一种猪胎儿成纤维细胞的单细胞培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种猪胎儿成纤维细胞的单细胞培养方 法。
【背景技术】
[0002] 中国是世界上养猪规模最大的国家，但猪生产水平远低于欧美养猪发达国家。短 期内传统的育种手段很难在猪生产性能方面取得大的进展，但是转基因技术打破了远缘有 性杂交的束缚，实现了不同物种生物体之间的基因交流，从而可以最大限度的利用和创造 遗传变异，改良家畜的性状，创造新的家畜品种转基因动物为猪遗传育种提供了新的技术 手段，可大大加速遗传改良的速度，尤其是转基因体细胞核移植技术的出现，为转基因技术 在猪改良育种中的应用提供了技术支撑。
[0003] 猪胎儿成纤维细胞是猪体细胞转基因克隆的重要工具细胞，目前用于猪转基因克 隆的胎儿成纤维细胞是原代培养分离的混合胎儿体细胞系。在该混合细胞系中基因组中通 过转染随机插入带有筛选标记的外源基因，经过加压筛选获得具有唯一筛选标记的转基因 混合细胞。
[0004] 但是，采用上述混合细胞系经加压筛选获得的细胞具有一定的缺陷：一方面由于 加压筛选只能得到具有筛选标记的细胞，与其基因组的均一性无关，再将这些经过随机重 组的混合细胞分别通过体细胞核移植技术转入受体卵细胞中进行个体激活发育，得到的个 体将是具有不同重组位点的转基因猪。另一方面定点转基因的脱靶效应会导致即使基因组 完全一致的细胞，产生多种转基因的可能，而这种混合细胞的体细胞克隆产生的后代将严 重不均一，可能有这样或者那样的表型，甚至达不到转基因的效果，没有任何新表型。
[0005] 因此，建立一种有效的胎儿成纤维细胞单细胞培养技术将有利于提高转基因猪的 特异性，有利于转基因猪克隆效率的评价，以及特定均一转基因猪品系的建立。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供了 一种成纤维细胞的单细胞培养方法。该单细胞培养方法 获得的克隆细胞基因组完全一致，有利于提高转基因猪的特异性，有利于转基因猪克隆效 率的评价，以及特定均一转基因猪品系的建立；本发明提供的单细胞培养方法获得的克隆 细胞无需进行加压筛选，因此，可简化转基因动物的生产工作。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种成纤维细胞的单细胞培养方法，包括如下步骤：
[0009] 步骤A:获得成纤维细胞悬液和饲养层细胞；
[0010] 步骤B:将饲养层细胞以微滴形式接种至培养皿，培养至饲养层细胞密度在微滴 内100%汇合，获得饲养层细胞微滴；
[0011] 步骤C:将成纤维细胞悬液接种至具有饲养层细胞微滴的培养皿，经细胞培养，获 得单细胞克隆。
[0012] 在本发明中，由于饲养层细胞微滴既能够提供细胞因子，又占用少量培养皿面积， 达到了既能给成纤维细胞提供生长所需的良好培养环境，又能保证有足够的空间供成纤维 细胞增殖形成独立的优质细胞克隆的目的，从而有利于单细胞克隆的获得，可用于均一、无 筛选标记的转基因动物的生产。
[0013] 作为优选，成纤维细胞悬液的细胞浓度为5~10个/mL。
[0014] 作为优选，成纤维细胞悬液的接种量为10~15mL/皿。
[0015] 在本发明提供的一些实施例中，步骤C中细胞培养为38°C、5% 0)2恒温培养8~ 11天。
[0016] 作为优选，饲养层细胞的接种量为300~500yL/微滴。
[0017] 作为优选，饲养层细胞微滴在培养皿中的密度为10~12个/皿。
[0018] 在本发明提供的一些实施例中，步骤B中饲养层细胞的培养条件为37°C、5%C02 恒温培养。
[0019] 作为优选，成纤维细胞为3代以内的成纤维细胞。
[0020] 在本发明提供的一些实施例中，成纤维细胞为猪胚胎成纤维细胞。但成纤维细胞 的来源并非限定于此，其它动物来源的成纤维细胞的单细胞培养同样适用于本发明。
[0021] 在本发明提供的一些实施例中，饲养层细胞的制备方法为：取胚胎成纤维细胞，经 丝裂霉素C处理2. 5h，去除丝裂霉素C，加入胰酶消化液孵育，终止消化，获得饲养层细胞。
[0022] 本发明提供了一种成纤维细胞的单细胞培养方法。该单细胞培养方法，包括：步骤 A:获得成纤维细胞悬液和饲养层细胞；步骤B:将饲养层细胞以微滴形式接种至培养皿，培 养至饲养层细胞密度在微滴内100%汇合，获得饲养层细胞微滴；步骤C:将成纤维细胞悬 液接种至具有饲养层细胞微滴的培养皿，经细胞培养，获得单细胞克隆。本发明至少具有如 下优势之一：
[0023] 本发明提供的单细胞培养方法获得的克隆细胞基因组完全一致，有利于提高转基 因猪的特异性，有利于转基因猪克隆效率的评价，以及特定均一转基因猪品系的建立；
[0024] 本发明提供的单细胞培养方法获得的克隆细胞无需进行加压筛选，因此，可简化 转基因动物的生产工作。
【附图说明】
[0025] 图1示由本发明培养的猪胎儿成纤维细胞单细胞克隆；
[0026] 图2示定量PCR标准曲线（GFP基因）；
[0027] 图3示本发明单细胞培养克隆基因组GFP拷贝数与DNA质量的关系；
[0028] 图4示G418筛选克隆基因组GFP拷贝数与DNA质量的关系。
【具体实施方式】
[0029] 本发明公开了一种成纤维细胞的单细胞培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文 内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人 员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实 施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法 和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0030] 本发明提供的成纤维细胞的单细胞培养方法中所用材料、试剂和仪器均可由市场 购得。
[0031] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0032] 实施例1猪胚胎的获得
[0033] 怀孕30天实验用母猪用戊巴比妥钠耳静脉注射剂量为1. 4mL/Kg，先快速注射全 剂量的50%，然后缓慢注射，10分钟内注射麻醉，使用新洁尔灭在腹部消毒，然后在腹正中 打开切口，用肠钳夹封闭妊娠子宫的两端，子宫内可触及若干个鸡蛋样胚胎。丝用线结扎子 宫两端，切断，缝扎子宫残端，缝合线关闭腹腔。在超净工作台中内剖开子宫，取出胚胎，用 含1 %抗生素的37°C预热的PBS洗涤三遍，置于无菌瓶皿，除去头、四肢及内脏。
[0034] 实施例2猪胚胎成纤维细胞的分离与培养
[0035] 将实施例1获得的胚胎组织切成1_X1_X1_大小的碎块，利用灭菌眼科剪将 组织剪碎至糊状，将其涂布到细胞培养皿底部，置于38°C、饱和湿度的C02培养箱中放置4h 后，加入细胞培养液（DMEM+10 %胎牛血清+1 %双抗+1 %非必需氨基酸），尽量避免组织块 漂浮，继续以上述条件进行培养，每隔72h更换培养液一次，在第8天成纤维样细胞开始从 组织块孵出。加入37°C的2. 5g/L胰蛋白酶，置C02培养箱内消化30min。100目筛网过滤， lOOOrpm离心5min，收集细胞。以PBS液洗涤1次，再用含10%小牛血清的DMEM培养液洗 涤2次，在37°C、5%C02培养箱中传代培养。原代分离的细胞记录为P0代，按1:4传代后 记录P1代，约四天长到90%以上汇合度可再次传代或冻存，下一代为P2代，以此类推。
[0036] 实施例3饲养层细胞的制备
[0037] 1)原代小鼠胚胎成纤维细胞分离培养：
[0038] 选取6-10周龄雌雄鼠1:1合笼，次晨和下午分别查阴栓1次，见阴栓者计为妊娠 〇.5d。取妊娠12. 5-14. 5d孕鼠。处死妊娠小鼠，在75%医用酒精中浸两分钟。取出孕鼠， 超净台内无菌取出子宫，置于盛有PBS的90mm培养皿中，PBS清洗1次，吸去废液。在体式 镜下用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，去除胎鼠头、尾、四肢和内脏，PBS洗涤3次后， 将胎体充分剪碎。加入胰酶消化液（〇. 5g/L胰酶-0. 02 %EDTA) 10mL吹打成混悬液，于37°C 消化5min，后加入等量的含体积含10%胎牛血清的DMEM培养液中，转入50mL的离心管，并 充分吹打细胞悬液后，l〇〇〇rpm，离心5min，弃上清。最后加入含体积分数为10%胎牛血清 的。用DMEM培养液重悬细胞，室温静置两三分钟，待未剪碎细胞团块完全沉至离心管底， 吸取上清细胞悬液至新的50mL离心管中，补充培养基并混悬细胞液，接种至两个新培养瓶 中，补充MEF培养基至培养瓶中至细胞悬液为25mL，并将培养瓶移入37°C，体积分数为5% C02，恒温培养箱中培养。等细胞贴满瓶底达到90%以上汇合，吸去培养瓶内的培养基，PBS 洗涤1次，分别在各培养瓶内加入lmL0. 5g/L胰酶-0. 02%EDTA消化液，37°C消化lmin，显 微镜观察细胞收缩变圆，细胞逐层脱落时加入等量含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消 化，移液器充分吹打散细胞，将细胞悬液转入15mL离心管，1000r/min，离心5min，弃上清。 加入新鲜的MEF培养基5mL重悬细胞，按1:4传代到新培养瓶，补足MEF培养基，移入37°C， 5%C02的恒温培养箱中培养。原代分离的细胞记录为P0代，按1:4传代后记录P1代，约 四天长到90%以上汇合度可再次传代或冻存，下一代为P2代，以此类推。
[0039] 2)饲养层细胞的制备：
[0040] ①取3-5代内长至80%汇合的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)，吸去原培养基，加入终 浓度为lOmg/L丝裂霉素C的MEF培养基6mL至90mm细胞培养皿中处理细胞2. 5h。②弃 去培养基，每次加5mLPBS洗涤细胞3遍次，完全去除丝裂霉素C，加2mL胰酶消化液，37°C 孵育lmin后，显微镜观察细胞收缩变圆，细胞逐层脱落时加入等量含10%胎牛血清的DMEM 培养液终止消化，移液器充分吹打散细