一种猪圆环病毒样颗粒及其疫苗和制备方法

一种猪圆环病毒样颗粒及其疫苗和制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪圆环病毒样颗粒(VLP)及其疫苗和制备方法，病毒样颗粒由2型猪圆环病毒的主要结构蛋白-核衣壳蛋白组成，可以激发细胞及体液免疫应答，可以作为病毒样颗粒疫苗(VLP疫苗)免疫不同动物群，使用后可以安全、有效的防治PCV-2感染；VLP可以通过加入或不加佐剂制备成注射剂型、滴鼻剂型、饮水剂型，为不同种群的母猪、小猪、育肥猪安全、有效免疫防控PCV-2感染提供了理想的疫苗。
【专利说明】一种猪圆环病毒样颗粒及其疫苗和制备方法
发明领域
[0001]本发明属于生物制药领域，涉及一种猪圆环病毒样颗粒，特别涉及一种病毒样颗粒疫苗及其疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是一种导致猪群免疫力下降的病毒,并与猪断奶后多系统衰弱综合症(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)、猪皮炎及肾病综合症(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome,F1DNS)、猪繁殖障碍(Porcine reproductive failure)、猪呼吸道疾病综合征(Porcine Respiratory DiseaseSyndrome,PRDC)、猪增生性坏死性肺炎(Porcine Necrotizing Pneumonia,PNP)、猪先天性振颤(Porcine Congenital Tremor,CT)等多种疾病有着联系。PCV是1974年在一种体外培养的猪肾细胞系PK-15中首次发现的，当时认为是一种细胞培养的污染物，因为其并不具有导致细胞病变等典型的病毒样作用，所以称为小病毒样核酸污染物。随后陆续有报道指出这种小病毒样核酸污染物其实是一种病毒，这种病毒是一种小型无包膜的12面体病毒，核心包含一个单股环状DNA基因组，不导致动物发病及传代培养的细胞发生病变，并正式将其命名为猪圆环病毒。1994年Hines等人首先报道了在患有先天性振颤(CongenitalTremor)的仔猪中发现了 PCV样病毒(PCV-1ikeVirus)，1995年Allan等人也在几例猪的死产的(Stillborn)死胎中发现了 PCV的抗体，这将PCV与各种疾病联系到了一起。之后对PCV的报道渐渐指向了一种分离自病猪而不是细胞培养物的“新型猪圆环病毒(NovelPCV) ”。随着对这种新型PCV的研究逐渐深入，发现从基因组到血清型都与传统的PCV存在差异，随之国际上将这种新型的、可以致病的猪圆环病毒命名为2型猪圆环病毒(PCV-2)，同时将细胞培养物中发现的非致病性猪圆环病毒命名为I型猪圆环病毒(PCV-1)。
[0003]在临床中，PCV-2主要感染5-12周龄的小猪，病猪表现为生长缓慢、被毛粗乱、营养不良、呼吸困难、黄 胆、粘膜苍白，可成为僵猪，严重可导致死亡。有证据表明，PCV-2的致病性主要是由于其对免疫系统的损伤造成的，研究发现，感染PCV-2的病猪淋巴细胞会发生明显减少。Darwich等报道，患有猪断奶后多系统衰弱综合症(PostweaningMultisystemic Wasting Syndrome, PMWS)的病猪出现 CD3+、CD4+T 淋巴细胞减少，CD8+T淋巴细胞没有发生明显变化，而典型的由PCV-2感染而引起PMWS病症的患猪出现了⑶8+T淋巴细胞的减少。而且有证据表明PCV-2在淋巴器官中的数量与患猪淋巴细胞的消耗以及外周血中IgM及⑶8+T淋巴细胞的减少有着直接的关系。Nielsen等人报道，患猪在PCV-2感染10天后淋巴细胞开始减少，在第14天时出现显著下降，且这种下降会一直持续到患猪死亡。而且通过试验证实，所有的T淋巴细胞亚群都会由于PCV-2的感染而出现数量上的减少。Sarli等人报道，PCV-2对淋巴细胞的消耗还包括树突状细胞和B淋巴细胞，同时Chianini等人根据B淋巴细胞及T淋巴细胞数量的下降程度，将其分为轻度损伤、中度损伤以及重度损伤，其中重度损伤可致淋巴细胞彻底消失。这充分说明了 PCV-2的感染可导致免疫机能下降，同时也为患猪由于PCV-2的感染并与其他病原体的并发感染而导致诸如PMWS—类疾病的发生提供了理论依据。研究发现，PCV-2的感染通常伴随猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、衣原体(Chlamydia spp.)、肺曲霉病(pulmonaryaspergillosis)、隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)等共同感染而引起疾病的发生。其中PCV-2感染作为主要病因的疾病是猪断奶后多系统衰弱综合症(PostweaningMultisystemic Wasting Syndrome, PMWS)，在 PCV-2 感染的同时通常伴随有 PRRSV 及 PPV的感染，而且在实验室中PCV-2的单独感染也可造成PMWS的典型症状。
[0004]PCV-2是一类无包膜、十二面体、包含一个单股环状DNA基因组的、目前发现最小的病毒，直径17nm，与鸡贫血病毒(cAV)、鹦鹉喙羽病毒(PBFDAV)等共属于圆环病毒科，圆环病毒属。有证据表明PCV与来自植物的矮小病毒(Nano Virus)亲缘关系非常接近，推测PCV是植物病毒侵染脊椎动物后发生重组与突变而发生的宿主迁移。PCV-2在pH3环境、氯仿处理及56-70°C内都有活性。PCV-1基因组全长1759nt、PCV-2基因组全长1768nt，PCV_l编码7个开放阅读框(ORF)，PCV-2有11个潜在开放阅读框(ORF)，编码2_36kD的蛋白质，但只有6个ORF得到证实。其中主要的ORF有三个，分别是0RF-1、0RF-2和0RF-3，0RF-1编码复制酶(REP)，0RF-2编码PCV-2的主要结构蛋白(CAP)，同时也是主要免疫原性蛋白，0RF-3编码蛋白与PCV-2介导的细胞凋亡有直接关系。另外，基于CAP蛋白核酸序列的生物信息学分析，可将PCV-2分为PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c三个亚型。有文献报道，在中国发生的PCV-2感染主要集中在PCV-2b亚型，但FangWang等人报道，在中国还存在PCV-2a、PCV_2d、PCV-2e亚型的感染，而且PCV-2d、PCV-2e两个亚型是2009年FangWang等人首次在中国发现的。
[0005]疫苗是防治PCV-2感染的有效手段，目前已经面世的针对PCV-2的疫苗主要包括灭活疫苗CIRCOVACs、重组病毒疫苗Suvaxyn Pcv20ne Dose?、以及亚单位疫苗CIRCUMVENT*及Ingclvac CIRCOFLX*等，但都有相对不足之处。如灭活苗CTRCOVAC:*除去常规灭活苗的缺陷外，还存在PCV-2培养困`难，且耗费过大等问题。而重组病毒疫苗Suvaxyn Pcv20ne Dose?是将来自具有致病性PCV-2的Cap蛋白与来自非致病性PCV-1的其他蛋白重组而成的重组病毒，因为PCV-1仍然具有使淋巴细胞数量下降得特点，Opriessnig等人报道，免疫机能的下降会造成其他疫苗免疫的失败，尤其在PRRSV疫苗的使用上体现的格外明显，这使疫苗使用的不安全性大大增加，另外有报道显示，重组病毒疫苗很容易被来自母源的抗体所综合，而导致疫苗效果下降。另外亚单位疫苗虽然具有较高的安全性，但由于临床多采用母猪免疫而利用母源抗体来预防仔猪感染，而母源抗体一般在5-8周将下降到很低，对于仔猪的保护效率还缺乏更多的统计数据。在另一方面，目前商品化的疫苗所采用的佐剂仍不理想，如C1RC0V4CR采用矿物油佐剂、SuvaxynPcv20ne Dose*.采用SL-CD水质佐剂、CIRCUMVENT和和丨ngelvac CmCOFLX*都采用水质佐剂。众所周知，用于猪喘气病(MPS)疫苗中的矿物油佐剂可以激发PCV的复制，从而导致PCV-2感染而使病情加重并复杂化，同时2004年Resendes等人对目前常用佐剂都作了调查，结果明确指出，目前缺乏一种有效的佐剂以应用在PCV-2疫苗的开发上，且所应用的佐剂都不能有效的提高疫苗的效力。因此克服目前PCV-2活苗、灭活苗、以及基因工程疫苗的低安全性、低保护力等缺点，同时寻求新的佐剂、研发一种安全、高效、非复制的病毒疫苗，在能较好地保护PCV-2攻击的同时，并能较好地避免共同感染和继发感染的发生，是安全、有效免疫防控PCV-2的重大科学课题。
[0006]病毒样颗粒(Virus-like pratical, VLP)是由病毒主要结构蛋白组成不含病毒核酸的病毒粒子空壳。由于VLP大小、结构及表面抗原和多肽表位与真正的病毒几乎没有区别，因此能被宿主抗原提呈细胞所识别，引起免疫应答和效应，且无潜在的副作用。首先，与活苗及灭活苗相比，病毒样颗粒疫苗没有不安全因素；与亚单位疫苗相比，VLP是多个抗原蛋白组成，具有很强的免疫原性；与有良好口碑的病毒体(Virosome)相比，VLP既不是由活病毒制备而来，没有潜在的危险性、也不需要大量的繁殖病毒，没有安全性低、成本高以及制备周期长等不足；由此VLP疫苗被当今誉为病毒类疫苗发展的新里程碑。目前的乙肝VLP 疫苗(Recombivax HB, Merck)、乳头瘤 VLP 疫苗(Gardi si I, Merck)和流感 VLP 疫苗已上市，戊型VLP疫苗等多个品种在临床研究中。目前，未见有关PCV-2VLP疫苗的报道，因此急需一种可以组装VLP的抗原，在与佐剂混合后能诱导实验动物良好的免疫应答。

【发明内容】

[0007]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种猪圆环病毒的病毒样颗粒；本发明的目的之二在于提供含病毒样颗粒的疫苗；本发明的目的之三在于提供病毒样颗粒的制备方法。
[0008]为实现上述发明目的，技术方案为:
[0009]1.一种猪圆环病毒的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由猪圆环病毒的核衣壳蛋白组成。
[0010]优选的，所述核衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.1?15所不。
[0011]优选的，所述核衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.16?30所示。
[0012]2.含有所述病毒样 颗粒的疫苗。
[0013]优选的，所述疫苗为注射剂、滴鼻剂或饮水剂型。
[0014]更优选的，所述疫苗的佐剂为纳米铝、氢氧化铝或磷酸铝、水凝胶、季胺化的壳聚糖或重组不耐热性肠毒素中的一种或多种。
[0015]3.所述病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤:将编码猪圆环病毒核衣壳蛋白的核苷酸构建重组真核表达载体，然后将重组真核表达载体转化表达细胞，培养后将培养物经纯化即得病毒样颗粒。
[0016]更优选的，所述真核表达载体为pET32a载体，p0PI3CAT载体，pCAGGS载体，pcDNA6/TR 载体或 pCMV-HA 载体。
[0017]更优选的，所述表达细胞为UMNSAH/DF-1细胞，分离9_10龄禽成纤维细胞，PK-15细胞，VERO细胞，COS细胞，人二倍体细胞，BHK细胞，CHO细胞，MDCK细胞，H印-G2细胞，Tn5细胞或SF9Cell细胞。
[0018]最优选的，培养物的纯化方法为:收集细胞培养液，4°C、5000rmp条件下离心IOmin,取上清液于100000g、4°C条件下离心2小时,沉淀用HNE buffer悬浮，HNE buffer的组成为25mM Tris-HCl pH7.4,150mM NaCl,5mM EDTA ;然后将悬液进行蔗糖梯度离心，鹿糖采用HNE buffer配制，体系采用0.3g/mL鹿糖3mL, 0.45g/mL鹿糖3mL, 1.37g/mL蔗糖lmL，然后与4°C、IOOOOOg条件下离心2h，收集中间层，并用折射仪测量密度；用pH6.5-7.5的PBS平衡Sepharose6FFTM介质进行凝胶层析纯化,收集外水体积流穿峰；再采用DEAE-S印haroseFFTM介质进行离子交换层析，平衡液为pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5M氯化钠、pH6.5-7.5的PBS，纯化后液体即为病毒样颗粒。
[0019]本发明的有益效果:本发明涉及一种猪圆环病毒样颗粒，由猪圆环病毒的主要结构蛋白组成，也是主要表面抗原CAP，可以激发良好双重的细胞及体液免疫应答；经形成的VLP抗原加入或不加入佐剂制备的注射剂型、滴鼻剂型、饮水剂型免疫接种不同动物群体后，可安全、有效预防PCV-2感染，为不同种群母猪、小猪、育肥猪安全、有效免疫防控PCV-2感染提供了理想疫苗。
[0020]本发明进行了药效实验，分别通过注射、滴鼻、饮水等途径免疫小猪与怀孕母猪产生好的体液免疫与细胞免疫应答及天然免疫与获得性免疫应答以及黏膜免疫应答效果，免疫动物后，没有发现免疫损伤或由疫苗接种而导致的发病迹象，具有安全性；本发明猪圆环病毒样颗粒疫苗免疫无PCV-2免疫背景的小猪、母猪与育肥猪两次，进一步通过PCV-2a、PCV-2b、PCV-2e、PCV_2d型毒株以及我国不同地区临床分离的PCV-2野株攻毒，有95%以上的免疫保护效果；用本发明猪圆环病毒样颗粒疫苗接种不同地区、种群的母猪、小猪，0，21天免疫两次，分别采用注射、滴鼻、饮水剂型疫苗免疫，均显示各地区、各种群母猪、小猪没有出现由疫苗接种引发的发病现象，具有安全性。
[0021]将VLP与纳米铝混合后能较好地增强免疫源性，并不会导致PCV-2病毒复制的加剧，由此表明研发的猪圆环病毒样颗粒疫苗在含有或不含有佐剂、特别含有新型纳米铝佐剂的情况下，对不同地区、种群的猪群都具有较好的免疫保护效果。
【具体实施方式】
[0022]对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0023]实施例1制备猪圆环病毒样颗粒疫苗的表达载体
[0024]以来自 PCV-2b 的耵-耶、0)、0)15、8了0401、冊0402、1\104、2了0401、1\105、冊0601、CQ08、HuB08、LN08、HN08、SC07和JX0601亚型的CAP蛋白的核苷酸，其中BJ-HB亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；OT-TS亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；BJ0401亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示；HB0402亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示；TJ04亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示；ZJ0401亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示；TJ05亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示；HB0601亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示；CQ08亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示；HuB08亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示；LN08亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示；HN08亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.13所示；SC07亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.14所示；JX0601亚型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.15所示。根据序列比对显示，来自不同亚型的核苷酸相似度高。
[0025]然后以5’ gctacgtctctctagattaagggttaagrggghh-3> 为上游引物，下划线为 XbaI酶切位点；5’ -ctcgagctggccctgctccccgatcaccc3>为下游引物,下划线为Xho I酶切位点，然后分别以含SEQ ID N0.1?SEQ ID N0.15序列的样品为模板进行PCR扩增，获产物酶切后连入pET32a表达载体中，获得重组pET32a-CAP表达载体。
[0026]实施例2细胞培养及细胞批库建立
[0027]以UMNSAH/DF-1细胞培养并建库为例，UMNSAH/DF-1细胞来源于美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection, ATCC)。培养基米用 DMEM 培养基(Dulbecco' s modified Eagle medium),培养基中添加 100U/mL 青霉素及 100 μ g/mL链霉素，然后加入体积分数为2-10%的胎牛血清，然后在细胞工厂或细胞发酵罐进行培养，建立细胞工作种子批库，并对传代后的外源因子、致瘤性及稳定性等全面检定，细胞使用代数控制在60代以内，均符合疫苗生产介质的要求。
[0028]本实施例中还可以使用其他动物细胞，如:PK-15细胞VERO细胞；@C0S细胞；④人二倍体细胞；?BHK细胞；?CH0细胞MDCK细胞H印-G2细胞等，也可以使用本领域常用的其他细胞。
[0029]实施例3质粒转染及稳定高表达细胞系筛选与建库
[0030]选用实施例2建立的UMNSAH/DF-1细胞为靶细胞，采用脂质体法将实施例1构建的重组PHWD2000-CAP表达载体转染UMNSAH/DF-1细胞，然后筛选稳定高表达PC VLP-2的细胞系。具体步骤如下:①在35mm孔中，加入pHWD2000-CAP表达载体1.Syg;②加入5 μ LOptiMEM配置的脂质体，室温孵育45min。然后加入到被OptiMEM润洗过的宿主细胞中，孵育5h 离心去除载体-脂质体混合物，并向细胞中加入DMEM进行培养；④PHWD2000-CAP重组载体在细胞系中表达，可自组装PC VLP-2 ;⑤通过加压筛选表达PCVLP-2的UMNSAH/DF-1细胞株。结果显示，在UMNSAH/DF-1细胞10代内筛选到稳定高表达PC VLP-2的细胞株，经细胞系稳定表达与产量、VLP大小与结构、外源因子与致瘤性、染色体完整性等传代至40代没有表型改变。由此，建立了稳定高表达PCV-2VLP的UMNSAH/DF-1细胞系。进一步建立具有PCV-2VLP的三级细胞种子批库，经对全面检定符合疫苗生产要求，放置液氮中保存备用。
[0031]本实施例中制备稳定高表PCV-2VLP的细胞系包括但不限于 ?①UMNSAH/DF-1细胞?’②PK-15细胞?’③VERO细胞；? COS细胞；?人二倍体细胞；? BHK细胞?’⑦CHO细胞；⑧MDCK细胞；@ H印-G2细胞。
[0032]实施例4PCVLP-2规模化生产
[0033]取稳定表达PCV-2VLP的UMNSAH/DF-1工作批库细胞，用DMEM细胞培养液(不加入或加入10-2%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通过20L细胞工厂或加入微载体30L细胞发酵罐放大培养生产使得细胞密度达到I X 107_8以上时，收集细胞培养PCV-2VLP疫苗原液。
[0034]本实施例中规模化生产的PCV-2VLP细胞系包括但不限于:①UMNSAH/DF-1细胞?’②PK-15细胞VERO细胞；? COS细胞；?人二倍体细胞；? BHK细胞 '⑦CHO细胞；⑧MDCK细胞；⑨H印-G2细胞。
[0035]实施例5PCV-2VLP疫苗的纯化
[0036]分别收集规模化生产的不同亚型的PCV-2VLP疫苗原液，4 °C 5000rmp离心lOmin，去除细胞及杂质；取上清液100000g4°C离心2h，沉淀用I倍体积HNE buffer (25mMTris-HCl pH7.4,150mM NaCl, 5mM EDTA)悬浮；将悬液进行鹿糖梯度离心，鹿糖采用HNE buffer 配制，体系采用 0.3g/mL 鹿糖 3mL ；0.45g/mL 鹿糖 3mL ；1.37g/mL 鹿糖 ImL ；4 °C IOOOOOg离心2h ;收集中间层，并用折射仪测量密度；用pH6.5-7.5的PBS平衡Sepharose6FFTM介质进行凝胶层析纯化，收集外水体积流穿峰，杂蛋白去除可达95%以上；然后采用DEAE-S印haroseFFTM介质进行离子交换层析，平衡液为pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5M氯化钠、ρΗ6.5-7.5的PBS，杂蛋白去除可达99%以上，液体为PC VLP-2疫苗原液。
[0037]疫苗原液的外观为澄清液体，pH值为7.0-7.2，通过血平板进行杂菌鉴定结果为阴性，通过半流体和肉汤培养基培养进行支原体鉴定结果为阴性，通过PAGE-SDS电泳检测结果显示目的条带清晰、无其他杂带，采用Reed&Muench法计算抗血清中和效价均高于
I: 2800。
[0038]实施例6PCV-2VLP疫苗剂型配制
[0039]①注射剂型配制:分别将纯化的PCV-2VLP疫苗原液不加佐剂，配制10 μ g/0.5mL的低剂量、20 μ g/1.0mL高剂量的无佐剂注射剂型；分别将纯化PCV-2VLP疫苗原液加入氢氧化招或磷酸招配置PCV-2VLP浓度为15 μ g/mL,氢氧化招或磷酸招为lmg/mL的疫苗,或PCV-2VLP浓度为30 μ g/mL,氢氧化铝或磷酸铝浓度为2mg/mL的有佐剂注射型疫苗；分别将纯化PCV-2VLP疫苗原液加入纳米铝佐剂，分别配制5.0 μ g/0.5mL低剂量、10 μ g/1.0mL高剂量的有佐剂注射型疫苗。将以上注射疫苗溶液装入吸顶瓶，放2-8°C备用。
[0040]②喷鼻剂型配制:分别 将纯化PCV-2VLP不加佐剂吸附，配制7.5 μ g/0.2mL低剂量、15 μ g/0.2mL高剂量的无佐剂喷鼻疫苗剂型；分别将纯化的PCV-2VLP加入等体积季胺化壳聚糖水凝胶黏膜佐剂与传递系统，配制5.0 μ g/0.2mL、10 μ g/0.2mL有佐剂喷鼻疫苗剂型；分别将纯化PCV-2VLP蛋白加入等体积季胺化壳聚糖水凝胶与10 μ g rLT黏膜佐剂及传递系统，配制4.0 μ g/0.2ml,8 μ g/0.2ml有佐剂喷鼻猪圆环病毒样颗粒疫苗剂型。以上喷鼻疫苗溶液装入定量喷鼻装置，放2-8°C备用。
[0041]③饮水剂型配制:分别将纯化PCV-2VLP10 μ g、20 μ g分别加入5%蔗糖(质量)、0.2%维生素C(质量)、0.1%谷维素(质量)和0.1%脱脂奶粉(质量)，用磷酸盐缓冲液调PH7.2，喷雾干燥，配制10 μ g/剂低剂量、20 μ g/剂高剂量的无佐剂舌下含片剂型；分别将纯化PCV-2VLP蛋白7.5yg、15yg与15 μ g rLT分别加入5%蔗糖、0.2%维生素C、0.1 %谷维素和0.1 %脱脂奶粉，用磷酸盐缓冲液调PH7.2，喷雾干燥，配制7.5μ g/剂低剂量、15 μ g/剂高剂量的有佐剂猪圆环病毒样颗粒疫苗饮水剂型；以上以上饮水疫苗装入密封塑料袋内，放2-8°C备用。
[0042]实验例7PCV-2VLP疫苗检定实验
[0043]利用实施例6制备的PCV-2VLP疫苗注射剂、滴鼻剂、饮水剂型外观见均，无异味和染菌；通过豚鼠、家兔试验无热原、异常毒性和急性毒性反应；通过3日龄乳鼠脑内接种，以及3日龄小猪颈部肌肉注射试验无发病现象；通过Lorry法测定蛋白含量均在剂量范围；通过电镜观察VLP直径约17nm，与天然病毒一致；ELISA测定DNA含量均在50EU以下；通过SDS-PAGE和WB检测抗原蛋白成分存在；通过免疫Balb/C小鼠I次血清中和抗体效价在3200以上。
[0044]实验例8PCV-2VLP疫苗对实验猪体内的免疫应答效果实验[0045]利用实施例6制备的PCV-2VLP疫苗分别加入或不加入相应佐剂制备的注射、滴鼻、饮水疫苗剂型，并用PBS、铝盐、纳米铝、rLT为对照组，分别按各自途径免疫3日龄小猪，以及后备母猪其免疫剂量按实施例6疫苗低剂量组，免疫两次(0，21天)；末次免疫后14天采集各组小猪及母猪的外周血、分离血清和免疫细胞，采集脾淋巴细胞、肺和鼻腔灌洗液；通过ELISA法测定血清抗体效价在6400以上，采用MTT法测定中和抗体效价在3200以上，采用流失细胞仪、ELISP0T仪测定免疫细胞与血清重要细胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变化使得TH2/Thl应答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗体效价在160以上。结果显示，本发明PCV-2VLP疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且试验组有佐剂组好于无佐剂组、高剂量好于低剂量组免疫应答效果，而对照组没有产生双重免疫应答；制备的PCV-2VLP疫苗不管是注射还是滴鼻、饮水剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂型血清抗体效价高于滴鼻、饮水剂型，滴鼻、饮水剂型黏膜和细胞免疫效应好于注射剂型。
[0046]实验例9PCV-2VLP疫苗对实验猪体内的免疫保护效果实验
[0047]利用实施例6制备的PCV-2VLP疫苗分别加入或不加入相应佐剂制备的注射、滴鼻、饮水剂型为实验组，并用PBS、铝盐、纳米铝、rLT、及PCV-2甲醛灭活病毒为对照组，分别按各自途径免疫3日龄小猪、后备母猪，其免疫剂量按实施例6疫苗低剂量组，免疫两次(0，21天)，末次免疫后14天各试验组、对照组实验猪用105_tlTCID5tl临床分离PCV-2毒株分别颈部肌肉注射攻毒观察保护效果。结果显示，本发明PCV-2VLP疫苗均都能产生高水平的保护效果，免疫保护率在90%以上，而对照组PCV-2甲醛灭活病毒疫苗保护率达60%、其他各对照组保护率达为0%。由此制备的PCV-2VLP疫苗在小猪和母猪体内具有高效的免疫保护效果。
[0048]实验例10PCV-2VLP疫苗对怀孕母猪的免疫应答及免疫保护效果实验
[0049]利用实施例6制备的PCV-2VLP疫苗分别加入或不加入相应佐剂制备的注射、滴鼻、饮水剂型，并用PB S、铝盐、纳米铝、rLT和PCV-2甲醛灭活病毒疫苗为对照组，分别按各自途径免疫怀孕60天母猪，其免疫剂量按实施例6疫苗高剂量组，免疫两次(0，21天)；当末次免疫后14天采集各组母猪的外周血、分离血清和免疫细胞。一部分母猪处死后采集脾淋巴细胞、肺和鼻腔灌洗液；通过ELISA法测定血清抗体效价在12800以上，采用MTT法测定中和抗体效价在6400以上，采用流失细胞仪、ELISP0T仪测定免疫细胞与血清重要细胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变化使得TH2/Thl应答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗体效价在200以上。另一部分母猪继续饲养，当母猪分娩后观察没有早产、流产、弱仔情况。结果显示，本发明PCV-2VLP疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且试验组有佐剂组好于无佐剂组、高剂量高于低剂量组免疫应答效果，而对照组没有产生双重免疫应答；本发明PCV-2VLP疫苗不管是注射还是滴鼻、饮水剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂血清抗体效价高于滴鼻、饮水剂型，滴鼻、饮水剂型黏膜和细胞免疫效应好于注射剂型。由此制备的PCV-2VLP疫苗在怀孕母猪体内具有好的免疫应答效果。
[0050]上述PCV-2VLP疫苗通过各自方法免疫配种前母猪，配种后21天进行2次免疫，在怀孕80天各试验组、对照组怀孕母住用IO5 tlTCID5ci临床分离PCV-2毒株分别颈部肌肉注射攻毒，待母猪自然生产后观察保护效果。结果显示，本发明PCV-2VLP疫苗均都能产生高水平的保护效果，免疫保护率在90%以上，而对照组PCV-2甲醛灭活病毒疫苗保护率达78%、其他各对照组保护率达为0%。由此制备的PCV-2VLP疫苗对怀孕母住具有高效的免疫保护效果。
[0051]实验例11PCV-2VLP疫苗的安全性实验
[0052](I)无菌、支原体试验:将实施例6制备的PCV-2VLP疫苗分别接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养14d，并以无菌生理盐水做阴性对照，培养温度为25°C、35°C。结果显示，PCV-2VLP疫苗都未见细菌生长。分别将PCV-2VLP疫苗用半流体和肉汤培养基，37°C初代培养21天，次代培养21天，无菌生理盐水做阴性对照，结果显示PCV-2VLP疫苗无支原体生长；用DNA染色法将毒种接种Vero细胞培养3天，传代一次，用二苯甲酰胺荧光染料染色。结果显示，PCV-2VLP疫苗均无支原体生长。
[0053](2)溶血性试验:选取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血lmL，用PBS洗涤3次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍。PBS稀释PCV-2VLP疫苗(由实施例6制备)，分别为2倍、4倍、8倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检佐剂中，8小时后，评价血球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。结果显示，没有发生血球破裂，无溶血现象。说明PCV-2VLP疫苗中的成分不能使红细胞裂解。因此，PCV-2VLP疫苗均无溶血反应。
[0054](3)急性毒性试验:取实施例6制备的PCV-2VLP疫苗0.5mL腹腔注射体重为12?18gBalb/C小鼠，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明PCV-2VLP疫苗在试验的浓度下对动物是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。在体重为8?IOkg的Beagle狗体内的急性毒性结果:取实施例6制备的PCV-2VLP疫苗肌肉注射15mL，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重 和存活率变化。结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。因此，PCV-2VLP疫苗均无急性毒性反应，使用是安全的。
[0055](4)过敏试验研究:取实施例6制备的PCV-2VLP疫苗皮下接种体重为250?350gHartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0.5mL,隔日一次，共3次。第3次注射后21天，耳静脉分别给予相同PCV-2VLP疫苗0.5mL，并用人血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后30分钟及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，PCV-2VLP疫苗组豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，PCV-2VLP疫苗在动物体内均无过敏反应。
[0056](5)兔热源质试验:取预检合格的体重为2?3kg家兔3只固定,30分钟后测量体温，共测2次，间隔30分钟，要求2次温差不大于0.2°C，各家兔2次平均温度在38.6-39.50C。将实施例6制备的PCV-2VLP疫苗预热至38°C，于第2次测温后15分钟内，自家兔耳边静脉分别缓缓注入0.5mL/只。注射后每隔30分钟测量体温I次，连测6次。结果显示:PCV-2VLP疫苗给予家兔个体升温均未超过0.2°C，3只家兔升温总和未超过0.4°C,没有引起家兔的发热反应。因此，制备的PCV-2VLP疫苗均无热源质。
[0057](6)免疫病理损伤试验:由实施例8制备的PCV-2VLP疫苗通过小猪、母猪、种猪及育肥猪外周血抗体亚型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性细胞及气管、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏等检测。试验结果显示，PCV-2VLP疫苗免疫接种在实验乳猪、母猪、种猪及育肥猪体内Th2/Thl免疫应答趋于平衡，没有免疫器官损伤的迹象，因此具有安全性。
[0058]实验例12:PCV-2VLP疫苗稳定性实验
[0059]将实施例6制备的PCV-2VLP疫苗，分别置于2_8°C、室温(20-25°C )、37°C I周、2周、I个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月，取样观察外观、pH值、无菌、电镜观察粒径、免疫动物观察安全性。结果显示:PCV-2VLP疫苗放置2-8°C 24个月内均无变色分层等现象，PH值在7.0-7.2之间无变化，电镜观察粒径大小保持一致，且注射或滴鼻给小鼠或实验猪表现正常；PCV-2VLP疫苗放置室温25°C 3个月内均有好的稳定性；PCV_2VLP疫苗放置室温37°C I个月内均有好的稳定性效果。由结果说明，PCV-2VLP疫苗放置2_8°C理化性质、生物学性能稳定，有效期至少24个月。
[0060]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种猪圆环病毒的病毒样颗粒，其特征在于:所述病毒样颗粒由猪圆环病毒的核衣壳蛋白组成。
2.根据权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于:所述核衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.1 ?15 所示。
3.根据权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于:所述核衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.16 ?30 所示。
4.含有权利要求1-3任一项所述病毒样颗粒的疫苗。
5.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于:所述疫苗为注射剂、滴鼻剂或饮水剂型。
6.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于:所述疫苗的佐剂为纳米铝、氢氧化铝或磷酸铝、水凝胶、季胺化的壳聚糖或重组不耐热性肠毒素中的一种或多种。
7.权利要求1-3任一项所述病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:将编码猪圆环病毒核衣壳蛋白的核苷酸构建重组真核表达载体，然后将重组真核表达载体转化表达细胞，培养后将培养物经纯化即得病毒样颗粒。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于:所述真核表达载体为pET32a载体，P0PI3CAT 载体，pCAGGS 载体，pcDNA6/TR 载体或 pCMV-HA 载体。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于:所述表达细胞为UMNSAH/DF-1细胞，分离9-10龄禽成纤维细胞，PK-15细胞，VERO细胞，COS细胞，人二倍体细胞，BHK细胞，CHO细胞，MDCK细胞，H印-G2细胞，Tn5细胞或SF9Cell细胞。
10.根据权利要求7-9任一项所述的制备方法，其特征在于，培养物的纯化方法为:收集细胞培养液，4°C、5000rmp条件下离心lOmin，取上清液于100000g、4°C条件下离心2小时，沉淀用 HNE buffe r 悬浮，HNE buffer 的组成为 25mM Tris-HCl pH7.4,150mM NaCl,5mM EDTA ;然后将悬液进行蔗糖梯度离心，蔗糖采用HNE buffer配制，体系采用0.3g/mL蔗糖3mL, 0.45g/mL鹿糖3mL, 1.37g/mL鹿糖ImL,然后与4°C、IOOOOOg条件下离心2h,收集中间层，并用折射仪测量密度；用PH6.5-7.5的PBS平衡S印harose6FFTM介质进行凝胶层析纯化，收集外水体积流穿峰；再采用DEAE-S印haroseFFTM介质进行离子交换层析，平衡液为ρΗ6.5-7.5、含有0.05-0.15Μ氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5Μ氯化钠、ρΗ6.5-7.5的PBS,纯化后液体即为病毒样颗粒。
【文档编号】A61K39/12GK103436499SQ201310230557
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】李阳春, 曹政 申请人:重庆澳龙生物制品有限公司