专利名称：Ii型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物新技术领域，尤其涉及一种II型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用。
背景技术：
断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)是1997年在加拿大首先发生一种新的猪病，表现进行性消瘦、呼吸困难、皮肤苍白、腹泻、黄疸。1998年，Ellis等首次分离到该病的病原，为II型猪圆环病毒(PCV2)。郎洪武等(2000)对北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南7省(市)22个猪群的559份血清检测表明，PCV2总阳性率为42.9％。周继勇等对浙江省杭州地区28个猪场采集了1677份猪血清，用IFA试验检测血清中PCV2抗体，结果PCV2抗体总阳性率为57.25％，表明PCV2在我国的流行情况也比较严重。PMWS对养猪业造成重大经济损失，PCV2是疫苗的研制成为急需解决的问题。
常规疫苗包括灭活苗或弱毒苗，但由于PCV2在细胞培养中不产生细胞病变，难以产生高滴度的病毒粒子，用常规技术制备PCV2疫苗十分不便，至今尚无II型猪圆环病毒常规疫苗可用。核酸免疫是一种新型的免疫技术，它是将编码抗原基因的表达性载体通过肌肉注射的方法给予动物，诱导机体产生免疫应答。
细胞因子佐剂对核酸疫苗的增强作用越来越受到人们的重视，根据产生的Th细胞亚群的不同，细胞因子可分为Th1型细胞因子(IL-2，IFN-γ，IL-12，IL-15，IL-18)和Th2型细胞因子(IL-4，IL-5，IL-6，IL-10)两类。细胞因子基因佐剂的应用对核酸免疫技术起了巨大的推动作用，能有效克服某些核酸疫苗免疫效力不足问题。IL-2和IFN-γ是常见的Th1型细胞因子，IL-4是常见的Th2型细胞因子，可以作为基因佐剂来增强PCV2核酸疫苗的免疫效力。我们用真核表达载体pCI-neo构建的PCV2基因、猪细胞因子、以及融合表达载体，转染PK-15细胞后，经间接免疫荧光(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)或Westernblot检测，证明能在PK-15细胞中表达。在此基础上，将其作为核酸疫苗分别免疫4-6周龄猪，发现能诱导产生针对PCV2的体液免疫和细胞免疫反应。表明我们构建的真核表达质粒可作为核酸疫苗来使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种II型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用。
制备方法为1)设计特异性引物，以PCV2杭州株(HZ0201)的基因组为模板，通过PCR的方法克隆PCV-2的ORF1、ORF2、ORF3和ORF4基因，与pCI-neo构建为真核表达载体；2)分离猪外周血单个核细胞，通过RT-PCR方法克隆猪IFN、IL-2和IL-4基因，并与pCI-neo构建为真核表达载体；3)以上述重组载体为基础，分别构建PCV2 ORF2与PCV2的其它基因或与猪细胞因子基因的融合表达载体；所构建的核酸疫苗免疫小鼠后，能诱导机体产生针对PCV2的体液免疫及细胞免疫反应。
所构建的核酸疫苗免疫仔猪后，能诱导机体产生针对PCV2的体液免疫及细胞免疫反应。
本发明的优点(1)不需培养病毒，生产周期短；(2)不需细胞培养，有效防止其它猪源病毒的污染；(3)不表达对机体有害的致病蛋白，安全性高；(4)可同时激活体液免疫与细胞免疫应答；
图1，真核表达载体pCI-neo的结构示意图；图2，pCI-PCV2-ORF1重组质粒的鉴定，1.MluI和SalI双酶切，切出约945bp大小片段；2.以F1P1/F1P2作为引物的PCR产物960bp；3.以PC1/PC2作为引物的PCR产物1045bp；M.DNA marker；图3，猪IFN-γ、IL2、IL4基因的RT-PCR结果，分别扩增出大小为501bp、465bp、402bp的特异性条带；M.DNA marker；图4，pCI-pIL2重组质粒的鉴定，1.MluI和SalI双酶切约465bp；2，3.以PIL21/PIL22为引物的PCR产物约480bp；4.以PC1/PC2为引物的PCR产物约587bp；M.DNA marker；图5，pCI-pIL4重组质粒的鉴定，1.MluI和SalI双酶切约412bp片段；2.以PIL41/PIL42为引物的PCR产物约420bp；3.以PC1/PC2为引物进行的PCR产物约524bp；M.DNA marker；图6，pCI-pIFN重组质粒的鉴定，1.MluI和SalI双酶切约507bp；2.以IF1/IF2为引物的PCR产物519bp；3以PC1/PC2为引物的PCR产物约597bp；M.DNAmarker；图7，pCI-PCV2-ORF1转染细胞的IFA检测(200×)，以猪PCV2多抗血清为一抗、FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，IFA法检测转染48h后的PK15，发现细胞的胞浆中呈现特异性的荧光染色；图8.pCI-PCV2-ORF2转染细胞的IFA检测(200×)，以猪PCV2多抗血清为一抗、FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，IFA法检测转染48h后的PK15，发现细胞的胞浆中呈现特异性的荧光染色。
具体实施例方式
本发明所说PCV2 ORF2与PCV2其它基因的融合表达载体的构建是将PCV2ORF2与PCV2 ORF1、ORF3、ORF4基因相连接，并亚克隆于真核表达载体pCI-neo，构建重组质粒pCI-PCV2-ORF2-ORF1、pCI-PCV2-ORF2-ORF3、pCI-PCV2-ORF2-ORF4作为PCV2核酸疫苗。
PCV2 ORF2与猪细胞因子基因的融合表达载体构建是将PCV2 ORF2与猪IFN-γ、IL-2、IL-4基因相连接，并亚克隆于真核表达载体pCI-neo，构建重组质粒pCI-PCV2-ORF2-pIFN、pCI-PCV2-ORF2-pIL2、pCI-PCV2-ORF2-pIL4作为PCV2核酸疫苗。
本发明性能的测定1)将纯化的重组质粒，用脂质体转染PK15细胞，转染后收集培养不同时间(24h、48h、72h)的细胞上清液进行ELISA检测或活性试验，对培养48h后的细胞进行IFA或Western blot检测，证明重组载体在真核细胞中的可以正确表达。
2)用制备重组载体免疫6-8周龄BALB/C雄鼠，间隔2周免疫三次，证明重组质粒可诱导机体产生针对PCV2的体液免疫及细胞免疫反应。
3)用制备的重组载体免疫4-6周龄仔猪，间隔2周免疫3次，证明重组质粒可诱导机体产生针对PCV2的体液免疫及细胞免疫反应，同时对猪无致病性。
实施例1II型猪圆环病毒核酸ORF1~ORF4真核表达载体的构建根据PCV2毒株HZ0201的基因序列，分别设计PCV2 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4基因的特异性引物，引物序列如下PCV2 ORF1基因引物f1p1ATAACGCGTCATGCCCAGCAAGAAGf1p2GCGGTCGACGACTCAGTAATTTATTTCATATGGPCV2 ORF2基因引物
f2ms1GCGGTCGACTCATTAAGGGTTAAGTGGGf2ms2TATACGCGTTTATGACGTATCCAAGGAGGPCV2 ORF3基因引物f3P1TAAGTCGACCTTACTGATGGAGTGTGGf3P2ATAACGCGTATGGTAACCATCCCACPCV2 ORF4基因引物f4P1TATGTCGACTCTCAGGGACAACGGf4P2ATAACGCGTCAATGACGTGTACATTAGTCT以上的上、下游引物分别引入MluI和SalI位点。
同时根据pCI-neo载体序列，在其多克隆位点附近分别设计上下游引物，用于重组载体的鉴定PC1GAGTACTTAATACGACPC2CGAAGCATTAACC以抽提的PCV2基因组DNA为模板，扩增PCV2的以上基因。PCR程序为95℃变性10min，后按95℃ 1min，48℃ 1min，72℃ 90sec进行30个循环，最后72℃延伸10min。
用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并回收纯化分别为945bp、702bp、315bp、180bp的特异性片段，用MluI和SalI双酶切，与同样经MluI和SalI双酶切并回收纯化的pCI-neo载体用T4 DNA连接酶进行连接反应，转化E.coliTOP10感受态细胞，在含Amp的LB培养基平板上挑取阳性克隆，经酶切、PCR和测序鉴定，正确构建pCI-PCV2-ORF1、pCI-PCV2-ORF2、pCI-PCV2-ORF3、pCI-PCV2-ORF4真核表达载体。
实施例2猪IL2、IL4和IFN-γ真核表达载体的构建采取健康大约克猪血10ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，后悬浮于RPMl1640综合培养基中，将细胞悬液稀释至2×106/ml，加conA终浓度至10mg/ml，置于细胞培养板中，CO2培养箱中37℃培养48h。然后取培养细胞用Trizol Reagent提取总RNA。根据已发表的猪IL2、IL4和IFN-γcDNA序列，设计上下游引物猪IL2引物PIL21ATAACGCGTCAATGTATAAGATGCAGPIL22TCAGTCGACTTATCAAGTCAGTGTTG猪IL4引物
PIL41ATAACGCGTGCTCTATTCATGGGPIL42TATGTCGACTTCAACACTTTGAGTAT猪IFN-γ引物IF1ATAACGCGTACAATGAGTTATACAACIF2TAGGTCGACACAATTATTTTGATGCT以上的上、下游引物分别引入MluI和SalI位点。
按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书，以Olig(dT)18为引物，M-MuLV逆转录酶作用下反转录合成猪IL-2 cDNA第一链；反转录产物在94℃ 40s，45℃ 40s，72℃ 50s的条件下进行PCR扩增，共30个循环。最后72℃延伸10min，PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析并回收，应分别扩增出大小为465bp、402bp、501bp的特异性条带。用MluI和SalI双酶切RT-PCR扩增产物，与同样经MluI和SalI双酶切回收纯化的pCI-neo载体连接，转化E.coli TOP10感受态细胞，在含Amp的LB培养基平板上挑取阳性克隆。经酶切、PCR和测序鉴定，正确构建pCI-pIL2、pCI-pIL4和pCI-pIFN真核表达载体。
实施例3PCV2 ORF2与PCV2其它基因的融合表达载体构建设计引物，以PCV2基因组为模板，通过PCR方法扩增PCV2 ORF2基因，扩增产物用XhoI和MluI双酶切，与同样酶切的pCI-PCV2-ORF1、pCI-PCV2-ORF3、pCI-PCV2-ORF4载体相连，构建为pCI-PCV2-ORF2-ORF1、pCI-PCV2-ORF2-ORF3、pCI-PCV2-ORF2-ORF4融合表达载体。
PCV2 ORF2的扩增引物分别为pCI-PCV2-ORF2-ORF1f2xm1TCTCTCGAGTATGACGTATCCAAGGAGGCf2xm21TAGACGCGTAAAGGGTTAAGTGGGGGGTpCI-PCV2-ORF2-ORF3f2xm1TCTCTCGAGTATGACGTATCCAAGGAGGCf2xm20TAGACGCGTAGGGTTAAGTGGGGGGTpCI-PCV2-ORF2-ORF4f2xm1TCTCTCGAGTATGACGTATCCAAGGAGGCf2xm22TAGACGCGTAAGGGTTAAGTGGGGGGTPCR程序为95℃变性10min，后按94℃ 40s，52℃ 40s，72℃ 50s进行35个循环，最后72℃延伸10min。
实施例4PCV2 ORF2与猪细胞因子基因的融合表达载体构建设计引物，以PCV2基因组为模板，通过PCR方法扩增PCV2 ORF2基因。将扩增产物用XhoI和MluI双酶切，与同样酶切的pCI-pIL2、pCI-pIL4、pCI-pIFN载体连接，构建为pCI-PCV2-ORF2-pIL2、pCI-PCV2-ORF2-pIL4、pCI-PCV2-ORF2-pIFN融合表达载体。
构建pCI-PCV2-ORF2-pIL2的扩增引物同pCI-PCV2-ORF2-ORF4，为f2xm1/f2xm22；构建pCI-PCV2-ORF2-pIL4、pCI-PCV2-ORF2-pIFN的扩增引物同pCI-PCV2-ORF2-ORF3，为f2xm1/f2xm20，PCR程序同实施例3。
实施例5重组表达载体在真核细胞中的表达检测以1ug纯化质粒加2ul Invitrogen公司的Lipofectamine Reagent转染试剂，按说明书转染2×105PK15细胞。为检测PCV2 ORF1、ORF2、ORF3和ORF4及其融合表达产物，分别以PCV2 ORF1~4特异性单抗和PCV2病毒多抗为一抗，按常规进行间接免疫荧光(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)或Western blot，检测PCV2 ORF1~4编码产物在真核细胞中的表达。为检测猪IL2、IL4和IFN-γ基因及其融合表达产物，分别以猪IL2、IL4和IFN-γ特异性单抗为一抗，按常规进行IFA试验，检测以上猪细胞因子基因在真核细胞中的表达。检测结果表明，所构建的重组载体均能在真核细胞中正确表达。
实施例6重组猪IL2、IL4的生物学活性检测用MTT法检测PK15细胞表达的重组pCI-pIL2、pCI-pIL4的生物学活性分离猪外周血单个核细胞(PBMC)，制备1×106~5×106悬液，加conA至终浓度20μg/ml，分装于96孔板中，诱导培养3-5天后，每孔加入100μl倍比稀释的PK15细胞培养上清，每个样品设3-5个重复，继续培养72h，加入5mg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4h。每孔加入100μl含0.04mol/LHCl的异丙醇，置培养箱恒温反应2小时，取出细胞培养板，室温下放置20min，用酶联仪测定A490光密度值。表明重组猪IL2、IL4具有生物学活性。
实施例7PCV2核酸疫苗对小鼠的免疫效果检测大规模制备质粒，紫外分光光度法测定DNA含量和纯度，调整DNA浓度为1mg/ml。免疫6-8周龄BALB/C雄鼠，方法为后肢股四头肌每侧各肌注7.5g/L的布比卡因10μl，72h后每侧注射重组质粒50μl，即100μg质粒/只，每组6只-10只。每隔2周按相同方法注射相同剂量，共免疫三次。同时设空载体组作对照。免疫结束后第二周分别通过淋巴细胞增殖试验(LPA)、T淋巴细胞介导的细胞毒试验(CTL)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测免疫鼠的细胞免疫及体液免疫应答。检测结果表明免疫鼠可产生针对PCV2的特异性细胞免疫及体液免疫反应。
淋巴细胞增殖试验(LPA)的具体过程基因免疫结束后第2周，取免疫小鼠的脾脏，制备脾淋巴细胞悬液，将细胞浓度调整为1×I06/ml，加入96孔板，每孔200ul，加入纯化的PCV2和ORF2蛋白进行刺激(另设空白对照)，每样平行三孔。37℃，5％CO2条件下培养68h后，每孔中加入5mg/mlMTT溶液20ul，37℃下5％CO2培养箱中继续培养4h，小心吸弃孔内培养上清，加入DMSO150ul/孔，振荡10min，测定各孔OD490值，计算增殖指数。增殖指数抗原刺激组OD490值/空白对照组值OD490值。
T淋巴细胞介导的细胞毒试验(CTL)的具体过程基因免疫结束后第2周进行检测，在24孔培养板中加入2×I07/ml免疫鼠脾细胞悬液0.25ml，同时加入1ml RPM 11640培养液，置37℃5％条件下培养5d，收集细胞，洗2次，计活细胞数，调成5×I06/ml作为效应细胞备用。将接种PCV2的，处于对数生长期的PK15细胞，清洗2次，消化，悬浮为2×I05个/mL作为靶细胞。96孔培养板中加入效应细胞100μl和靶细胞100μl，每个样本设3个复孔。并设效应细胞自然释放孔、阴性对照(不加效应细胞)、最大释放孔(用100μl 1％NP40代替效应细胞)。37℃5％条件下培养6h后取出。200×g离心培养板10min，每孔吸100μl上清液，对应加入另一块96孔酶联检测板中，每孔加入新配制的LDH底物混合液100μl，，室温放置20min。在酶标仪上测各孔的OD值，检测波长为492nm，参考波长为650nm。特异性杀伤活性(细胞毒)的计算先将3个复孔的OD值计算平均值，然后按计算细胞毒百分数细胞毒％＝(试验孔OD值—靶细胞自然释放孔OD值/最大释放孔OD值—靶细胞自然释放孔OD值)×100％.
实施例8PCV2核酸疫苗对猪的免疫效果检测大规模制备质粒，免疫4-6周龄、PCV2抗体阴性猪，每只猪注射相应质粒200μg，免疫程序为间隔2周免疫3次，同时设空载体组作对照。首免后每周采血，通过ELISA检测血清中PCV2抗体效价；同时首次免疫后每周采血，通过流式细胞仪计数血液中的CD4+、CD8+T细胞的变化；免疫结束后第2周，取免疫猪的脾脏，检测淋巴细胞增殖活性(LPA)和T淋巴细胞介导的细胞毒(CTL)作用。结果表明PCV2核酸疫苗能有效介导机体对PCV2的特异性免疫反应。
实施例9PCV2核酸疫苗对猪的安全性试验为检测PCV2 ORF1~4核酸疫苗对猪是否安全，基因免疫后观察猪的精神状态、采食、体温、体重等变化；免疫结束后取实验猪的腹股沟淋巴结进行组织组织学检查，并用免疫组化(IHC)检测淋巴组织中的PCV2编码蛋白的分布。
结果表明PCV2核酸疫苗对猪的精神状态、采食、体温、体重等无明显影响，不产生明显组织学病变，有较高安全性。
权利要求
1.一种猪II型圆环病毒核酸疫苗的制备方法，其特征在于方法的步骤为1)设计特异性引物，以PCV2杭州株(HZ0201)的基因组为模板，通过PCR的方法克隆PCV-2的ORF1、ORF2、ORF3和ORF4基因，与pCI-neo构建为真核表达载体，以PCV2 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4基因作为PCV2核酸疫苗的基本组成部分；2)分离猪外周血单个核细胞，通过RT-PCR方法克隆猪IFN、IL-2和IL-4基因，并与pCI-neo构建为真核表达载体，以猪IFN-γ、IL-2、IL-4基因作为基因佐剂；3)以上述重组载体为基础，分别构建PCV2 ORF2与PCV2的其它基因或与猪细胞因子基因的融合表达载体。
2.根据权利要求1所述的一种猪II型圆环病毒核酸疫苗的制备方法，其特征在于所说PCV2 ORF2与PCV2其它基因的融合表达载体的构建是将PCV2 ORF2与PCV2 ORF1、ORF3、ORF4基因相连接，并亚克隆于真核表达载体pCI-neo，构建重组质粒pCI-PCV2-ORF2-ORF1、pCI-PCV2-ORF2-ORF3、pCI-PCV2-ORF2-ORF4作为PCV2核酸疫苗。
3.根据权利要求1所述的一种猪II型圆环病毒核酸疫苗的制备方法，其特征在于所说PCV2 ORF2与猪细胞因子基因的融合表达载体构建是将PCV2 ORF2与猪IFN-γ、IL-2、IL-4基因相连接，并亚克隆于真核表达载体pCI-neo，构建重组质粒pCI-PCV2-ORF2-pIFN、pCI-PCV2-ORF2-pIL2、pCI-PCV2-ORF2-pIL4作为PCV2核酸疫苗。
4.一种猪II型圆环病毒核酸疫苗的应用，其特征在于所构建的核酸疫苗免疫小鼠后，能诱导机体产生针对PCV2的体液免疫及细胞免疫反应。
5.一种猪II型圆环病毒核酸疫苗的应用，其特征在于所构建的核酸疫苗免疫仔猪后，能诱导机体产生针对PCV2的体液免疫及细胞免疫反应。
全文摘要
本发明公开了一种II型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用。制备方法为1)设计特异性引物，以PCV2杭州株(HZ0201)的基因组为模板，通过PCR的方法克隆PCV－2的ORF1、ORF2、ORF3和ORF4基因，与pCI－neo构建为真核表达载体；2)分离猪外周血单个核细胞，通过RT－PCR方法克隆猪IFN、IL－2和IL－4基因，并与pCI－neo构建为真核表达载体；3)以上述重组载体为基础，分别构建PCV2 ORF2与PCV2的其它基因或与猪细胞因子基因的融合表达载体；本发明的优点(1)不需培养病毒，生产周期短；(2)不需细胞培养，有效防止其它猪源病毒的污染；(3)不表达对机体有害的致病蛋白，安全性高；(4)可同时激活体液免疫与细胞免疫应答。
文档编号A61K39/12GK1579553SQ200410018528
公开日2005年2月16日 申请日期2004年5月18日 优先权日2004年5月18日
发明者周继勇, 申会刚, 郭军庆 申请人:浙江大学