专利名称：用于选择遗传转化细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于选择遗传转化细胞的方法。
已知通过转化手段将遗传物质引入细胞群体时，只有一定数目的细胞被成功转化。转化后，必须对被转化细胞进行鉴定并从被转化的和未被转化的细胞群体中选择出转化细胞。出于此目的，除了所需要的转基因外，通常还向细胞中引入一个选择基因。这里的选择基因编码例如一种特性，利用这种特性可以对遗传转化细胞进行鉴定。这种选择基因的实例是例如编码针对抗生素或除草剂的抗性的基因。转化后，使被转化的和未被转化的细胞群体与对未被转化的(“野生型”)细胞具有毒性的抗生素或除草剂接触，这样就只有转化细胞由于存在被引入的选择基因而能存活下来并生长。
然而这种编码抗生素或除草剂抗性的选择基因的使用对被大规模引入环境中的转基因农作物通常不理想，尤其对食品农作物不理想。这种选择机制的另一个缺点是例如未被转化的通常会相继死掉，此外当细胞群体是粘在一起的细胞组织或整个有机体时，被转化细胞也可能会因例如由死亡的非转化细胞分泌的有害化合物而死亡。
本发明的目的是提供一种用于从被转化的和未被转化的细胞群体中选择转化细胞的方法，其克服了上述缺陷。
本发明通过提供包括以下步骤的方法实现了该目的a)将至少一种目的核苷酸序列和至少一种选择-核苷酸序列引入细胞当中，从而获得一种遗传转化细胞，其中所述选择-核苷酸序列含有编码参与海藻糖代谢的蛋白的区域；b)使含有被转化的和未被转化的细胞的群体与海藻糖和/或其衍生物接触；和c)基于转化细胞能够代谢海藻糖和/或衍生物的能力，从所述群体中选择出转化细胞。
海藻糖是由多种生物体产生的葡萄糖的het α-1，1-二糖，所述生物体包括细菌、酵母菌和真菌以及若干高等植物。它是昆虫体内最重要的血糖。由于海藻糖能够提供保护对抗蛋白质变性和膜损伤，所以海藻糖愈来愈多地被特别用于疫苗的制备以及器官移植方案。
细胞特别是植物细胞通常不能在其中存在增高浓度的海藻糖而不存在另一种可代谢碳源的培养基中生长。在本发明的方法中，利用这一点来选择转化细胞。出于此目的，除了利用目的基因外，还用选择-核苷酸序列对细胞进行转化，其中所述选择-核苷酸序列含有编码参与海藻糖代谢的蛋白的区域。然后例如通过向培养基中添加海藻糖和/或其衍生物，使被转化的和未被转化的细胞群体与海藻糖和/或其衍生物接触。因此转化细胞区别于未被转化的细胞，不仅在于含有相关的引入的转基因而且还在其基因组中存在有编码能够代谢海藻糖的蛋白的核苷酸序列。转化细胞因而能够在具有海藻糖和/或海藻糖的衍生物的培养基中生存，而未被转化的细胞则不能进一步生长发育。因此基于转化细胞能够代谢海藻糖和/或衍生物的能力，能够以这种方式将转化细胞从总细胞群体中选择出来。
本文中的术语“参与海藻糖代谢的蛋白”是指能够分解海藻糖和/或其衍生物从而降低海藻糖和/或其衍生物浓度的一种蛋白，例如一种酶。
术语“海藻糖的衍生物”是指经修饰形式的海藻糖，这种经修饰形式的海藻糖如甲基化形式的或卤化形式的海藻糖也可以被相关蛋白所代谢并且可以在细胞内诱导与海藻糖同样的反应。
在本发明方法的一个优选实施方案中，被引入的选择-核苷酸序列含有一个编码具有海藻糖酶活性的胞内蛋白的区域，所述蛋白即能够将胞内海藻糖和/或其衍生物水解成葡萄糖的酶。由于转化细胞中存在这种蛋白，而未被转化的细胞中不存在这种蛋白，所以只有转化细胞能够分解进入细胞的海藻糖和/或衍生物。转化细胞中的胞内海藻糖浓度因而被降低，而被释放出来的葡萄糖还能被转化细胞当作额外营养源来利用。
多种细胞，尤其是高等植物细胞，诸如大豆(Glycine max.)和鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)，在其基因组中含有编码内源性海藻糖酶的基因(Aeschbacher R.A.等人，Plant Physiol.119(2)489-496，1999；Mueller等，Plant Physiol.125(2)1086-1093，2001)。然而，这些内源性海藻糖酶基因通常编码一种胞外海藻糖酶，该酶在细胞内不具有活性。可以利用常规的分子生物学技术对这种内源性基因进行修饰。在本发明方法的一个优选实施方案中，选择-核苷酸序列因而含有一个经修饰的内源性海藻糖酶基因，该基因编码在胞内有活性的海藻糖酶。在此内源性海藻糖酶基因被改造成使表达的海藻糖在胞内有活性，例如通过缺失或诱变使蛋白-分泌信号失活、改变蛋白靶向序列或酶活性位点的pH敏感性。
在本发明方法的一个特别合适的实施方案中，被引入的选择-核苷酸序列含有得自大肠杆菌(E.coli)的TreF基因(Horlacher R.等，J.Bacteriol.178(1)6250-6257，1996)。利用常规的分子生物学技术很容易将该基因分离出来并引入不同的细胞当中。
在本发明的另一个有利的实施方案中，选择-核苷酸序列含有得自鼠耳芥属的AtTRE1基因(Locus At4G24040，AGI no.2134960)。
本发明的方法优选地在步骤b)之前或过程中进一步包括使细胞群体与至少一种内源性胞外海藻糖酶的抑制剂进行接触的步骤。对可能存在的内源性胞外海藻糖酶的抑制防止了培养基中的海藻糖在胞外被部分或全部分解从而使得非转化的细胞也能够进一步生长发育。
用于本发明方法的合适抑制剂的实例是suidatestrin和一种修饰形式的拟-低聚糖抗生素有效霉素(Asano N.等，J.Antibiot.40(4)526-532，1987；Goddijn O.J.等，Plant Physiol.113(1)181-190，1997；Knuesel I.等，Comp.Biochem.Physiol.B.Biochem.Mol.Biol.120(4)639-646，1998)。有效霉素在本发明中必须经过修饰以使其不能再进入细胞。然而抑制内源性胞外海藻糖酶活性而且又不被摄取到细胞之中的其它化合物也能被用于本发明。
本发明的术语“细胞群体”被理解为指根据本发明一群个体细胞以及组织和器官或其部分的细胞；或整个生物体如植物体中的细胞，其中所述整个植物体或其部分可由遗传转化细胞组成。
本发明的方法优选地被用于选择基因修饰的植物细胞。例如鼠耳芥的幼苗不能在含有增加浓度的海藻糖的培养基上进一步生长发育。尽管种子会发芽，扩展根系的形成以及第一片叶子阶段的发育受到存在海藻糖的抑制。由于引入了选择-核苷酸序列，遗传转化植物能够表达海藻糖酶，特别是在细胞质中，因此进入细胞中的海藻糖可被分解成葡萄糖。所述葡萄糖接着可被用作植物的营养源。遗传转化植物因而继续生长发育，而非转化的植物的发育出现滞后。当本发明的方法被用于选择植物中的遗传转化细胞时，通过视觉能轻易地将转化植物识别出来。
因此本发明的方法提供了一种用于转化细胞、特别是用于遗传转化植物的简便而环保的选择系统。海藻糖是一种简单化合物，该化合物的生产成本较低并且还发现对于人类和动物是无毒性的。因此人类长期以来将大量的海藻糖应用于酵母发酵产品如面包和啤酒中，并且由于在肠道菌群中存在着产生海藻糖的微生物，所以人类和动物与海藻糖一直保持着接触。
根据本发明，任何编码具有海藻糖酶活性的蛋白的核苷酸序列可以被用作遗传转化细胞中的选择-核苷酸序列。例如可以利用外源性海藻糖酶基因，例如来源于细菌如大肠杆菌的外源性海藻糖酶基因，但是也可以使用内源性海藻糖酶基因，其中所述内源性海藻糖酶基因被修饰成能够编码修饰形式的内源性海藻糖酶，例如编码通常只具有胞外活性的海藻糖酶的胞内形式。利用这种内源性海藻糖酶基因的优势在于细胞当中没有引入额外的外来遗传物质。
可以将所需的转基因和选择-核苷酸序列利用常规的分子生物学技术引入用于转化的细胞当中。尽管不是必需的，但是在此可以将转基因和选择基因彼此连接起来以使得选择基因的存在总能表示转基因也存在。所述转基因和选择基因可任选地组成同一遗传构建体的一部分并且通过相同的载体被引入细胞。为了确保选择-核苷酸序列在转化细胞当中进行表达，这种遗传构建体还将进一步含有调节序列如组成型或调节型启动子。
本发明的方法可以以特别合适的方式被用来选择转基因植物。可适用于本发明方法的植物实例是例如玉米(玉蜀黍(Zea mays L.))、小麦(普通小麦(Triticum aestiym L.))、大麦(大麦(Hordeum vulgare L.))、稻子(稻(Oryza sativa L.))、大豆(菜豆(Phaseolus vulgaris L.))、甜菜(甜菜(Beta vulgaris L.))、菊苣(菊苣(Cichorum intybus L.))、油菜籽(欧洲油菜(Brassica napus L.))、甘蔗(甘蔗(Saccharum officinarum L.))、甜薯(甘薯(Diocorea esculenta L.))、树薯(木薯(Manihot esculenta L.))、马铃薯(马铃薯(Solanum tuberosum L.))、番茄(番茄(Lycopersiconesculentum L.))和禾本科植物(例如黑麦草属、早熟禾属和羊茅属)。
本发明进一步涉及利用本发明的方法选择出的转化细胞，特别是植物细胞，和由其再生的植物及其种子和子代。
参照所附的实施例和附图对本发明进行进一步的说明。
图1显示两个不同的鼠耳芥accession对海藻糖的敏感性。A在有100mM甘露醇存在的条件下培养的种子(对照)；B在有100mM海藻糖存在的条件下培养的种子。
图2显示用于胞质表达大肠杆菌海藻糖酶基因的不同构建体。
图3显示被转化的和未被转化的鼠耳芥Col.O幼苗在有100mM海藻糖存在条件下的培养物。
图4显示来源于大肠杆菌的TreF基因的核苷酸序列。
图5显示鼠耳芥AtTre1的mRNA序列。
图6显示来源于大豆的GMTre1的mRNA序列。
实施例实施例1鼠耳芥Col.O和La-er的幼苗对海藻糖的敏感性在Eppendorf管中利用Clough和Bent(1998)的气相方案对种子进行灭菌(Clough S.J.，Bent A.F.，Plant J.16(6)735-743，1998)。然后将已灭菌的种子重新悬浮在无菌水中并排列在0.8％w/v的琼脂培养基上，该培养基含半强度的Murashigue和Skoog培养基(MS培养基；Murashigue T，Skoog F，Physiol.Plant.15473-497，1977)、维生素和MES缓冲液(pH5.7)，同时补充添加了终浓度为100mM的甘露醇或海藻糖。
如图1所示，在有100mM甘露醇存在条件下培养的种子长成根系扩展的植物，而观察到在有100mM海藻糖存在条件下培养的植物生长发育程度较低。这里的图1A显示在有100mM甘露醇存在条件下培养的种子(对照)以及图1B显示在有100mM海藻糖存在条件下培养的种子。上一排的植物是鼠耳芥Landsberg erecta(La-er)，下一排的植物是鼠耳芥Colombia(Col.O)。
实施例2以大肠杆菌胞质海藻糖酶基因(TreF)作为选择基因的表达载体利用PCR-引物Tre1d(CTC TGC AGA TGC TCA ATC AGA AAATTC AAA ACC)和Tre1u(TGC ACT GCA GTT ATG GTT CGC CGTACA AAC CAA)由大肠杆菌的基因组DNA扩增TreF。然后将扩增的TreF克隆到pGEMT载体(Promega，US)中。TreF基因被进一步修饰以利用PCR引物TRe2d(AGC ACT GCA GCC ATG GCT TTG GTTACC CTC AAT CAG AAA ATT CAA AAC CCT)和Tremyc(TTA CAGATC TTC TTC AGA AAT AAG TTT TTG TTC TGG TTC GCC GTACAA ACC AAT TAA)在蛋白质的C-末端引入myc-标记物，并再次被克隆到pGEMT中以用于序列证实。得到的修饰TreF序列利用Pst1限制酶进行酶切并被引入A.pCAMBIA2201(CAMBIA，澳大利亚)。TreF片段的外端经钝化并将该片段连接到经Nco1和BstEII消化和钝化的pCAMBIA220质粒中。
B.pCambia 2380的Pst1位点；为了这一目的，将鼠耳芥的遍在蛋白10启动子作为钝化的Xhol-Spe 1片段加到pCambia 2380-TreF的钝化HindIII位点。
C.pACN质粒的Pst1位点(Zeneca，Caddick M.X.等，Nat.Biotechnol.16(2)177-180，1998)。然后将得到的构建体用HindIII进行消化，其中释放出片段，其上具有杂合AlcA/minimal 35S启动子，后面连接着TreF序列和Nos PolyA终止子。将该片段插入到SRN二元载体(Zeneca)的HindIII位点，从而获得了所示的构建体。
图2显示所获得的构建体。LB左T-DNA边界；RB右T-DNA边界；treF编码胞质海藻糖酶的大肠杆菌基因；NptII新霉素磷酸转移酶基因II；AlcR编码醇诱导系统的调节子的基因；CaMV35S花椰菜花叶病毒35S启动子；Ubi10鼠耳芥的遍在蛋白10基因的启动子；AlcA/35S与CaMV35S启动子融合的对乙醇诱导起反应的AlcA启动子元件。
实施例3转基因鼠耳芥幼苗的选择通过“floral dip”方案(Clough和Bent，上文)，采用带有实施例2C中所记载的二元质粒的农杆菌对鼠耳芥Col.O植物进行转化。将获得的干种子灭菌，然后播种到0.8％w/v的固体琼脂培养基上，该培养基中含有半强度的MS-盐(1/2 MS-盐)，维生素和MES缓冲液pH5.7，并且添加了终浓度为100mM的海藻糖。在4℃下将平皿培养3天(分层)，然后盖内滴加一滴乙醇并将平皿转移到22℃下。
图3显示12天后获得的幼苗。被转化的抗性幼苗是绿色的，具有很长的根和初生叶。而另一方面未被转化的敏感幼苗积聚花色素苷，没有长出初生叶而且根不长于3mm。在潮湿条件下，子叶变淡。
在约4000株播种植物中，鉴定出24株抗性幼苗。这表明转化频率与利用其它选择系统获得的转化频率相当。将12株幼苗转移到黑土中并且长成不能区别于非转化野生型植物的植物。
实施例4编码海藻糖酶的选择基因在鼠耳芥转基因系中的稳定表达在独立的鼠耳芥转基因系中利用连接到本发明的选择基因的常规卡那霉素选择基因对编码海藻糖酶的选择基因的表达稳定性进行测试。
将从实施例3中的10株自花授粉的T1植物获得的T2种子灭菌并播种在0.8％的固体琼脂培养基上，所述培养基中含有1/2MS-盐并添加了1％w/v的蔗糖和25mg/l的卡那霉素，在4℃下培养3天，转移到22℃下并以16小时光照/8小时黑暗这样的周期培养12天。发芽率为100％。
卡那霉素敏感幼苗发芽但具有发白的子叶，没有根发育而且没有初生叶期。卡那霉素抗性幼苗是绿色的，长出初生叶和根。
如表1所示，T1植物的转基因构建体总是传到T2代。表1显示在每个测试系中对卡那霉素具有抗性的幼苗数目。
鼠耳芥通过自体受精来产生种子并且是二倍体植物。当T1代植物在其基因组中具有至少一个稳定的转基因时，T2代将由至少3/4的抗性植物和最多1/4的敏感植物组成。当转基因未以稳定的方式被插入T1植物的基因组时，在T2代中将不会发现转基因。表1显示通过对T2代进行卡那霉素选择，在每个T1系中可发现具有转基因的T2幼苗。
表权利要求
1.用于从细胞群体中选择遗传转化细胞的方法，包括a)将至少一种目的核苷酸序列和至少一种选择-核苷酸序列引入细胞当中，以获得遗传转化细胞，其中所述选择-核苷酸序列含有编码参与海藻糖代谢的蛋白的区域；b)使具有被转化的和未被转化的细胞的群体与海藻糖和/或其衍生物接触；和c)基于转化细胞能够代谢海藻糖和/或衍生物的能力，从所述群体中选择出转化细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述选择-核苷酸序列含有编码具有海藻糖酶活性的胞内蛋白的区域。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述选择-核苷酸序列含有编码在胞内有活性的海藻糖酶的经修饰的内源性海藻糖酶基因。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述选择-核苷酸序列含有源自大肠杆菌的TreF基因。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述选择-核苷酸序列含有源自鼠耳芥的AtTRE1基因。
6.如权利要求1至5中的任一项所述的方法，其特征在于所述方法还进一步包括在步骤b)之前或过程中使所述细胞群体与至少一种内源性胞外海藻糖酶的抑制剂接触。
7.如权利要求1至6中的任一项所述的方法，其特征在于所述细胞是植物细胞。
8.利用权利要求1至7中的任一项所述的方法选择出的遗传转化细胞，其中所述细胞的基因组含有至少一个选择-核苷酸序列，该序列包含编码参与海藻糖代谢的蛋白的区域。
9.如权利要求8所述的细胞，其特征在于所述选择-核苷酸序列含有编码具有海藻糖酶活性的胞内蛋白的区域。
10.如权利要求8或9所述的细胞，其特征在于所述选择-核苷酸序列含有编码在胞内有活性的海藻糖酶的经修饰的内源性海藻糖酶基因。
11.如权利要求8或9所述的细胞，其特征在于所述选择-核苷酸序列含有源自大肠杆菌的TreF基因。
12.如权利要求8或9所述的细胞，其特征在于所述选择-核苷酸序列含有源自鼠耳芥的AtTRE1基因。
13.如权利要求8至12中的任一项所述的细胞，其特征在于其为植物细胞。
14.由权利要求13的转化植物细胞再生的植物。
15.如权利要求14所述的植物的种子。
16.如权利要求14所述的植物的子代。
17.海藻糖和/或其衍生物用于从被转化和未转化细胞的群体中选择转化细胞的用途，其中转化细胞的基因组含有至少一个选择-核苷酸序列，该选择-核苷酸序列含有编码参与海藻糖代谢的蛋白的区域。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于所述选择-核苷酸序列含有编码具有海藻糖酶活性的胞内蛋白的区域。
19.如权利要求17或18所述的用途，其特征在于所述选择-核苷酸序列含有编码在胞内有活性的海藻糖酶的经修饰的内源性海藻糖酶基因。
20.如权利要求17或18所述的用途，其特征在于所述选择-核苷酸序列含有源自大肠杆菌的TreF基因。
21.如权利要求17或18所述的用途，其特征在于所述选择-核苷酸序列含有源自鼠耳芥的AtTRE1基因。
22.如权利要求17至21中的任一项所述的用途，其特征在于所述细胞为植物细胞。
全文摘要
一种用于从由被转化和未被转化的细胞组成的群体中选择转化细胞的环保且无毒性的方法。该方法包括下列步骤a)将至少一种目的核苷酸序列和至少一种选择－核苷酸序列引入细胞当中，以获得遗传转化细胞，其中所述选择－核苷酸序列含有编码参与海藻糖代谢的蛋白的区域；b)使具有被转化的和未被转化的细胞的群体与海藻糖和/或其衍生物接触；和c)基于转化细胞能够代谢海藻糖和/或衍生物的能力，从所述群体中选择出转化细胞。
文档编号C12N15/09GK1622999SQ02823127
公开日2005年6月1日 申请日期2002年11月6日 优先权日2001年11月6日
发明者J·C·M·斯米肯斯, H·施卢普曼 申请人:技术科学基金会