够在裸鼠体内形成畸胎瘤，在畸胎瘤中含有内、中、外三个胚层的分化细胞。此外，和胚胎干细胞一样，IPS细胞在Nanog和0ct4promoter上检测到H3的低甲基化和高乙酰化。然而，采用 Fbx 15基因作为importer筛选出来的细胞并不具有完整的全能性，如内源0ct4等干性基因仍然没有能够正常地启动表达，不能通过囊胚注射的方法制成嵌合小鼠等。此后，2007年5月份，Yamanaka实验室和Jaenisch实验室同时在Nature杂志上发表文章声明(Okita et al.，2007 ；Wernig et al.，2007)，他们采用新的报告基因(基于 0ct4或nanog的promoter)进行抗药性筛选可以产生完全重编程的IPS细胞，新的IPS细胞可以使内源基因重新启动，并且可以通过囊胚注射制备成为嵌合小鼠，并整合到生殖系统中，产生完全由该IPS细胞生成的后代小鼠。Jaenisch实验室的实验结果表明，该IPS细胞甚至通过四倍体胚胎嵌合技术制备发育正常的小鼠胚胎。此外，新的IPS细胞的0ct4启动子及Nanog启动子的甲基化修饰也几乎被完全擦除。同时，Hochedlinger实验室和Plath实验室合作在Cell stem cells上发表文章， 用更加丰富的手段验证了 IPS细胞完全重编程的效果。(Maherali et al.，2007)例如，同分化细胞融合使分化细胞去分化的能力，雌性细胞的X染色体失活现象，H3K4和H3K27的甲基化谱等等。由此，4个因子诱导分化细胞成为全能性干细胞的事实被完全确认！同时，研究发现只用0ct4，Sox2和KLF4 —样可以获得IPS细胞，cMyc并不是体细胞重编程所必需的转录因子。(Nakagawa et al.，2008)随后发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂内戊酸(Valproic acid, VPA) (0. 5mM-3mM) (Huangfu et al.，2008)能够在 0ct4， Sox2和KLF4三因子水平大大提高重编程的效率。随后的研究发现，重编程因子Sox2也能够被进一步替代，对于人和小鼠的体细胞如胚胎成纤维细胞，在0ct4和KLf4两个因子的作用下就能够实现重编程，虽然效率会明显降低。多家实验室筛选鉴定了一系列小分子以提高0ct4和Klf4诱导重编程的效率如组蛋白甲基转移酶G9a抑制剂BIX01294， H3K4 组蛋白甲基化酶抑制剂 tranylcypromine (2 μ M) (Lin et al. ,2009), GSK3beta 抑制剂 CHIR99021(2yM-10yM) (Lin et al. ,2009), TGFbeta 抑制剂 616452 (2-5 μ Μ_4 μ Μ) (Maherali and Hochedlinger, 2009)等。但是，目前在小鼠成纤维细胞上利用单因子诱导体细胞重编程的方法仍未见报道。
发明内容
本发明提供了一种小分子组合，在只导入一个转录因子(0ct4)的情况下，诱导产生诱导多潜能干细胞(iPS细胞)的方法。该方法通过向分化的细胞中提供特定组合的小分子，在外源表达0ct4因子的作用下，诱导产生IPS细胞-诱导的多潜能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,俗称“万能细胞”)，其中所使用的小分子包括一个HDAC抑制齐[J，一个GSK3_beta抑制剂，一个TGF-beta抑制剂和一个H3K4去甲基化抑制剂。在一个特例中，所使用的小分子组合是VPA(HDAC抑制剂)，CHIR99021 (GSK3-beta抑制剂)， Tranylcypromine (H3K4 去甲基化抑制剂)，和 616452 (TGF-beta 抑制剂)。具体地，一个方面，本发明提供由HDAC抑制剂，GSK3_beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合或它们中的至少两种组成的组合用于诱导多潜能干细胞产生的用途。在一个具体的实施方案中，所述至少两种的组合是GSK3_beta抑制剂和TGF-beta 抑制剂的组合，是由GSK3_beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，是由HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，或是由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂组成的组合。优选地，所述HDAC 抑制剂是 VPA，Butyrate, TSA, Scriptaid 等；所述 GSK3_beta 抑制剂是 CHIR99021，BI0，Gene ID :22416 的 wnt3a 编码的 Wnt3a 蛋白等；所述 TGF-beta 抑制剂是616452，SB431542等；所述H3K4去甲基化抑制剂是tranycypromine和phenelzine寸。
在本发明的另一个方面，提供一种制备诱导多潜能干细胞的方法，包括向分化的细胞中提供诱导因子，所述诱导因子是0ct4和由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta 抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合或它们中的至少两种组成的组合。在一个具体的实施方案中，所述至少两种的组合是GSK3_beta抑制剂和TGF-beta 抑制剂的组合，是由GSK3_beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的 组合，是由HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，或是由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂组成的组合。优选地，所述HDAC抑制剂是VPA， Butyrate, TSA, Scriptaid 等；所述 GSK3_beta 抑制剂是 CHIR99021，BIO, Wnt3a 等；所述 TGF-beta抑制剂是616452，SB431542等；所述H3K4去甲基化抑制剂是tranycypromine和 phenelzine 等。在一个优选的实施方案中，所说方法还使用碱性成纤维细胞生长因子bFGF。在一个具体的实施方案中，所述分化的细胞是皮肤细胞，肝细胞，胃细胞，角质细胞或血液细胞。优选地，所述分化的细胞来源于哺乳动物。更优选地，所述哺乳动物是人、 鼠或灵长类动物。在另一个具体的实施方案中，0ct4是DNA，mRNA或蛋白等形式。优选地，0ct4的序列为SEQ ID NO 1所示的序列。在本发明的另一个方面，提供一种制备诱导多潜能干细胞的试剂盒，包括向分化的细胞中提供的诱导因子，所述诱导因子包括0ct4和由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂， TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合或它们中的至少两种组成的组合。在一个具体的实施方案中，所述至少两种的组合是GSK3_beta抑制剂和TGF-beta 抑制剂的组合，是由GSK3_beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，是由HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，或是由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂组成的组合。优选地，其中所述HDAC抑制剂是VPA，butyrate, TSA等；所述GSK3_beta抑制剂是0111 99021，810，￥壯33(蛋白编码自基因￥壯33，661^10 22416)等；所述TGF-beta抑制剂是 616452，SB431542 等；所述 H3K4 去甲基化抑制剂是 tranycypromine，phenelzine。优选地，0ct4是DNA，mRNA或蛋白等形式。更优选地，0ct4的序列为SEQ ID NO 1所示的序列。在一个优选的实施方案中，所说试剂盒还包含碱性成纤维细胞生长因子bFGF。在本发明的另一个方面，提供利用上述方法或试剂盒制备的多潜能干细胞。对于HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂的用量，对于本领域的普通技术人员而言是可以常规选择的。通常为HDAC抑制剂如 VPA(0. 5mM-3mM) ；H3K4 去甲基化抑制剂如 tranylcypromine (2 μ M) ；GSK3beta 抑制剂如 CHIR99021(2yM-10yM)，TGFbeta 抑制剂如 616452 (2-5μ M-4 μ M)，优选地，VPA 使用 0. ImM-ImM, CHIR99021 使用 0. 5 μ M-IO μ Μ, 616452 使用 0. 5 μ Μ_5 μ Μ, tranylcypromine 使用 0· 5 μ Μ-5 μ Μ。
图1.小分子化合物促进重编程的效率
图 2.用 4 个小分子组合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和单基因 (0ct4)诱导iPS细胞的时间表示意 3.用 4 个小分子组合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和单基因 (0ct4)诱导的iPS原代细胞集落，phase为细胞克隆的形态图，GFP为绿色荧光视野。图 4.用 4 个小分子组合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和单基因 (0ct4)诱导的iPS细胞系经长期传代保持胚胎干细胞的形态，呈AP染色阳性(见图AP)， 并且其整合的P0ct4-GFP报告体系表达绿色(见图GFP)荧光。图phase表示细胞集落的形态图。图 5.用 4 个小分子组合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和单基因(0ct4)诱导的iPS细胞系表达多潜能性标志蛋白，即0ct4, Sox2, Nanog, Utfl, Rexl和 SSEAl。
图 6.用 4 个小分子组合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和单基因 (0ct4)诱导的iPS细胞系中只有0ct4 —个外源重编程基因的整合。0-iPS-la，lb, lc,2a, 2b，3a，3b指单基因(oct4)诱导的不同的iPS细胞系。4F_iPS指4个因子(0ct4，sox2，klf4， c-myc)诱导的iPS细胞系，MEF是未导入外源基因的靶细胞(阴性对照)，H20是RT-PCR实验的无样本阴性对照。图 7.用 4 个小分子组合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和单基因 (0ct4)诱导的iPS细胞系表达干性标志基因。0-iPS-la，lb，lC，2a，2b指单基因(oct4)诱导的不同的iPS细胞系。H2O是RT-PCR实验的无样本阴性对照。图 8.用 4 个小分子组合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和单基因 (0ct4)诱导的iPS细胞系的0ct4，NanOg启动子DNA甲基化水平很低，和胚胎干细胞类似。图 9.用 4 个小分子组合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和单基因 (0ct4)诱导的iPS细胞系基因表达谱和胚胎干细胞接近。0-iPS-la，lb，lC，2a指单基因 (oct4)诱导的不同的iPS细胞系，4F-iPS指4个因子(0ct4, sox2, klf4, c-myc)诱导的iPS 细胞系。图 10.用 4 个小分子组合(VPAjCHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因 (0ct4)诱导的iPS细胞系具有三个胚层组织细胞类型的分化能力。左上软骨组织(中胚层)；右上类神经管和黑素细胞(外胚层)；下图类小肠上皮(内胚层)。4个图中均可见大量肌肉纤维(中胚层)。图 11.用 4 个小分子组合(VPAjCHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因 (0ct4)诱导的iPS细胞系具有囊胚注射产生嵌合小鼠的能力。图 12.用 4 个小分子组合(VPAjCHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和单基因 (0ct4)诱导的iPS细胞系具有囊胚注射产生生殖嵌合的能力。图 13.用 4 个小分子组合(VPAjCHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和单基因 (0ct4)诱导的iPS细胞系经囊胚注射产生的嵌合小鼠的各个组织器官均可检测到供体iPS 细胞的嵌合。其中，泳道1的ICR小鼠尾尖和泳道2的129小鼠尾尖细胞不含有p0ct4-GFP 基因片段，作为阴性对照，泳道3的OG小鼠尾尖细胞和泳道4的OG小鼠胚胎成纤维细胞均含有p0ct4-GFP基因片段，作为实验的阳性对照；泳道5 嵌合鼠肺；泳道6 嵌合鼠尾尖；泳道7 嵌合鼠肝脏；泳道8 嵌合鼠心脏；泳道9 嵌合鼠胃；泳道10 嵌合鼠脑；泳道11 嵌合鼠睾丸；泳道12 嵌合鼠肾脏；泳道13 嵌合鼠脾脏；泳道14 嵌合鼠皮肤；泳道15 水 (PCR阴性对照)。图14.用于诱导单基因(oct4)的iPS的小分子的结构式。图15.用更少的小分子和单基因(0ct4)诱导得到iPS细胞克隆。A.用VC6诱导 MEF细胞成为iPS细胞克隆；B.用VC6诱导成体成纤维细胞成为iPS细胞克隆；C.用C6诱导MEF细胞成为iPS细胞克隆；D.在bFGF存在时，用C6诱导MEF成为iPS细胞克隆。图16.小分子组合在一定浓度范围内均有效诱导iPS细胞。图A中VPA浓度单位为 mM,其余小分子(CHIR99021，616452，tranylcypromine)的浓度单位为 μ M。 图17.成体小鼠的成纤维细胞被0ct4和4个小分子的组合诱导成为iPS细胞。 A 新产生的iPS细胞克隆的形态和GFP荧光图；B 传代培养后的iPS细胞形态，荧光，AP染色，免疫荧光染色结果图。C:成体小鼠成纤维细胞诱导的iPS细胞克隆(Adult-0-iPSla， lb, 2a)经基因组PCR检测确认只有0ct4 —种外源基因的整合。其中0-iPS-la，lb，lc，2a 指单基因(oct4)诱导小鼠胚胎成纤维细胞得到的不同的iPS细胞系。Adult-0-iPS-la，lb， 2a指单基因(oct4)诱导成体小鼠细胞得到的几株不同的iPS细胞系。MEF是未导入外源基因的靶细胞(阴性对照)，H2O是RT-PCR实验的无样本阴性对照。图18.小分子用相同靶点的其它因子替代后得到单oct4诱导的iPS细胞。右列为克隆形态图，左列是GFP荧光下的视野图。a:用Wnt3a(R&D)替代CHIR99021 ;b : butyrate (Tocris)替代VPA得到的iPS细胞克隆。
具体实施例方式以通过实施例进一步举例说明本发明。本领域的普通技术人员可以理解本发明并不限于所述实施例，并且本领域的普通技术人员可以基于说明书的教导对实施例进行修改。这些修改同样包含在本发明由后附的权利要求所定义的本发明的范围内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。在本发明的实施例中，“VPA”用“V”表示；"CHIR 99021，，用“C”或“CHIR，，表示； “616452”用“6”表示；“Tranylcypromine”用“T”表示。例如，“VC6”表示“VPA，CHIR99021 和616452的组合”。实施例1 小鼠品系转基因鼠品系TgN(G0FGFP)lllmeg(简称为 0G)购自 RIKENBioResource Center。 其他小鼠品系ICR，129S2/SvPasCrlVr (简称为129)和C57BL/6NCrlVr (简称为C57)均购自维通利华。细胞培养原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)均来自ICRX0G，129XOG和C57XOG转基因小鼠。MEF和129T细胞培养基为含10%胎牛血清(FBS, Invitrogen)的Dulbecco，s Modified Eagle Medium(DMEM, Hyclone)培养基。小鼠胚胎干细胞系 Rl 禾Π iPS 细胞培养基为80 % DMEM/F12 (Invitrogen), 10 % Knockout serum replacement (KSR) (Invitrogen), 10 % FB S,并包含 ImM L-glutamine, 1 % non-essential amino acids, 0. ImMbeta-mercaptoethanol (S Invitrogen) \)JsR lOOOU/mL Lif (Millipore) 。 /]、 胚胎干细胞系Rl和iPS细胞培养在丝裂霉素C处理后的MEF饲养层细胞上，培养基每天换液。实施例2.慢病毒感染及iPS重编程分别包括oct4(SEQ ID NO 1)，sox2 (SEQ ID NO 2), klf4(SEQ IDNO 3)以及 c-myc (SEQ ID NO 4)的慢病毒载体的构建以及感染方法见(zhao et al.，2008)。用上述分别包含 oct4(SEQ ID NO 1), sox2 (SEQ IDNO :2)，klf4 (SEQ ID NO 3)以及 c_myc(SEQ ID NO 4)的慢病毒载体感染MFF细胞，48小时后换为诱导重编程的培养基。诱导重编程的培养基为 80 % DMEM/F 12 (Invitrogen)，10 % Knockout serum replacement (KSR) (Invitrogen), 10% FBS,并包含 ImM L-glutamine, 1 % non-essential aminoacids, 0. ImM beta-mercaptoethanol, lOOOU/mL Lif以及包含诱导重编程的小分子组合VPA(0. 5mM, Sigma), CHIR99021(3uM, Stemgent)，616452(2uM，Calbiochem)禾口 Tranylcypromine(2uM， Tocris)0为了促进MEF细胞的扩增，在部分实验中，lOng/ml basic FibroblastGrowth Factor (P&A Biotech)在病毒感染后连续8天持续加入。诱导培养基每四天换一次液。GFP 阳性的iPS克隆在病毒感染后30天左右时间挑出，并在小鼠胚胎干细胞基础培养基(即上述小鼠胚胎干细胞系Rl和iPS细胞培养基)内长期培养。实施例3.碱性磷酸酶和组化染色碱性磷酸酶的存在是胚胎干细胞保持未分化状态的一个重要指标，通过检测其的存在与否，可进一步判定胚胎干细胞。胚胎干细胞中含有丰富的碱性磷酸酶(AP)，而已分化的胚胎干细胞AP呈弱阳性或阴性。按照制造商的说明，用Alkaline Phosphatase Detection Kit (Chemicon)检测诱导的多潜能干细胞的碱性磷酸酶(AP)的表达。结果如图4所示。为进一步检测用本发明诱导方法获得的细胞是否真的像形态上所表现出来的一样保持了细胞的未分化状态，使用细胞免疫荧光染色的方法进一步检测IPS细胞内源性干性基因的表达情况。组化染色所用抗体为一抗SSEA-I (1 200, Millipore), 0ct4(l 200， Abeam)， Sox2(l 200， SantaCruz)， Rexl(1 200， Santa Cruz), Nanog(l 40, R&D), Utfl(l 200，Abeam)，。 二抗Rhodamine-Iabeled donkey anti-mouse IgG(1 100, Santa Cruz), Rhodamine-Iabeled donkey anti-rabbit IgG(1 100, Santa Cruz), Rhodamine-Iabeled donkey anti-goat IgG(1 : 100, Santa Cruz), Rhodamine-Iabeled donkey anti-goat IgM(l ； 100， Santa Cruz), Rhodamine-Iabeled goat anti-mouse IgG3 (1 : 100, Santa Cruz)。DAPI (Beyotime)用于染细胞核。见结果部分涉及的图5，图17B。免疫荧光SSEA-1，0ct4, Sox2, Rexl, Nanog和 UTFl的阳性结果证实所得到的细胞克隆确实是具有类似胚胎干细胞特性的iPS细胞。实施例4. DNA甲基化分析用EZ-96DNA 甲基化试剂盒(Zymo Research, Orange County, CA)完成全基因组 DNA亚硫酸钠转化。采用Sequenom，s MassARRAY分析平台进行量化甲基化分析(Kim et al.，2009)。用 EpiDESIGNER 软件(http //www. epidesigner. com)根据扩增的 Naong 序列 (SEQ ID NO 39)及0ct4序列(SEQ ID NO 40)设计PCR引物。检测DNA甲基化情况。1.组织、细胞及血样DNA提取
ν ji M Wizard Genomic DNA purification Kit(Promega) NucleoSpin Tissue(MN)提取组织、细胞或血样中的DNA，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检。质检合格的DNA将浓度调整到50ng/ μ L，_20°C储存备用。2.亚硫酸氢盐转化反应使用EZ 96DNA Methylation Kit (Zymo Research)进行 DNA 的转化。3. PCR 扩增以亚硫酸氢盐转化后的DNA为模板，在384孔板进行PCR扩增反应。每个反应总体积 5 μ L，包含模板 DNA lμL(DNA浓度>5ng//μL)，5U/μL Hotstar Taq 0. 2U，引物每条 lpmol，25mM dNTP，0. 04 μ L，反应条件为 94°C 15 分钟；94°C 20 秒，62°C 30 秒，72°C 1 分钟，45个循环；72°C 3分钟；4°C放置。4. PCR产物纯化PCR 反应产物使用 2yL SAP (shrimp alkaline phosphatase 来自试剂盒)处理， 去除体系中游离的dNTP。反应体系7 μ L，其中PCR产物5 μ L，SAP混合液2 μ L (SAP 0. 3 μ L, RNase-free ddH20 0. 17 μ L)。反应程序 37°C 20 分钟；85°C 5 分钟；4°C放置。5.体外转录及RNase A特异性酶切反应RNase A特异性酶切反应分为T切与C切两种，本实验中使用单独的T切反应。 体外转录与酶切反应同时进行，总体积7μ L反应体系包含SAP处理后PCR产物2 μ L， RNase-free ddH20 3. 15 μ L,5x T7PolymeraseBuffer 0. 89μ L,T Cleavage Mix(来自试齐[J ^ )0. 24μ L, IOOmM DTT, 0. 22 μ L, T7RNA&DNAPolymerase 0. 44 μ L, RNase A 0· 06 μ L0 反应程序为37°C 3小时，4°C放置。6.树脂纯化每个样品中加水20 μ L稀释，震荡混勻，加入6mg Clean Resin树脂纯化10分钟， 3200g离心5分钟。7.芯片点样及质谱检测使用MassARRAY Nanodispenser RS 1000 点样仪(SEQUEN0M)将纯化后产物点至384孔SpectroCHIP (SEQUEN0M)芯片上，将点制好的芯片放入MassARAYCompact System(SEQUENOM)进行检测。SpectroCHIP 芯片使用 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time off light)基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术，检测数据通过EpiTYPER软件(SEQUEN0M)分析并输出结果。见结果部分中涉及的图8。实施例5. RT-PCR检测iPS细胞全RNA用TRIzol提取(Invitrogen)，按照相关操作手册用“EasyScript Reverse Transcriptase" (TransGen Biotech) it 于 RNA β i。 PCR M 2XEasyTaq SuperMix (TransGen Biotech)体系完成。引物见下表。
权利要求
1.由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合或它们中的至少两种组成的组合用于诱导多潜能干细胞产生的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述至少两种的组合是GSK3_beta抑制剂和TGF-beta抑制剂的组合，是由GSK3_beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合， 是由HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，或是由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂组成的组合。
3.权利要求1的用途，其中所述HDAC抑制剂是VPA，butyrate或TSA；所述GSK3_beta 抑制剂是 CHIR99021，BI0 或 Gene ID :2M16 的 wnt3a 编码的 Wnt3a 蛋白；所述 TGF-beta 抑制剂是616452或SB431542 ；所述H3K4去甲基化抑制剂是tranycypromine或phenelzine， 其中 VPA， CHIR99021,616452, tranycypromine, burytrate, TSA, SB431542, BIO 和 phenelzine的结构式如下CHIR 99021
4.一种制备诱导多潜能干细胞的方法，包括向分化的细胞中提供诱导因子，所述诱导因子是0ct4和由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合或它们中的至少两种组成的组合。
5.权利要求4的方法，所述至少两种的组合是GSK3_beta抑制剂和TGF-beta抑制剂的组合，是由GSK3_beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，是由HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，或是由HDAC抑制剂， GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂组成的组合。
6.权利要求4的方法，其中所述HDAC抑制剂是VPA，butyrate或TSA；所述GSK3_beta 抑制剂是 CHIR99021，BI0 或 Gene ID :22416 的 wnt3a 编码的 Wnt3a 蛋白；所述 TGF-beta 抑制剂是616452或SB431542 ；所述H3K4去甲基化抑制剂是tranycypromine或phenelzine， 其中 VPA， CHIR99021,616452, tranycypromine, burytrate, TSA, SB431542, BIO 和 phenelzine的结构式如权利要求3中所示。
7.权利要求4的方法，还使用碱性成纤维细胞生长因子。
8.权利要求4的方法，其中所述分化的细胞是皮肤细胞，肝细胞，胃细胞，角质细胞或血液细胞。
9.权利要求4的方法，其中所述分化的细胞来源于哺乳动物。
10.权利要求9的方法，其中所述哺乳动物是人、鼠或灵长类动物。
11.权利要求4的方法，其中0ct4是DNA，mRNA或蛋白等形式。
12.—种制备诱导多潜能干细胞的试剂盒，包括向分化的细胞中提供的诱导因子，所述诱导因子包括0ct4和由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合或它们中的至少两种组成的组合。
13.权利要求12的试剂盒，还包含碱性成纤维细胞生长因子。
14.权利要求12的试剂盒，所述至少两种的组合是GSK3_beta抑制剂和TGF-beta抑制剂的组合，是由GSK3_beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合， 是由HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，或是由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂组成的组合。
15.权利要求12-14中任一项的试剂盒，其中所述HDAC抑制剂是VPA，butyrate或TSA；所述 GSK3-beta 抑制剂是 CHIR99021，BI0 或 GeneID 22416 的 wnt3a 编码的 Wnt3a 蛋白；所述TGF-beta抑制剂是616452或SB431542 ；所述H3K4去甲基化抑制剂是tranycypromine ■ phenelzine，胃中 VPA, CHIR99021,616452, tranycypromine, burytrate, TSA, SB431542, BIO和phenelzine的结构式如权利要求3中所示。
16.权利要求12的试剂盒，其中0ct4是DNA，mRNA或蛋白等形式。
17.权利要求4-11任一项的方法或权利要求12-16任一项的试剂盒制备的多潜能干细胞。
全文摘要
本发明提供了一种制备诱导多潜能干细胞的方法。在体细胞中加入4个小分子化合物的组合(HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂)或其中至少两个小分子化合物的组合(例如GSK3-beta抑制剂和TGF-beta抑制剂)，可在只导入一个转录因子(Oct4)的情况下，诱导产生诱导多潜能干细胞(iPS细胞)。
文档编号C12N5/074GK102260646SQ20101029698
公开日2011年11月30日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年5月26日
发明者尹晓磊, 张蔷, 时艳, 李艳琴, 赵扬, 邓宏魁 申请人:北京大学, 北京瑞普晨创科技有限公司