一种建立dox调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法
【专利摘要】一种建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法，包括：1）猪胎儿成纤维细胞的原代分离培养；2）猪胎儿成纤维细胞重编程为第一代iPS；3）第一代iPS分化为猪第二代成纤维细胞；4）第二代成纤维细胞重编程为第二代iPS。本发明成功地建立了DOX诱导猪体细胞重编程体系，成功建立了四因子拷贝数一致的猪第一代iPS，获得了基因型一致的第二代成纤维细胞，成功使第二代成纤维细胞无需基因导入直接在DOX条件下就可以诱导形成第二代iPS；第二代成纤维重编程过程无需外源基因的重新导入，无需考虑病毒制备及感染效率，提高了实验的安全性；本发明为研究猪重编程机制及小分子化合物诱导重编程提供了新的资源。
【专利说明】一种建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种体细胞系重编程的建立方法，尤其涉及一种建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法。
【背景技术】
[0002]多能干细胞细胞具有自我更新能力和分化能力，对于细胞治疗意义深远。胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)是从内细胞团(inner cell mass, ICM)中分离出来的多能干细胞，具有自我更新能力和三胚层分化能力，但由于涉及胚胎伦理问题制约了其应用。成体干细胞也可以应用于细胞治疗，但其有限的分化能力很大程度的限制了成体干细胞的应用。而诱导多能干细胞的出现很好的解决了上述问题。
[0003]经过十多年的努力，多能干细胞生物学已然成为一个欣欣向荣的研究学科。2006年，Takahashi和Yamanaka用逆转录病毒介导四因子即0ct4、Sox2、Klf4、c_Myc成功诱导出了小鼠多能干细胞，该细胞具有小鼠ES的特征，将其命名为诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cells,iPS) [Takahashi K, Tanabe K, et al.Cell [J].1nductionof pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors,2007，131 (5):861-872]。随后，人、大鼠、猕猴、牛、羊、猪、马、兔等物种也建立了 iPS细胞系O
[0004]长期以来，猪一直是医学研究上的理想实验动物。猪在解剖、生理结构及新陈代谢等方面与人类具有较高的相似度，是人类疾病模型和器官移植的理想实验动物。多家实验室将猪体细胞感染多种高滴度的逆转录病毒或慢病毒载体，诱导形成了 iPS，但这样的iPS具有不同的基因型，为进一步研究带来了干扰。同时，多种慢病毒或逆转录病毒载体拷贝数的随机整合，导致了重编程效率低，仅0.001%-0.1%。而这样诱导形成的iPS通常拥有15个拷贝数甚至更多的插入[Wernig M, Meissner A, et al.Nature [J].1nvitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES—cell—like state, 2007,448(7151):318-324],揭示重编程过程需要高滴度或一定化学计量的转录因子表达。这种多病毒载体随机高拷贝插入和重编程的随机性使机制研究及用小分子替代转录因子的研究更具难度。
【发明内容】
[0005]为了解决【背景技术】中存在的上述技术问题，本发明提供了一种建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法，便于研究猪体细胞体重编程体系，TetO-FUW-OSKM为四因子四串联，解决了四因子随机插入拷贝数不一的问题，研究人员可以使用第二代成纤维细胞在DOX条件下直接诱导细胞重编程，不用重新导入外源基因，不用考虑病毒感染效率。
[0006]本发明的技术解决方案是:本发明提供了一种建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法(图1)，其特殊之处在于:该方法包括以下步骤:
I)猪胎儿成纤维细胞的原代分离培养；2)猪胎儿成纤维细胞重编程为第一代iPS；
3)第一代iPS分化为猪第二代成纤维细胞；
4)第二代成纤维细胞重编程为第二代iPS，其具体实现方式:
4.1)将上述猪第二代成纤维细胞在+DOX的iPS培养条件下培养5d ；
4.2)计数重铺于feeder上，培养2d后出现克隆；
4.3)在体式显微镜下，用吸胚针将克隆挑出，单克隆接于Feeder上并将其扩增至2X106冻存于液氮中。
[0007]上述步骤I)的具体实现方式是:
1.1)取妊娠28d的母猪为实验材料，尽快将包含胎儿的整个子宫带回实验室；
1.2)将子宫用手术剪 剪开，取出羊水包裹的胎儿，放置于含1%青链霉素的PBS (-)
中；
1.3)用两把镊子小心的将羊水膜及胎盘与胎猪分离，将胎猪放入新的含1%青链霉素的PBS (—)中，尽量去除血细胞；
1.4)用手术剪将胎猪的头、尾、四肢及内脏去除干净，即只取胎猪躯干部分，将组织上的血细胞去除干净；
1.5)在新培养皿中添加少量PBS (—)，用手术剪将组织块尽量剪碎，取Imm3大小的组织块贴于另一培养皿内，两组织块之间间隔Icm左右，将其放置于37°C、5%C02饱和湿度培养箱中，待组织边缘略微有点干时，添加PEF培养液，于37°C、5%C02饱和湿度培养箱培养。
[0008]1.6) 48h换液，待迁出的成纤维细胞达50%，0.25%胰酶消化，PEF培养液中和，用200目的滤器过滤以去除组织块，细胞计数传代或冻存。
[0009]上述步骤2)的具体实现方式是:
2.1)以1.5X IO7接种293T于IOOmm培养皿，使其24h后密度达到70%_80%。；
2.2)提前 0.5h 为 293T 换成新鲜 7.5ml 10%DMEM ;按 12 TetO-FUff-OSKM/
FUW-M2rtTA、8 με pSPAX2、4 μ§ pMD2.G添加质粒，添加无菌水至总体积1093.75 μL,添加156.25 Mi CaCl2混匀；添加1250 μL 2\耶5，用11^移液枪快速吹吸60次，静置81^11后
逐滴加入100_培养皿内，混匀，放置于37°C、5%C02饱和湿度培养箱中；
2.3)转染后12h为293T细胞换液，同时准备PEF细胞；于转染后48h收集毒液，72h
再收集一次，经0.45 JLUli滤器过滤后添加polybrene (4 Ug/inL )，直接感染PEF细胞；感染
12h后换液,为了增加感染效率可以进行二次感染；
2.4)将上述步骤2.3) PEF计数，以I X IO4密度重铺于35皿，用添加DOX的iPS培养液培养，每天换液；诱导15天左右,用吸胚针挑取克隆,单克隆接于feeder或Matrigel上；用四型胶原酶传代扩增。
[0010]上述步骤3)的具体实现方式是:
3.1)将上述2.4)的克隆用0.25%胰酶消化为单细胞，接于悬浮培养皿EB培养液培养
4d ；
3.2)将3.1)接入普通细胞培养皿，继续EB培养液贴壁培养9d ；
3.3)将3.3)用PEF培养液培养，胰酶消化传代两次以上，细胞基本为成纤维样，传代四次以上，得到第二代成纤维细胞；上述步骤1.5)中PEF培养液含有DMEM+10% FBS+0.1 mg/mL青霉素+0.05 mg/mL链霉
素
上述步骤2.1)中239T细胞培养液含有DMEM+10% FBS+0.1 mg/mL青霉素+0.05 mg/mL链霉素
上述步骤2.3)中猪胎儿成纤维细胞取2飞代。
[0011]上述步骤2.4)或4.3)中诱导形成的克隆采用机械法挑出，然后在进一步将克隆撕成小片，将其接于feeder上或Matrigel上。
[0012]上述步骤2.5)中iPS培养液是含有DMEM+15% FBS +ImM L-谷胺酰胺+0.1mM非必需氨基酸+0.ΙιπΜβ -巯基乙醇+ 0.1 mg/mL青霉素+0.05 mg/mL链霉素+10ng/mLLIF+10ng/mL BMP4+^ μ-fl SB031542+3 μ-- Chir99021+10ng/mL bFGF 的培养液。Matrigel
上对应的培养液为(TeSR-E8+)TeSR-E8+10ng/mL LIF+10ng/mL BMP4+2 pJ SB031542+3 μLChir99021o
[0013]上述步骤3.1)中克隆先用四型胶原酶从皿中消化起来后，接着用胰酶消化成单个细胞。
[0014]上述步骤3.1 )EB 培养液含有 Knock-Out DMEM+20%Hyclone FBS+0.1mM β -巯基乙醇+0.1mM非必需氨基 酸+ImM L-谷氨酰胺。
[0015]上述步骤2.4)或4)中所用DOX浓度为4ug/mL。
[0016]本发明的优点是:
1、快速、有效、安全。本发明采用第二代猪成纤维细胞进行重编程，只有在第一次iPS诱导时需要制备病毒，而以后的第二代iPS诱导无需再导入外源基因，减少了病毒的制备及减少制备病毒过程中潜在的危害，建立一种快速、有效、安全的猪体细胞重编程方法。
[0017]2、可实现第二代成纤维细胞大量扩增。依照本发明所提供的DOX诱导猪体细胞重编程的建立方法，获得具有体外长期扩增能力的第一代猪iPS，在需要的时候就可以大量分化形成第二代成纤维细胞。而这种第二代成纤维细胞，在添加DOX的iPS培养液就可以高效的重编程为iPS。第一代iPS、第二代成纤维细胞及第二代iPS的外源基因插入一致。并且经免疫细胞化学、RT-PCR鉴定表明，所得到的猪iPS表达多能干细胞标志基因Oct-4、Sox2、SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、Sal4 和 Esrrb，不表达 TRA-1-81 ;碱性磷酸酶活性检测呈阳性；RT-PCR分析表明具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能。
[0018]3、可为猪体细胞重编程机制研究提供新的细胞材料。本发明解决了外源基因随机插入导致四因子拷贝数不一，诱导效率低等问题。目前猪体细胞重编程机制仍不明确，本发明可为猪重编程机制研究提供新的工具细胞来源。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明方法建立流程图；
图2为由PEF诱导形成第一代iPS ；
图3为由第二代成纤维细胞诱导形成第二代iPS ；
图4为外源因子插入检测效果图。
【具体实施方式】[0020]本发明提供了一种建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法，参见图1，该方法包括以下步骤:
1、猪胎儿成纤维细胞分离步骤:
从猪场取妊娠28d的母猪为材料，尽快将母猪的整个子宫带回实验室。用手术剪将子宫剪开，用镊子依次将胎儿放入盛有含1%青链霉素PBS (—)的皿中。在超净台内，用两把镊子将羊水膜及胎盘与胎猪分离，将胎猪放入新的含双抗的PBS (—)中，多洗几遍，将血液洗净。将洗净的胎猪去除头、尾、四肢及内脏，即只取躯干，将组织上的血液去除干净。在新的培养皿内添加少量PBS (—)，将组织块尽量剪碎，将组织块贴于新的培养皿内，将其放置于37°C、5%C02饱和湿度培养箱中，待组织边缘略微有点干时，添加PEF培养液，于37°C、5%C02饱和湿度培养箱培养。48h换液，代组织块迁出大量细胞，用0.25%胰酶消化，用200目滤器过滤去除组织块，细胞计数传代或冻存。
[0021]2、猪胎儿成纤维细胞重编程为第一代iPS:
将293T以一定的密度铺于IOOmm培养皿内，使其24h密度达70%_80%，293T细胞的状态直接影响包毒效果，建议选择生长状况良好无支原体污染的293T细胞。磷酸钙转染前0.5h给 293T 换新鲜 10%DMEM 培养液。按 12 pg Tet0-FUW-0SKM/FUW_M2rtTA、8 pSPAX2、4
jig pMD2.G添加质粒，添加无菌水至总体积1093.75 μL,添加156.25 μL CaCl2混匀；添加1250 Mi 2XHBS，用ImL移液枪快速吹吸60次，静置8min后逐滴加入IOOmm培养皿内，混匀，置于显微镜下可观察到磷酸钙颗粒悬浮于培养液中，放置于37°C、5%C02饱和湿度培养箱中。12h为293T换IOmL培养液，于转染后48h、72h收集毒液，经0.45〖心滤器过滤，与
DMEM按3:1混匀，添加polybrene (8 Us/mL.)，直接感染猪胎儿成纤维细胞；感染12h后换液，为了增强感染效率换液后12h可以进行第二次感染。感染后的细胞在+D0X(4ug/mL)的iPS培养液里培养。参见图2，15d左右，感染后的细胞会出现典型的iPS克隆，克隆边界清晰，呈鼓起，核质比大。
[0022]将克隆用吸胚针挑出，分别放于feeder和Matrigel上，进行扩增。期间传代用四型胶原酶消化。培养于feeder上克隆，所用培养液为DMEM+15%Hyclone FBS+lmM L-谷胺酰胺+0.1mM非必需氨基酸+0.1mMP -巯基乙醇+ 0.1 mg/mL青霉素+0.05 mg/mL链霉素+10ng/mLLIF+10ng/mLBMP4+2 μΜ SB031542+3 μΠ Chir99021+10ng/mL bFGF;培养于Matrigel 上的克隆，所用培养液为(TeSR_E8+)TeSR_E8+10ng/mL LIF+10ng/mL BMP4+2 yJlSB031542+3 yJ Chir99021克隆在Matrigel条件下比在feeder上生长快速，但易分化，需
要及时将分化的克隆刮除，否则更多的克隆将会分化。碱性磷酸酶检测呈阳性，参见图4，经PCR检测表明，外源基因TetO-FUW-OSKM和FUW_M2rtTA均插入成功；经RT-PCR检测表明，外源基因0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc均表达。
[0023]3、第一代iPS分化为猪第二代成纤维细胞:
选取生长状况良好的克隆，用四型胶原酶将克隆消化下来，放置于1.5EP管内，添加
0.25%胰酶，使克隆消化为单细胞。用DMEM中和后离心去除上清，细胞计数铺于悬浮培养皿内培养4d，期间两天换一次培养液，每12h吹一次贴于皿底的细胞，减少细胞贴壁。换液时，将皿内培养液全部收集到15mL离心管内，放置于培养箱lh，去除上清，将沉淀接于悬浮培养皿继续培养。
[0024]参见图3，4d后将EB接于普通细胞培养皿培养液，用EB培养液贴壁培养9d。之后改用PEF培养液，传代两次以后细胞大部分呈成纤维样，传代四次以上得到第二代成纤维。
[0025]4、第二代成纤维细胞重编程为第二代iPS:
将第二代成纤维细胞在+DOX的iPS培养条件下培养5d ;期间培养到第三天时，细胞出现小集落，细胞形态发生改变，有原来的长梭形变成铺路石样；到第五天时，集落变大，细胞核质比明显变大。培养5d时，用0.25%胰酶消化，计数以I X IO5重铺于35mm培养皿feeder上，在+DOX的iPS培养条件下培养2d出现克隆。克隆用四型胶原酶消化传代。经免疫细胞化学、RT-PCR鉴定表明，所得到的猪iPS表达多能干细胞标志基因0ct-4、Sox2、SSEA-l、SSEA-4、TRA-1-60、Sal4和Esrrb，不表达TRA-1-81 ;碱性磷酸酶活性检测呈阳性；RT_PCR分析表明具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能。
[0026]根据本发明所述iPS细胞培养基成分为DMEM+15% FBS +ImM L-谷胺酰胺+0.1mM非必需氨基酸+0.1mMP -巯基乙醇+ 0.1 mg/mL青霉素+0.05 mg/mL链霉素+IOng/mLLIF+10ng/mlBMP4+2 μL SB031542+3 μL? Chir99021+10ng/mL bFGF 的培养液。Matrigel
上对应的培养液(TeSR-E8+)为 TeSR-E8+10ng/mLLIF+10ng/mL BMP4+2 μL SB031542+3 μLChir99021o
[0027]根据本发明所述EB 培养液成分为 Knock-Out DMEM+20%Hyclone FBS+0.1mM β -巯基乙醇+0.1mM非必需氨基酸+ImM L-谷氨酰胺。
[0028]对上述克隆分别采用有血清有feeder及无血清无feeder培养基培养，克隆用四型胶原酶消化进行传代，接于feeder上的克隆使用iPS培养液，接于Matrigel上的克隆使用TerS-E8+培养液。
[0029]经免疫细胞化学、RT-PCR鉴定表明，所获得的猪iPS表达多能细胞标志基因0ct-4、Sox2、SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、Sal4 和 Esrrb，不表达 TRA-1-81 ;碱性磷酸酶活性检测呈阳性；RT_PCR分析表 明具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能。
【权利要求】
1.一种建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法，其特征在于:该方法包括: 步骤I)猪胎儿成纤维细胞的原代分离培养； 步骤2)将上述猪胎儿成纤维细胞重编程为第一代iPS ； 步骤3)第一代iPS分化为猪第二代成纤维细胞； 步骤4)第二代成纤维细胞重编程为第二代iPS，具体实现方法为: 4.1)将第二代成纤维细胞在+DOX的iPS培养条件下培养5d ； 4.2)0.25%胰酶消化计数重铺于feeder上，2d后出现克隆； 4.3)在体视显微镜下，将单个克隆挑出，撕成几份接于有feeder的48孔板，使其扩增至2X10§冻存于液氮中。
2.根据权利要求1所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法，其特征在于:所述步骤I)的具体实现方式是: 1.0从猪场取含有28d胎猪的子宫； 1.2)将胎猪与子宫分离，将胎猪放于含双抗的PBS (—)中； 1.3)将胎猪与羊膜及胎盘分离，将胎猪放于含双抗的PBS (—)中； 1.4)去除上述步骤1.3)中的头、尾、四肢及内脏，将组织在双抗的PBS (-)中清洗数次,去除血液； 1.5)将上述步骤1.4)中的组织放置于玻璃皿内，添加少许双抗的PBS (—)，尽量将组织块剪碎；将组织块贴于新皿中，放置于37°C、5%C02饱和湿度培养箱中，待组织块边缘略微有点干，添加PEF培养液，于37°C、5%C02饱和湿度培养箱培养；培养液成分为DMEM+ 10%HycloneFBS+0.1青霉素 +0.05 mg/gjl；链霉素； 1.6)上述步骤1.5)培养48h时换液，待迁出成纤维细胞达50%时，0.25%胰酶消化，经200目滤器过滤去除组织块，细胞计数传代或冻存。
3.根据权利要求2所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法，其特征在于:所述步骤2)的具体实现方式是: 2.1)以1.5X IO7接种293T于IOOmm培养皿，使其24h后密度达到70%_80% ； . 2.2)提前 0.5h 为 293T 换液；按 12 Tet0-FUW-0SKM/FUW_M2rtTA、8 pg pSPAX2、4jig pMD2.G添加质粒，添加无菌水至总体积1093.75 μL,添加156.25 μι CaCl2混匀；添加1250 Ml 2XHBS，用ImL移液枪快速吹吸60次，静置8min后逐滴加入IOOmm培养皿内，混匀，放置于37°C、5%C02饱和湿度培养箱中； .2.3)转染后12h为293T换液，同时准备PEF细胞；转染后48h、72h收集毒液，经0.45 _ 滤器过滤后添加polybrene (8 )，直接感染PEF细胞；感染后12h换液，为了增加感染效率可以进行二次感染； .2.4)将上述步骤2.3)0.25%胰酶消化计数重铺，诱导15d左右，将单克隆挑出，接于feeder或Matrigel上；每两天用四型胶原酶传代。
4.根据权利要求3所述建立DOX诱导猪体细胞重编程的方法，其特征在于:所述步骤3)的具体实现方式是: .3.1)将上述步骤2.4)的克隆用0.25%胰酶消化为单细胞，接于悬浮培养皿内培养4d ；.3.2)将3.1)接于普通细胞培养皿贴壁继续培养9d ； . 3.3)将3.3)用PEF培养液培养，用0.25%胰酶消化传代四次，得到第二代成纤维细胞。
5.根据权利要求1~4所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法，其特征在于:所述猪胎儿成纤维细胞培养液和293T培养液含有DMEM+10% Hyclone FBS+1%青链霉素的培养液；诱导时和feeder上对应的iPS培养液是含有DMEM+ 15% FBS + I mM L-谷胺酰胺+ 0.1mM非必需氨基酸+ 0.1mM β -巯基乙醇+ 0.1 mg/mL青霉素+0.05 mg/mL链霉素 +10ng/mL LIF+10ng/mLBMP4+2 μL SB031542+3 μΜ Chir99021+10ng/mL bFGF 的培养液；Matrigel 上对应的 iPS 培养液为(TeSR_E8+) TeSR_E8+10ng/mLLIF+10ng/mL BMP4+2 μΜSB031542+3 μL Chir99021 ；DOX 浓度为 4ug/mL。
6.根据权利要求5所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法，其特征在于:所述步骤2.3)中PEF细胞选取2飞代处于对数增长期的细胞。
7.根据权利要求6所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法，其特征在于:所述步骤2.4)或4.3)中，诱导形成的克隆采用机械法将其从原皿中挑出，继而将其撕成小片，将其接于feeder或Matrigel上。
8.根据权利要求7所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法，其特征在于:所述步骤2.4)或4.3)中，克隆扩增过程中，经常观察克隆，及时将分化的克隆挑出。
9.根据权利要求4所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法，其特征在于:所述步骤3.1)用四型胶原酶将克隆悬起，接着用胰酶消化成单个细胞。
【文档编号】C12N5/073GK103923877SQ201410179808
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】王华岩, 段安琴, 于童, 王宁 申请人:西北农林科技大学