专利名称：用于克隆技术的细胞核物质获取法的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及转移细胞遗传物质的方法，更具体地涉及一种获取细胞核物质的方法。
背景技术：
细胞核物质作为遗传物质决定着生物的遗传特性，而细胞核是遗传物质的主要聚集场所。原核期胚胎具有完整核膜包被的清晰原核，可以在不需要任何辅助设备和试剂的情况下用倒置显微镜准确的观察，这为精确的获取并转移遗传物质提供了必要的前提条件。作为治疗由于细胞质遗传(主要是线粒体遗传物质缺陷)导致无法获得健康后代的潜在手段，原核转移(pronuclear transfer)正受到越来越大的重视。目前所用的原核获取方式主要为活检针吸取胞质法，即用活检针吸取原核附近的胞质，最终使得原核连带部分细胞膜及细胞质形成一个新的核质体。但该方法存在一些以下缺点1、将新的核质体转移至新的受体胞质体时必须要借助于电融合或其他融合方式；2、原核和容易在吸取过程中受到胞质的挤压而破裂，这在将来的临床应用中是不能接受的；3、不可避免的带进部分供体细胞质，如这部分供体缺陷细胞质在新组成的胚胎中期主导作用，那么将失去原核转移的
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发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种方便、快捷以及精确获取细胞核物质的方法。本发明所述的细胞核获取的方法，包含如下步骤(1)用频率为1. 0-1. 8ms的激光在细胞卵周隙较大的透明带部分打直径12_30 μ m 的孔；(2)用外径100 120 μ m、内径15 30 μ m的持卵针固定住细胞，使透明带开口端位于与持卵针相对的位置，以方便进行后续操作；(3)用事先吸一定量液体、内径8-50 μ m的注射针从透明带开口处扎入胞浆中，并避免直接接触到核物质，所述液体量可以是0. 05μ 1 1μ 1 ；(4)迅速增加注射针中的正压使针中的液体向外快速流动，以冲断核物质与胞浆之间的连接，使核物质周围无任何胞质部分，并利用整个细胞内正压的提高来使得核物质完整的从透明带开口处被压离细胞；(5)用注射针收集分离的核物质。其中，所述细胞可以是受精卵细胞或卵母细胞。其中，步骤(3) (4)中所述的液体可以用各种细胞培养液、操作液或其他与细胞等渗的液体，如mHTF、GMOPS, G-IVF或Gl. 5培养液等等，优选地所述液体中含有5% HSA。其中，步骤(3) (5)中所述的核物质可为原核、GV期卵母细胞的GV泡或其它由完整膜包被的胞内物质。
其中，步骤(3) (5)所述的注射针的内径优选ΙΟμπι。其中，步骤⑵所述的持卵针开口可为斜口或平口，优选经过拔尖的斜口。利用本发明所述的方法进行细胞核移植同当前的显微操作核移植方法相比，具有明显的优越性(1)不需要特殊的设备，只需要一般的倒置显微镜及显微操纵仪就可以进行，操作简便，便于广泛推广使用；(2)可以将核物质完整的与胞浆分离；(3)核物质转移过程中不会由于挤压而使核物质破裂；(4)所获得的核物质不带有任何细胞质与细胞膜；(5)在核物质的再次转移至受体胞质的过程中不需要经过电融合步骤。
图1 用激光在胚胎或卵母细胞卵周隙较大的透明带部分打孔，并使透明带开口端位于与持卵针相对的位置；其中，1为激光所打的孔。图2 注射针从透明带开口处扎入胞浆中，并避免直接接触到核物质；其中，2是注射针，3是核物质。图3 核物质完整的被压离卵母细胞；其中，4是核物质。图4 用注射针收集分离的核物质；其中，5是核物质。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明实施例1(1)用激光在原核期受精卵周隙较大的透明带部分打直径20 μ m的孔，激光频率为 1. Oms ；(2)如图1所示，用外径120μπι，内径25μπι的持卵针固定住受精卵，使透明带开口端位于与持卵针相对的位置，其中持卵针开口为斜口 ；(3)如图2所示，用事先吸有0. 5 μ 1含5% HSA的GMPOS体外操作液、内径10 μ m 的注射针从透明带开口处扎入胞浆中，并避免直接接触到原核；(4)如图3所示，迅速增加注射针中的正压使针中的液体向外快速流动，使注射针的液体快速的冲断原核与胞浆之间的连接，并利用整个细胞内正压的提高来使得原核完整的被压离受精卵；(5)如图4所示，用注射针收集分离的原核。实施例2(1)用激光在GV期卵母细胞卵周隙较大的透明带部分打直径30 μ m的孔，激光频率为1. 8ms ；(2)用外径120 μ m、内径25 μ m的持卵针固定住卵母细胞，使透明带开口端位于与持卵针相对的位置，其中持卵针开口为平口 ；(3)用事先吸有1 μ 1含5% HSA的Gl. 5培养液、内径40 μ m的注射针从透明带开口处扎入胞浆中，并避免直接接触到GV泡；
(4)迅速增加注射针中的正压使针中的液体向外快速流动，使注射针的液体快速的冲断GV泡与胞浆之间的连接，并利用整个细胞内正压的提高来使得GV泡完整的被压离卵母细胞；(5)用注射针收集分离的GV泡。
权利要求
1.一种细胞核物质的获取方法，包括以下步骤(1)用激光在细胞卵周隙较大的透明带部分打直径12-30μ m的孔；(2)用外径100 120μ m、内径15 30 μ m的持卵针固定住细胞，使透明带开口端位于与持卵针相对的位置；(3)用吸有0.05μ 1 1μ 1液体、内径8-50μπι的注射针从透明带开口处扎入胞浆中， 并避免直接接触到核物质；(4)迅速增加注射针中的正压使针中的液体向外快速流动，以冲断核物质与胞浆之间的连接，使核物质周围无任何胞质部分，并利用整个细胞内正压的提高来使得核物质完整的从透明带开口处被压离细胞；(5)用注射针收集分离的核物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是受精卵细胞或卵母细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核物质是原核、GV期卵母细胞的GV 泡或其它由完整膜包被的胞内物质。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C3) (4)中所述的液体是各种细胞培养液、操作液或其它与细胞等渗的液体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述液体为mHTF、GMOPS,G-IVF或Gl. 5 培养液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述液体中含有5%HSA。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C3) ( 所述的注射针的内径为 10 μ m。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的持卵针开口为斜口或平□。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述持卵针开口为经过拔尖的斜口。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，激光频率为1.0 1. 8ms。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种获取细胞核物质的方法，包括步骤(1)用激光在细胞卵周隙较大的透明带部分打孔；(2)用持卵针固定住细胞，使透明带开口端位于与持卵针相对的位置；(3)用吸有液体的注射针从透明带开口处扎入胞浆中，并避免直接接触到核物质；(4)迅速增加注射针中的正压使针中的液体向外快速流动，以冲断核物质与胞浆之间的连接，使核物质周围无任何胞质部分，并利用整个细胞内正压的提高来使得核物质完整的从透明带开口处被压离细胞；(5)用注射针收集分离的核物质。本发明的获取核物质的方法不需要特殊仪器，可以方便简单地分离核物质，避免核物质破裂，获得的核物质便于进行细胞融合实验。
文档编号C12N15/873GK102399821SQ20101028147
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月13日 优先权日2010年9月13日
发明者吴克良, 陈子江, 马金龙 申请人:山东大学, 山东山大附属生殖医院有限公司